미세아교세포에 의한 타우 단백질 흡수를 평가하기 위한 세포 기반 분석

뇌의 식세포 세포인 부착된 쥐 미세아교세포가 포함된 평평한 바닥 다중 웰 플레이트로 시작합니다.

면역복합체를 함유한 무혈청 배지를 도입합니다. 이러한 복합체는 특정 신경퇴행성 질환 중에 형성되는 인산화된 타우 단백질 응집체에 부착된 항체로 구성됩니다.

타우 응집체는 pH에 민감한 녹색 형광 염료로 표지됩니다.

배양하는 동안 이러한 면역복합체는 미세아교세포의 Fc 수용체와 상호 작용하여 삼키기를 촉진합니다.

이 면역복합체 함유 엔도좀은 리소좀과 융합하여 엔도리소좀을 형성합니다. 엔도리소좀의 산성 환경은 염료 분자에 형광을 발하게 합니다.

내재화되지 않은 면역복합체를 제거하기 위해 세척합니다.

트립신-EDTA 용액으로 처리하여 세포를 분리합니다.

세포 현탁액을 얼음 위에 위치한 U-바닥 플레이트로 옮겨 엔도리소좀을 안정화합니다. 세포를 펠릿화하고 상청액을 버립니다.

세포를 세척하고 FACS 완충액으로 재현탁합니다.

FACS를 사용하여 단일 살아있는 세포를 식별하고 녹색 형광 강도를 정량화하여 미세아교세포에 의한 타우 흡수를 평가합니다.

실험 첫날에 BV-2 세포를 배양한 플라스크에서 먼저 1x PBS로 세척하여 BV-2 세포를 준비합니다. 그런 다음 플라스크에서 분리될 때까지 섭씨 37도에서 0.05% 트립신 EDTA 및 5%_CO2와 함께 배양합니다. 세포를 배양 배지에 3-5회 피펫팅하여 재현

세포를 계수하고 밀리리터당 200마이크로그램의 헤파린을 함유한 배양 배지에서 밀리리터당 최종 농도가 100,000개의 세포인 세포 현탁액을 준비합니다. 96웰 조직 배양 평평한 바닥 플레이트에 웰당 250마이크로리터의 이 세포 현탁액을 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% CO₂와 함께 밤새 배양합니다.

이전에 준비된 pH 염료-타우 응집체를 얼음 위에서 해동한 후, 무혈청 배지 조건당 65마이크로리터로 희석하여 500나노몰 용액을 만듭니다. 65마이크로리터의 무혈청 배지에 항체를 희석하여 원하는 농도의 두 배를 달성합니다. pH 염료-타우 응집체와 항체를 96웰 U-바닥 플레이트에 혼합합니다. 이 희석판을 밀봉하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

다음날, BV-2 세포가 있는 96-웰 플레이트에서 배지를 제거합니다. 각 웰의 세포를 실온 1x PBS 100마이크로리터로 세척합니다. BV-2 세포 플레이트에서 PBS를 제거합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 희석 플레이트에서 96웰 BV-2 세포 플레이트의 각 웰로 125마이크로리터의 면역 복합체를 옮기고 섭씨 37도에서 5% CO₂와 함께 2시간 동안 배양합니다.

배양 후, 세포에서 면역복합체를 제거하고 각 웰의 세포를 실온 1x PBS 100마이크로리터로 세척합니다. 1x PBS를 제거한 후 50마이크로리터의 0.25% 트립신-EDTA를 첨가하고 5%_CO2와 함께 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 세포를 분리하기 위해 위아래로 피펫팅하여 웰을 재현탁합니다.

세포를 96웰 U-바닥 플레이트로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 g으로 원심분리합니다. 접시를 얼음 위에 놓고 배지를 제거합니다. 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 1x PBS를 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 400g에서 다시 원심분리합니다. 플레이트를 얼음 위에 놓고 이전에 첨가한 1x PBS를 제거하고 웰당 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하여 다시 세척합니다. 동일한 조건에서 다시 원심분리합니다.

플레이트를 얼음 위에 놓고 이전에 첨가된 PBS를 제거하고 웰당 150마이크로리터 FACS 완충액을 추가하여 세포를 세척합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 400g 에서 다시 원심분리합니다. 플레이트를 얼음 위에 놓고 이전에 첨가된 FACS 완충액을 제거한 다음 웰당 200마이크로리터 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 즉시 FACS로 분석을 진행하여 라이브 셀 게이트에서 20,000개의 이벤트를 획득합니다.