Name: Microtiter 플레이트 형식의 맛을 희석하여 첫 번째와 두 번째 라인 의약품 Mycobacterium 결핵의 복합 항균 자화율 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 배우세요 마이크로타이터 플레이트를 이용한 Mycobacterium tuberculosis의 12종 항생제 내성 동시 검사법입니다. MIC 값 측정으로 적절한 결핵 치료제 선택에 필수적인 임상 미생물학 기법을 익혀보세요.

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우리는 공부하는 동안 그들의 도움을 메이오 클리닉 Mycobacteriology 연구소의 실험실 기술자에게 감사를 표합니다.

각 실험실은 inoculum의 준비 및 접시에 inoculum의 pipetting에 해당 biosafety 수준을 결정하기 위해 그들의 기관 생물 안전 관리 책임자와 공동으로 위험 평가를 수행하기 위해 필요합니다. microtiter 접시가 주사, 플라스틱 접착 도장과 봉인까지 우리 연구실에서는, 우리 3 실험실 (BSL3) 사례 biosafety 수준을 사용합니다. 이 번호판은 다음 열을도 밀폐되어 비닐 봉지 안에 배치됩니다. microtiter 판의 배양과 해석 읽기는 biosafety 레벨 2 실험실 (BSL2)에 실시됩니다. 1. 자료의 라벨링 <ol><li> 라벨 혈액 한천 플레이트 세 미들 7H10 접시, 미들 7H9 국물, 호수 트윈 유리 비드 튜브와 BSL2 해당 식별자 (예 : 환자 이름, 의료 기록 번호)와 대서양 표준시 microtiter 접시. </li><li> 라벨 혈액 한천 배지와 "순도 검사"로 도금 7H10. inoculum 정기적으로 식민지 카운트는 생물의 적절한 농도가 테스트에 사용하도록 권장합니다. 수행 콜로니 카운트는 "1분의 1 콜로니 개수"와 "50분의 1 식민지 개수"로 표시된 7H10 접시 두 가지가 필요합니다. </li></ol> 2. BSL3로 이동 기술자 준비 <ol><li> 적절한 개인 보호 장비는 BSL3에서 작업하는 데 필요한이며 솔리드 앞에 가운, 머리 커버, 장갑, 신발 커버, 그리고 인공 호흡기가 포함되어 있습니다. 각 기관들은 기관의 산업 위생 관리 책임자와 공동으로 자신의 호흡기 보호 계획을 수립해야합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 전원이 공급되는 공기 정화 호흡기 (PAPRs) 및 장착 HEPA - 필터링, N95 절반 얼굴 호흡기를 포함하여 사용 가능한 여러 가지 호흡기를했습니다. </li></ol> 3. 생물 학적 안전 캐비닛의 준비 <ol><li> BSL3에서 표면을 소독하고 공기 패널에서 살균제 약 6인치로 적셔 종이 타월을 배치하여 생물 학적 안전 캐비닛 (BSC)를 준비합니다. </li><li> 폐기물 왼쪽 용기, 그리고 오른쪽에 작은 nephlometer 및 vortexer를 놓습니다. </li><li> Inoculating 루프, pipetors 및 도움말은 종이 타월 옆에 배치됩니다. </li><li> 유기체 (국물 또는 고체 매체에)와 종이 타월에 맥팔랜드 0.5 표준 랙에 넣으십시오. </li></ol> 4. nephelometer의 보정 <ol><li> nephelometer 호수 트윈 유리 구슬 튜브를 삽입하고 생리 트윈 공백을 사용하여 0으로 악기를 설정합니다. </li><li> nephelometer에 맥팔랜드 0.5 표준을 놓고 제조 업체의 지침에 따라 보정. </li></ol> 5. Inoculum의 준비 <ol><li> ≥ 0.5 맥팔랜드 표준 얻을 때까지 적절하게 표시된 호수 트윈 유리 비드 관에 멸균 루프를 사용하는 고체 배지에서 BSC, 스크 레이프 식민지에서 근무. </li><li> 시각 샘플을 검사하고, 맥팔랜드 표준 비교합니다. </li><li> 30-60초을위한 와동 샘플. </li><li> (타이머 설정) 15 분 정착 inoculum하실 수 있습니다. </li></ol> 6. microtiter 접시의 접종 <ol><li> 단계 4.1 및 4.2 맥팔랜드 0.5 보정 nephelometer를 사용하여 살린 트윈의 국물로 inoculum를 조정합니다. 이것은 30 분 (당 제조 사양) 이내에 완료해야합니다. </li><li> 200 μL pipetter과 살린 비드 트윈 튜브의 TOP 3분의 1 차에서 inoculum 100 μL를 제거하는 데 오랜 에어로졸 방지 pipet 팁을 사용합니다. 