면역조직화학을 이용한 뇌 조직에서 비정상적인 프리온 단백질 검출

잘못 접힌 프리온 단백질 응집체를 나타내는 고정된 포유류 뇌 절편이 있는 슬라이드를 찍습니다.

프리온 응집체의 감염성을 줄이기 위해 절편을 포름산으로 처리합니다.

수화 압력 챔버 내부에서 산성 완충액으로 처리합니다. 높은 열과 산성 pH는 고정 유도 단백질 가교를 끊어 항원 에피토프를 제거합니다.

과산화수소에 담그면 내인성 과산화효소가 비활성화되어 원치 않는 배경 염색을 방지할 수 있습니다.

슬라이드를 커버 플레이트에 놓고 완충액을 추가하여 조직 수화를 유지합니다.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 도입합니다.

프리온 응집체에 특이적인 1차 항체를 추가합니다.

결합되지 않은 항체 분자를 제거합니다. 1차 항체에 결합하는 비오티닐화된 2차 항체를 도입합니다.

결합되지 않은 항체 분자를 제거합니다. 2차 항체의 비오틴에 결합하는 아비딘과 복합된 비오티닐화 과산화효소를 추가합니다.

과산화효소가 착색 제품으로 산화되는 발색 기질을 추가합니다.

현미경을 사용하여 염색된 응집체를 관찰합니다.

조직 절편을 실온에서 98% 포름산에 30분 동안 조심스럽게 담급니다. 절편을 수돗물로 5분 동안 헹구고 증류수로 두 번 헹굽니다. 500밀리리터의 증류수를 채운 압력 챔버에 스테인리스 스틸 염색 용기를 사용하여 10밀리몰 구연산염 완충액을 섭씨 98도에서 20분 동안 전처리합니다.

품질 관리를 위해 바구니에 접착식 오토클레이브 표시 테이프 한 부분을 놓아 온도와 압력을 모니터링합니다. 알람이 장비가 프로그램 시간과 온도에 도달했음을 나타내면 슬라이드가 있는 바구니를 담그십시오. 그런 다음 압력 챔버에서 프로그램을 시작하여 지점 2를 설정하고 이 프로그램의 초기 및 최종 압력을 기록합니다.

내인성 과산화효소의 불활성화를 위해 샘플 섹션이 들어 있는 슬라이드 바스켓을 메탄올에 3% 과산화수소 수조에 30분 동안 담급니다. 흐르는 물에 5분 동안 섹션을 헹굽니다. 배수 후 절편을 트리스 완충 식염수에 추가로 5분 동안 담급니다. 면역 검출을 위해 각 슬라이드를 Tris-완충 식염수로 미리 적신 시중에서 판매되는 커버 플레이트 홀더 위에 놓습니다.

티슈 쪽이 홀더를 향하고 슬라이드 가장자리가 홀더의 두 하단 지점과 일치하도록 하여 기포가 생기지 않도록 합니다. 엄지와 검지 사이에 슬라이드 홀더 어셈블리를 잡습니다. 한 손가락은 샘플 슬라이드 위에 놓고 다른 손가락은 홀더 하단에 놓습니다. 그런 다음 어셈블리를 시스템 갤러리에 배치합니다.

세트가 잘 조립되었는지 확인하려면 샘플 슬라이드와 홀더 사이의 웰을 넘치지 않고 트리스 완충 식염수로 채우십시오. 이 시점부터 홀더와 슬라이드 사이에 약 80마이크로리터의 트리스 완충 식염수가 유지되어야 하는지 확인합니다. 섹션이 건조되지 않도록 하십시오.

Tris-buffered 식염수에서 2차 항체 숙주와 동일한 종의 20% 정상 혈청으로 슬라이드 샘플을 30분 동안 사전 배양하여 1차 항체로 처리하기 전에 배경 염색을 줄입니다. 절편을 세척하지 않고 200마이크로리터의 1차 항체 용액을 슬라이드 홀더 세트의 각 웰에 직접 도포하고 실온에서 60분 동안 배양합니다.

절편을 세척하려면 웰을 트리스 완충 식염수로 채우고 5분 동안 기다립니다. 세탁을 두 번 반복합니다. 다음으로, 비오티닐화된 2차 항체를 10% 말 혈청과 함께 트리스 완충 식염수에서 1 내지 200 농도로 희석합니다.

처리할 절편 수에 따라 필요한 부피를 수리하십시오. 슬라이드 홀더 세트의 각 웰에 200마이크로리터의 2차 항체 용액을 도포합니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 트리스 완충 식염수 세척을 반복합니다.

아비딘-비오틴 복합체 과산화효소와 함께 배양하려면 사용 30분 전에 시약을 준비하십시오. 그리고 슬라이드 플레이트 홀더의 각 웰에 200마이크로리터의 용액을 도포합니다. 완료되면 플레이트 홀더 세트를 실온에서 30분 동안 배양합니다.