포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

안녕하세요, 제 이름은 Rob Edwards입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 레이저 캡처 현미경 시설 책임자입니다. 이곳에 구비된 레이저 캡처 현미경의 사용법에 대해 설명해 드리겠습니다.

저희가 사용하는 기기는 약 3년 전에 구입한 Leica A-S-L-M-D입니다. 레이저 캡처 시스템에는 두 가지 서로 다른 유형이 있습니다. 그중 하나는 스폿 용접기와 비슷하며, 유리 슬라이드 위에 조직 조각을 놓고 그 위에 플라스틱 막을 덮어 조직을 감싸는 방식입니다.

그 후 레이저 광원을 사용하여 막을 녹이면, 결과적으로 조직이 막에 점용접되어 고정되며, 이후 해당 막을 제거함으로써 포집된 조직을 함께 떼어낼 수 있습니다. 이제 LCM 시스템을 시작하기 위해 여러 장비를 순서대로 전원을 켭니다. 먼저 여기 있는 ASLMD 제어 박스의 전원을 켭니다.

그런 다음 컴퓨터를 켭니다. 캡처할 세포를 식별하기 위해 형광 광학 장치가 필요한 시료가 있는 경우, 형광 조명을 위해 수은 램프를 켭니다. 본 시연에서는 이를 사용하지 않습니다.

시료의 전후 고화질 이미지를 캡처하려면, 로직 박스와 컴퓨터의 전원을 켠 후 여기에서 스팟 카메라를 별도로 켤 수 있습니다. 다음으로 여기의 레이저 전원 제어 유닛을 켜는데, 이는 실제로 기기 하단 뒷면에 있는 키로 켭니다. 마지막으로 컴퓨터 모니터를 켭니다. 화면에는 익숙해져야 할 여러 제어 항목이 있습니다.

이 프로그램들을 매우 자주 사용하게 될 것입니다. 전형적인 Microsoft Windows 기반 프로그램이므로 논의해야 할 메뉴가 여러 개 있습니다. 하지만 먼저 여기의 데스크톱 화면에 대해 말씀드리겠습니다.

현미경이 실제로 보고 있는 화면을 보여주는 라이브 창이 있습니다. 여기 메뉴 바 상단에서 라이브 이미지 버튼을 확인하실 수 있으며, 토글 가능한 프리즈(freeze) 버튼도 있습니다. 이 버튼을 사용한 후 파일 메뉴를 통해 조직의 특정 부분에 대한 정지 영상을 캡처하여, 예를 들어 캡처 전과 후의 상태를 기록함으로써 분리한 조직을 문서화할 수 있습니다. 현미경은 헤마틸린 대조 염색 조직 또는 형광 염색 조직을 캡처하는지에 따라 명시야(brightfield) 또는 형광 모드로 실행할 수 있습니다.

다음 두 버튼에는 현미경 스테이지 평면에 초점을 맞추는 검체 모드와, 유리 슬라이드를 이동시켜 수집 튜브 상단에 포집된 조직을 시각화할 수 있게 하는 수집 모드가 포함되어 있습니다. 이는 품질 관리용 설정입니다. 메뉴 바의 다음 항목에는 캡처하려는 조직이나 세포 부위를 식별하는 데 사용하는 여러 그리기 도구가 있습니다.

그다음 화면 오른쪽에는 도형 그리기 옵션, 절단 옵션 및 절단 제어 버튼을 포함한 추가 그리기 및 캡처 도구들이 있습니다. 또한 하단 제어 패널에는 현미경 스테이지 아래에 위치하여 조직이 캡처되는 einor 튜브를 유지하는 수집 장치가 있습니다. A, B, C, D로 표시된 이 네 개의 버튼을 통해 캡처 중인 시료 바로 아래로 이동시킬 튜브를 제어합니다.

이것은 레이저 캡처 미세절제술(laser capture microdissection)을 위해 처리된 전형적인 동결 절편 조직의 예시입니다. 이것들은 펜 포일 슬라이드에 캡처된 마우스 배아 머리의 관상면 절편들입니다. 이들은 8 µm 두께의 동결 절편으로, 건조 후 헤마틴(hematin)으로 대조 염색되었으며 사용 전까지 -80 °C에서 보관되었습니다.

현미경에 이 슬라이드들을 장착하기 위해, 현미경에 제공되는 전용 홀더를 사용합니다. 조직은 스테이지 평면 아래에 위치한 에펜도르프 튜브(eppendorf tube) 속으로 포집된다는 점을 기억하십시오. 따라서 조직은 슬라이드의 이쪽에 위치하며, 다음과 같이 조직이 아래로 향하도록 슬라이드 홀더에 장착하게 됩니다.

