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표면에 부착된 IgG 옵소화 적혈구 또는 적혈구가 들어 있는 폴리머 코팅 유리 바닥 접시를 가져 가십시오.
접시를 전반사 형광 현미경 스테이지에 놓고 생리학적 온도로 유지합니다.
중합된 액틴에 결합하는 형광 표지된 세포질 펩타이드를 포함하는 대식세포를 추가하여 세포골격 시각화를 용이하게 합니다.
이미징 중에 레이저 빔을 임계 각도보다 높은 각도로 향하게 하여 접촉점에서 내부 반사 및 소멸파 생성을 유발합니다.
소천파는 유리-샘플 인터페이스에서 형광단을 선택적으로 비추어 식균 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.
대식세포 Fc 수용체는 IgG-옵소화된 적혈구에 결합하여 접촉 영역 주위에 수용체 클러스터링을 일으킵니다.
클러스터링은 세포내 신호 전달 경로와 GTPase 활성화를 유발하여 액틴 중합 및 다이나민 모집을 유도하여 유사족류를 형성합니다.
pseudopod는 적혈구 주위로 확장되어 식세포 컵을 형성합니다.
결국 유사 각류 팁이 융합됩니다. 축적된 다이나민은 세포막에서 식체 분리를 매개하여 옵소화된 적혈구를 내재화합니다.
SRBC의 비공유 고정을 위해 IgG 옵소화 세포 2밀리리터를 폴리-라이신 코팅 접시에 붓고 스윙 로터 원심분리기에서 샘플을 원심분리합니다. 상청액을 버리고 PBS 2밀리리터와 BSA 10%로 입자를 한 번 세척합니다.
그런 다음 입자를 2밀리리터의 신선한 PBS와 10% BSA와 함께 실온에서 30분 동안 배양한 다음 2밀리리터의 PBS로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 PBS를 섭씨 37도의 무혈청 현미경 배지 2밀리리터로 교체합니다.
SRBC 코딩 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다. 그런 다음 배양 접시 바닥에서 형질감염된 관심 세포를 긁어내고 세포를 몇 번 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 형질감염된 세포를 SRBC 코팅 접시에 추가합니다.
라이브 수집 소프트웨어를 시작합니다. 형광 태그가 지정된 단백질을 발현하는 세포를 찾아 관심 세포가 필드 중앙에 오도록 접시의 위치를 조정합니다. 하나의 여기 파장에서 0.01도 증분으로 0도에서 5도까지의 다양한 각도에서 500개의 이미지를 획득합니다.
입사광이 유리-매체 계면에서 완전히 반사되고 소멸파를 생성하는 임계각을 결정하려면 적절한 이미징 소프트웨어에서 이미지 시퀀스를 엽니다. 균일한 형광이 있는 세포의 관심 영역을 선택합니다.
그런 다음 이미지 탭에서 스택을 선택하고 Z축 프로파일을 플롯합니다. Z축 프로파일을 플롯하려면 X축의 각도 함수를 사용하여 관심 영역에서 측정된 평균 형광 강도를 표시합니다. 임계 각도보다 우수한 x축의 모든 각도 값을 현미경 세션 중에 사용하여 TIRF 신호를 얻을 수 있습니다.