미들 7H9의 용기를 예방. 천천히 와동 20 초 동안 주사 7H9 국물. </li><li> 제조 업체의 패키지에서 대서양 표준시의 microtiter 플레이트를 제거합니다. 박 패키지가 손상된 경우 건조은 파란색 또는 경우 사용하지 마십시오. </li><li> 멸균 튜브에 멸균 물의 50 μL를 pipetting하여 1시 50분 희석의 준비에 나중에 사용하기 위해 1시 50분 희석 튜브를 준비합니다. </li><li> 신중하게 여물로 7H9 국물의 inoculum 잔. 에어로졸을 생성하지 마십시오. </li><li> 당신이 직면하고있는 레이블로 대서양 표준시의 microtiter 접시를 놓습니다. </li><li> 각각 잘 수있는 inoculum 100 μL를 추가하는 12 채널 pipetter을 사용합니다. </li><li> 식민지 카운트에 대한 dilutions 준비 : <ol type="a"><li> 1분의 1 희석는 "1분의 1"이라는 7H10 판 1 μl 루프를 줄이하여 잘 긍정적인 컨트롤 (H12)에서 준비가되어 있습니다. </li><li> 50분의 1 희석이 잘 긍정적인 컨트롤 (H12)에서 1 μl 루프를 inoculating 이상 준비 수관 50 μl와 튜브에 그것을 소용돌이로 준비가되어 있습니다. 번호판이 희석의 리크 1 μL은 "50분의 1"(으)로 분류. </li></ol></li><li> 적절하게 레이블이 붙은 혈액 한천과 7H10 플레이트 및 격리를위한 행진에 50 μL를 pipetting하여 여물에서 순도 접시의 예방. </li><li> 장소대서양 표준시의 microtiter 플레이트에 접착제 인감. 인감의 백색 다시를 사용하여 충분한 씰링을 보장하기 위해 각 자에 단단히 누르십시오. 주름을 피하십시오. </li><li> 열 인감 또는 테이프와 비닐 봉지와 가까이에 tuberculocidal 방역 및 장소 microtiter 플레이트로 적셔 종이 타월로 닦아하여 microtiter 접시를 소독. <ol type="a"><li> 비닐 봉투가가 기본 접시의 누출 또는 유출되어야 모든 국물이 들어 있는지 확인하기 위해 보조 컨테이너 역할을합니다. </li></ol></li></ol> 7. 자료와 생물 학적 안전 캐비닛의 살균 <ol><li> 에어로졸 생산을 방지하기 위해 폐기 용기에 넣어 부드럽게하기 전에 주사 여물 위에 또 다른 여물을 놓으십시오. </li><li> tuberculocidal 살균제로 닦고하여 nephlometer, vortexer, 접시, 튜브 등 모든 자료를 소독하고 BSC에서 제거하기 전에 제조 업체의 지시에 따라 소독을 확보하기 위해 적절한 시간을 기다립니다. 예를 들어, Prospray 우리가 사용하는 tuberculocidal 살균제는 mycobacteria 죽일 15 분 필요합니다. </li><li> autoclaving 전에 생물 학적 가방 날인의 폐기 컨테이너를 놓습니다. </li></ol> 8. 잠복 <ol><li> 플레이트는 아래 미디어 incubated되어야하며 치료는 어떤 액체를 흘리고 또는 물 튀기지 않도록 주의해야한다. </li><li> BSL2 연구실에 50-10%의 CO 2 5~10%의 CO 2와 35-37 ° C 배양기에서 대서양 표준시의 microtiter 플레이트 판, 7H10과 혈액 한천 플레이트를 품어. <ol class="lalpha"><li> 접시 잘 밀봉하여 내부 봉인된 비닐 봉지이기 때문에 저희 연구실에서는이 허용됩니다. </li></ol></li><li> 더 이상 2보다 microtiter 대서양 표준시 플레이트는 제조 업체의 지침에 따라 보육에 쌓아해야합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 결과의 해석 : 실드 대서양 표준시 microtiter 접시 수동 지원 또는 Vizion (트렉 진단) 등의 자동 플레이트 리더와 함께 거울을 사용하여 읽을 수 있습니다. 접시는 즉시 접종 후 칠일로 검사하실 수 있습니다. 그들은 (예, 잘 하단의 세포의 보증금을 가지고) 긍정적인 있는지 확인하기 위해 위치 H11와 H12의 성장 제어 우물을 검사합니다. 성장 제어 우물이 긍정적하지 않는 경우, 접시를 reinc​​ubate 및 성장 제어 우물은 긍정 때까지 (예, 하루 10, 일 14) 정기적으로 다시 검사하십시오. <ol type="a"><li> 미러 읽기 : <ol type="i"><li> 장소는 플랫폼에 대서양 표준시 microtiter 접시를 봉인; </li><li> 배양 7 일 후 성장 제어 우물을 읽고, 이것은 부정, reinc​​ubate 대서양 표준시 microtiter 접시 경우; </li><li> 성장 컨트롤이 허용하는 경우, 다음 약물이 포함된 우물을 참조하십시오. 