슬라이드는 해당 위치에 삽입되어 스프링 압력으로 고정됩니다. 그리고 이 구멍이 온전하게 유지됩니다. 슬라이드 홀더를 이 두 가이드 사이의 현미경 스테이지 위에 배치합니다.

스테이지 뒷부분에 표본을 고정하는 클립 아래로 들어맞는 작은 디텐트(detent)가 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이것을 삽입하면 딸깍하는 느낌이 납니다. 이제 조직을 실제로 포집하게 될 에이너(einor) 튜브를 설정하겠습니다.

0.2 또는 0.5 mL 에پن도르프 튜브를 선택하여 사용할 수 있으며, 이 튜브들은 작은 홀더에 끼워진 후 스테이지 아래의 전용 슬롯에 장착되는 트레이에 고정됩니다. 조직은 에펜도르프 튜브 캡의 상단부에 포집됩니다. 여기서는 설명을 위해 0.5 mL 튜브를 사용하고 있습니다.

캡을 이런 식으로 밀어 넣어 아래로 통과시키면, 캡의 가장자리가 돌기들에 의해 고정되고 캡이 아래쪽으로 찰칵 소리를 내며 고정됩니다. 그런 다음 이 캡 전체를 홀더에 넣습니다. 이제 핵산을 캡처할 때, 특히 RNA 분리를 위해 캡 안에 triol 용액 수백 µL를 직접 넣을 수 있습니다. triol 시약에는 페놀 및 기타 부식성 화학 물질이 포함되어 있으므로, 이를 기기 내부로 쏟지 않는 것이 중요합니다.

앞서 말씀드린 것과 같이 이것이 현미경 컨트롤러이며, 이 장비의 대물렌즈와 조명 및 초점 조절은 모두 전동식으로 작동합니다. 따라서 초점 조절 노브는 여기 상단에 있습니다. 스테이지의 Y축 이동 제어는 이 노브를 통해 이루어집니다.

X 번역 제어 장치가 여기 있습니다. 왼쪽 하단에는 조리개 제어 장치가 있으며, 이를 통해 조명을 조절할 수 있습니다. 또한 현미경은 각 배율에서 설정된 조명 수준을 기억합니다. 따라서 대물렌즈를 변경하면 조명이 자동으로 조정됩니다.

마지막으로 컨트롤러의 오른쪽에 있는 것이 대물렌즈 터렛 컨트롤이며, 이를 통해 대물렌즈 간의 전환이 가능합니다. 이 장비에는 4x, 10x, 20x, 40x, 63x의 다섯 가지 대물렌즈가 장착되어 있습니다. 실제로 조직을 캡처하기 위한 첫 번째 단계는 화면에 보이는 모습이 실제로 캡처될 이미지와 일치하도록 현미경을 정렬하는 것입니다.

레이저 메뉴 옵션으로 이동하여 보정(calibrate)을 선택하고, 계속(continue)을 누릅니다. 현재 4배율 설정 상태이며, 여기에는 비교적 넓은 면적의 멤브레인이 보입니다. 조직은 없다는 점에 유의하십시오.

슬라이드의 한쪽 모서리에서 정렬을 수행합니다. 레이저가 화면의 오른쪽 상단 모서리에 십자 표시(crosshatch)를 생성했으며, 마우스를 사용하여 이를 화면 중앙에 맞춘 뒤 클릭하면 컴퓨터가 또 다른 십자 표시를 생성합니다. 이에 맞춰 정렬한 후 클릭하면 세 번째 십자 표시가 생성되며, 그 위치에서 최종 정렬을 수행합니다.

현미경의 4배 대물렌즈 보정이 완료되었으며, 이제 정렬이 끝나 조직을 실제로 캡처할 준비가 되었습니다. 정렬 과정에서 절삭되는 십자 해치 무늬가 다소 두껍다는 점을 눈치채셨을 것입니다. 이는 레이저 제어 출력이 매우 높게 설정되었기 때문입니다.

아마 그 정도의 절단력까지는 필요 없을 것입니다. 따라서 선을 절단하여 레이저 출력을 어떻게 조정하는지 보여드리겠습니다. 화면에 자유 곡선으로 대각선을 그리고 캡을 선택한 다음 'start cut'을 누르면, 컴퓨터가 제가 정의한 선을 따라 절단하게 됩니다.

선의 너비가 얼마나 넓은지 확인할 수 있습니다. 레이저 출력을 낮춰야 하므로, 그렇게 조절하겠습니다.

레이저 메뉴에서 제어(control) 탭으로 이동하면 강도가 최대로 설정되어 있음을 알 수 있습니다. 레이저 강도를 약 30 정도로 낮춘 후 설정을 적용하겠습니다. 이제 새로운 선을 그려 절개하면, 조직이나 막의 연소 폭이 상당히 줄어든 것을 확인할 수 있습니다.