각 약물에 대한 내용은 성장 컨트롤과 함께 마약 우물을 비교하여 더 성장이없는 최초의 희석을 기록합니다. </li><li> 성장 탁도 또는 우물의 하단에있는 세포의 보증금으로 나타납니다. </li></ol></li><li> 악기 읽기 : 제조 업체의 지침을 따르십시오, 아래의 지침은 읽기가 Vizion 플랫폼과 할 것입니다 방법에 대한 예제입니다 <ol type="i"><li> 로그인 </li><li> "MYCOTB"대서양 표준시 플레이트 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 사용자가 직면하고있는 바코드와 함께 밀봉 플레이트를 놓습니다. 성장 탁도 또는 우물의 하단에있는 세포의 보증금으로 나타납니다. </li><li> 성장 컨트롤을 읽고, 이것은 부정, reinc​​ubate 대서양 표준시 microtiter 접시 경우, 긍정적인 성장을 표시하지 않는 각 약물의 첫 잘으로 화면을 감동하여 번호판을 읽으면. </li></ol></li></ol> 순도 번호판을 읽어 보시기 바랍니다. 혈액 한천 플레이트 48 시간 이후에는 성장을 보여주지해야하며 7H10 순도 판 하나의 유기체 유형의 합류 성장이 있어야합니다. 오염된 경우에는 대서양 표준시 microtiter 테스트는 순수한 문화에서 반복해야합니다. 물론 아래의 테이블을 사용하여 긍정적인 컨트롤에서 콜로니 수를 계산 : 콜로니 카운트 키 <table border="1"><tbody><tr><td> # 식민지는 "1분의 1"(으)로 분류 접시에 계산 </td><td> # 식민지는 "50분의 1"(으)로 분류 접시에 계산 </td><td> Inoculum 콜로니 개수 (cfu / ML) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 X 10월 4일에서 1일까지 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 X 10월 5일부터 5일까지 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> Mycobacterium tuberculo의 일부 변종의 패러 aminosalicylic 산성과 함께이 후행 수 있습니다언니. 이 알약을 모든 우물을보고하고 끝점으로 다음 희석 같은 크기 펠렛을 가지고 처음으로 잘 사용하여 해석될 수있다. 저항이 약물로 드문 경우입니다. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. MYCOTB 플레이트를 사용하는 대표적인 결과. <table border="1"><tbody><tr><td> 약물 약어 </td><td> 마약 </td><td> 마이크 μ / ML </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacin </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moxifloxacin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampin </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> amikacin </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> 스트렙토 마이신 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> P - aminosalicylic 산성 </td><td> ≤ 0.5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> ethionamide </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> cycloserine </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazid </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> kanamycin </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> ethambutol </td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

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</ol>

긍정적인 성장 컨트롤을 가진 대서양 표준시의 microtiter 접시의 예제는 그림 1에 나와 있으며, 각각의 약물에 대한 끝점 MIC (μg / ML)이 돌고있다. 우리 연구실에서 수행 연구는 대서양 표준시의 microtiter 플레이트 방법은 Mycobacterium의 결핵의 자화율 시험을위한 황금 표준 한천 비중 방법에 해당하는 것을 지적했다. 대서양 표준시 microtiter 플레이트와 한천 비율 방법 14에서 21 일 동안 최종 해석 전통 한천 비율 방법과 비교하여 결과의​​ 빠른보고가 microtiter 대서양 표준시 microtiter 플레이트와 함께 얻은 것입니다, respectively.The 대서양 표준시 microtiter 플레이트 먼저 테스트의 장점을 가지고 있으며, 두번째 라인 모성 종자와 과도한 지연을 방지할 수 있습니다 동시에 마약. 대서양 표준시 microtiter 접시 또한 APM보다 설정과 읽기 훨씬 쉽게와 같은 VIZION 같이 수동으로 거울과 세미 자동화 시스템 모두는 접시를 읽는 데 사용할 수 있습니다. 결핵 약제 내성 검사에 대한 MIC 값이 있는지의 여부는 특히 &quot;경계선&quot;자화율있는 사람 격리를 위해, 전통적인 중요한 농도 값에 비해 의사들에게 유용한 새로운 정보를 제공할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 대서양 표준시 microtiter 접시와 접착제 도장 </td><td> 트렉 진단, 클리블랜드 오하이오 </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> 맥팔랜드 0.5 표준 </td><td> 트렉 진단, 클리블랜드, 오하이오 </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> 미들 7H10 플레이트 </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 혈액 아가르 플레이트 </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균은 μL 1 루프 </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 무균 루프 10 μL </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre 살린 - 트윈 유리 구슬 국물 </td><td> 트렉 진단, 클리블랜드, 오하이오 </td><td> 27,143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC 맛을 </td><td> 트렉 진단, 클리블랜드, 오하이오 </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> 롱 Pipet 도움말 </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 무균 트러프 </td><td> 트렉 진단, 클리블랜드, 오하이오 </td><td></td></tr><tr><td> M. 결핵 </td><td> ATCC </td><td> 27,294 </td></tr><tr><td> Pipeters : 1000, 200, 20μL </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 팁 1000, 20, 20 μL </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티채널 Pipetter </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 보육 50~10%의 CO 2 </td><td> 어부 </td><td></td></tr><tr><td> 비닐 봉투, 작은, CO 2 투과 </td><td> 폴리 플라스틱, 델러노, PA </td><td></td></tr><tr><td> 결핵 살균제 (예 : ProSpray C - 60) </td><td> Certol 국제 상업 도시, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> 미러 박스 리더 </td><td> 어부 </td><td></td></tr></tbody></table>

microtiter 플레이트 형식의 맛을 희석하여 첫 번째와 두 번째 라인 의약품 mycobacterium 결핵의 복합 항균 자화율 테스트

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

항균 저항의 급속한 탐지 방지 Mycobacterium 결핵 (MTB)의 증가를 제어하기 위해 노력 중요합니다. MTB의 항균 자화율 테스트 (대서양 표준시)는 전통적으로 비례의 한천 방법으로 또는 / BACTEC (백톤 디킨슨, 스파크, MD), VersaTREK (트렉 진단, 클리블랜드, OH) 또는 BacT와 같은 악기에 macrobroth 테스트에 의해 수행되었습니다 알림 (bioMérieux, 하젤우드, MO). 고려하면서 한천 비례 방법은, AST의 &quot;황금&quot;표준은 집중적인 노동하고 마약없는 한천에 비해 약물이 포함된 한천에 식민지 카운트를 수행하여 저항의 계산이 필요합니다. 약물없는 매체에 비해 약물이 포함된 매체에 ≥ 1 % 성장이있다면, 유기체는 그 약물에 강한 것으로 간주됩니다. macrobroth 방법은 계측 및 첫 번째 라인 의약품에 대한 시험 브레이크 포인트 ( &quot;중요한&quot;) 약물 농도를 (isoniazid, ethambutol, rifampin, 그리고 pyrazinamide)가 필요합니다. 방법은 96 잘 microtiter 플레이트 형식으로 상업적으로 사용할 수 있습니다 여기에 설명된 [MYCOTB (트렉 진단)]과 amikacin (둘 다 첫 번째 (isoniazid, rifampin, ethambutol)와 두 번째 라인 의약품을 포함한 결핵의 치료에 사용되는 12 antimicrobials의 증가 농도를 포함, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, 패러 aminosalicylic 산, rifabutin 및 스트렙토 마이신). Pyrazinamide, 첫 번째 라인 약물은 산성 시험 조건에 대한 필요로 인해 microtiter 접시에 포함되지 않습니다. microtiter 시스템의 장점 모두 설정의 용이성 전통 한천 비중 (21 일)와 비교하여 빠른 시간에 차례 (14 일) 등이 있습니다. 또한, 접시는 국물 또는 고체 매체 중 하나를 사용하여 준비 inoculum에서 설정할 수 있습니다. microtiter 접시 형식이 새로운과 MTB가 실험실에서 고유의 안전 문제를 제시 있기 때문에,이 프로토콜은 안전하게 설치하는 방법을 설명하기 때문에, 부화 및 microtiter 접시를 참조하십시오.