따라서 일반적인 원칙으로서, 기화되는 조직의 양을 최소화하기 위해 레이저 제어 출력은 가능한 한 가장 낮은 설정으로 맞추어야 합니다. 이제 이 미러링 아이를 사용하여 실제 조직을 캡처하는 과정을 보여드리겠습니다. 현재 4x 대물렌즈를 사용 중이며, 비교적 넓은 범위의 조직을 캡처해 보겠습니다.

이 안구의 중심에서 수정체 전체를 분리하겠습니다. 이를 위해 자유형태로 절개하겠습니다. 화면 상단의 그리기 컨트롤을 사용하여 절단하겠습니다.

캡처할 검체 주변에 선을 그리겠습니다. 현재 매우 낮은 배율에서 이 작업을 수행하고 있습니다. 더 정확한 절단이나 더 작은 조직 영역에 관심이 있는 경우에는 당연히 더 높은 배율에서 캡처할 수 있습니다.

절단할 영역을 선택한 후 도형 그리기 메뉴로 이동하며, 저는 보통 '닫힌 선(closed lines)' 옵션을 켜둡니다. '닫힌 선' 기능은 무언가 주변에 불규칙한 모양을 그렸을 때 캡처하려는 대상이 완전히 둘러싸이지 않으면, 모양의 열린 끝부분을 직선으로 연결해 주는 기능입니다. 이렇게 절단 영역이 지정되면 절단 프로세스를 시작하며, 제어 박스가 해당 영역을 통해 레이저를 집중시켜 거의 완전히 절단하는 것을 확인할 수 있습니다.

대형 조직편을 캡처할 때 조직이 완전히 분리되지 않고 일부가 매달려 있는 현상이 자주 발생합니다. 이 경우 가장 먼저 시도해야 할 방법은 해당 부위를 다시 절단하는 것이며, 그러면 레이저가 조직의 외곽선을 따라 다시 작동하게 됩니다.

때로는 대안적으로 조직이 매달려 있는 부분에 작은 공간을 그려 그 부분을 절단하면 조직이 떨어져 나옵니다. 이제 이 조직 부위를 채취했습니다. 앞서 언급했듯이, 컬렉터 모드로 전환하여 해당 조직 조각이 실제로 컬렉터나 이노(einor) 튜브 캡 안에 있는지 확인할 수 있습니다.

이제 여기 있는 콜렉터 제어 버튼을 누르면 현미경의 뷰가 바뀌는 것을 볼 수 있습니다. 현재 우리는 내부 관의 내면을 보고 있으며, 화면 오른쪽 하단에 포집된 조직 조각이 보입니다. 실제로 초점을 맞추면 개별 세포들을 확인할 수 있습니다. 이로써 우리가 선택한 조직이 실제로 포집되었음을 확인하였습니다.

현재, 포집되는 조직들이 기본적으로 떨어지는 잎사귀와 같기 때문에 포집 과정이 100%의 효율로 일어나지는 않습니다. 포집된 조직 파편의 아주 적은 일부는 에펜도르프 튜브 뚜껑 안으로 떨어지지 않을 수 있지만, 원하는 조직의 포집을 완료하고 나면 손실률은 매우 낮습니다. 다음 단계는 당연히 포집된 조직이 담긴 에펜도르프 튜브를 기기에서 분리하여 뚜껑을 단단히 닫는 것입니다.

이를 위해, 이와 같이 홀더를 아주 부드럽게 직선으로 당겨 줍니다. 이때 튜브 캡이 수직 상태를 유지해야 한다는 점에 유의하며, 트레이에서 홀더를 제거한 다음 튜브를 아주 조심스럽게 당겨 뺍니다. 이와 같이 슬라이드 방식으로 홀더에서 꺼낸 후, 뚜껑이 아닌 내부 용기를 이와 같이 이동시킵니다.

이제 뚜껑에 triol 한 방울을 이미 떨어뜨렸다면, 조직의 가용화 과정이 이미 시작되었으므로 실험실로 돌아가 RNA 분리를 완료하면 됩니다. Amon과 같이 저희가 선호하는 제조사를 포함하여 마이크로 스케일 RNA 분리 키트를 생산하는 여러 업체가 있습니다. 이것으로 모든 과정이 완료되었습니다.

지금까지 UC Irvine의 레이저 캡처 현미경 시설을 함께 살펴보았습니다. 본 영상에서는 조직에서 RNA를 분리하기 위한 준비 단계로, 펜 포일(pen foil)이 코팅된 슬라이드에서 동결 절편 조직을 캡처하는 방법을 시연하였습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 레이저 캡처 미세절제술(laser capture microdissection) 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.