Mycobacterium 결핵의 항균 자화율 시험에 도전하지만, 환자 치료를 위해 중요합니다. 이 microtiter 플레이트 형식 12 antimycobacterial 마약 테스트를 제공하며 적절한 치료에 도움이됩니다 최소 억제 농도 (MIC) 값을 제공합니다.

Microtiter 플레이트 형식의 맛을 희석하여 첫 번째와 두 번째 라인 의약품 Mycobacterium 결핵의 복합 항균 자화율 테스트

항생제 내성의 신속한 검출은 내성 결핵균(*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb)의 증가를 억제하기 위한 노력에 있어 매우 중요합니다. ...

결핵균(mycobacterium tuberculosis)을 치료하는 데 사용할 수 있는 약물이 상대적으로 적기 때문에, 어떠한 약물에 대해서라도 내성이 생기는 것은 우려되는 문제입니다. 본 비디오 논문은 12가지의 서로 다른 미생물 약물에 대해 M tuberculosis의 항생제 내성을 동시에 테스트하는 절차를 설명합니다. 따라서 M tuberculosis의 항생제 내성을 신속하게 검출하는 능력은 내성 균주의 증가를 억제하려는 노력에 있어 매우 중요하며, 본 연구에서는 항생제 감수성을 테스트하고자 합니다.M tuberculosis를 먼저 고체 또는 액체 배지에서 배양하여 세균 현탁액을 만듭니다. 준비된 접종물을 1차 및 2차 약제를 포함한 12가지 약물이 다양한 농도로 들어 있는 마이크로타이터 플레이트에 첨가합니다. 배양 후, 각 웰의 성장 정도를 미러 박스를 이용하여 수동으로 측정하거나 반자동 플레이트 리더를 사용하여 결정합니다.결과 데이터는 테스트한 각 약물의 최소 억제 농도를 나타내며, 테스트한 TB 균주가 어떤 항생제에 내성이 있는지 보여줍니다. 이러한 결과는 tb 치료를 위한 적절한 약물을 선택하는 데 도움이 됩니다. 안녕하세요, 저는 미네소타주 로체스터에 있는 Mayo Clinic의 Myco Bacteriology Laboratory 책임자인 Nancy Ek입니다.오늘은 결핵균(mycobacterium tuberculosis)의 항생제 감수성 테스트 방법에 대해 설명하겠습니다. 거대 액체 배지 희석법(macro broth dilution)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 각 약물에 대한 최소 억제 농도(MIC)를 결정할 수 있으며, 12가지 항생제를 동시에 테스트할 수 있다는 점입니다. 실험실 벤치에서 작업을 수행하며 절차를 시연할 사람은 저희 실험실의 품질 전문가인 Kurt Jude입니다.혈액 배지 플레이트 1개, Middlebrooks 7H10 배지 플레이트 3개, saline tween 유리 구슬 튜브 1개, 그리고 마이크로타이터 플레이트에 환자 성명과 검체 식별 번호를 기입하여 본 절차를 준비합니다. 추가로, 혈액 배지와 7H10 배지 플레이트에는 '순수 배양(purity)'이라고 표시합니다. 이 중 7H10 배지 플레이트 하나에는 '1:1 군락 수(1 to 1 colony count)', 다른 하나에는 '1:50 군락 수(1 to 50 colony count)'라고 표시하십시오.그 다음 트레이를 패스스루(pass through)에 넣습니다. 다음으로, 전면 폐쇄형 가운, 헤드 커버, 장갑, 신발 커버 및 호흡기 보호구를 착용하여 생물안전 3등급 BSL 3 시설에서 작업할 준비를 합니다. 여기서는 PAPR 호흡기 보호구가 사용됩니다.그런 다음 패스스루에서 트레이를 꺼냅니다. 다음으로 BSL 3 시설 내에서 생물안전작업대의 표면을 소독합니다. 그런 다음 소독제에 적신 종이 타월을 후드 내부의 공기 배출 패널에서 약 6인치 떨어진 곳에 놓습니다.접종 루프, 피펫과 팁, 적절한 폐기물 처리 용기, nephi, TER 및 볼텍스를 준비합니다. 후드 준비가 완료되면, McFarland 0.5 표준액, OADC가 포함된 7H9 배지 및 생리식염수 비드 튜브가 담긴 랙과 함께 균주를 페이퍼 타월 위에 놓습니다. 이 설정은 고체 배지로부터 수행됩니다.환자 검체에서 유래한 고체 배지 배양물로부터 접종원을 준비합니다. 멸균 루프를 사용하여 콜로니를 긁어내어 saline tween 유리 구슬 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 30~60초 동안 볼텍싱합니다.시료를 육안으로 검사하여 McFarland 표준액과 비교합니다. 옮겨진 양이 표준액과 같거나 더 많아야 합니다. 그렇지 않은 경우, 박테리아 시료를 더 추가하고 다시 볼텍싱합니다.McFarland 표준과 일치시킨 후, 박테리아의 큰 덩어리들이 가라앉을 수 있도록 접종물을 15분 동안 방치합니다. 다음으로, nefi TER를 사용하여 현탁된 박테리아의 밀도를 0으로 측정합니다. nephi ter.먼저 빈 식염수 비드 튜브를 네피로미터(nephilometer)에 넣습니다. 보정 버튼을 눌러 기기를 영점 조절한 후, 0.5 McFarland 표준액을 네피로미터에 넣고 보정 버튼을 다시 누릅니다. 기기 보정이 완료되면 McFarland 표준액을 제거하고 접종액을 삽입합니다.접종액의 측정값은 McFarland 표준 측정값과 일치해야 합니다. 측정값이 너무 낮으면 튜브를 꺼내 플레이트에서 박테리아를 더 옮깁니다. 그런 다음 볼텍싱하고 샘플을 다시 측정합니다.측정값이 너무 높으면, 튜브에 saline tween을 추가하고 볼텍싱합니다. 그 후 샘플을 다시 측정하십시오. 박테리아 농도가 McFarland 표준과 일치할 때까지 필요에 따라 접종량을 계속 조정하십시오.다음으로, 200 µL 피펫과 길이 연장형 에어로졸 방지 피펫 팁을 사용하여 튜브 상단 1/3 지점에서 접종액 100 µL를 취합니다. Middlebrook 7H9 배지의 바닥에 가라앉은 덩어리가 섞이지 않도록 하기 위해, 접종된 배지를 20초 동안 천천히 볼텍싱하여 접종액을 도말합니다. 먼저 제조사 패키지에서 마이크로타이터 플레이트를 꺼냅니다. 제습제가 파란색이 아니거나 알루미늄 호일 패키지가 손상된 경우 사용하지 마십시오.플레이트의 각 웰에는 가장 효과적인 1차 선택 약제와 2차 선택 약제를 포함하여 테스트할 12가지 항균제가 이미 들어 있습니다. 에어로졸이 발생하지 않도록 주의하며 7H9 broth 접종액을 튜브에 조심스럽게 붓습니다. 그런 다음 여기 보이는 것처럼 라벨이 바깥쪽을 향하도록 마이크로 타이터 플레이트를 놓고, 12채널 피펫을 사용하여 각 웰에 접종액 100 µL를 추가합니다.다음으로, 콜로니 수를 측정하기 위한 플레이트를 준비합니다. 먼저, 양성 대조군 웰에서 샘플 1 µL를 루프로 취해 '1 to 1'로 표시된 7 H 10 플레이트에 옮겨 희석하지 않은 플레이트를 준비합니다. 그런 다음, 여기에 표시된 대로 루프를 사용하여 플레이트에 스트리킹합니다.다음으로, 1:50 희석액을 준비하기 위해, 양성 대조군 웰에서 1 µL 루프를 사용하여 시료를 취한 후 50 µL의 멸균수가 들어 있는 튜브에 넣고 섞어줍니다. 이 희석액 1 µL를 1:50으로 표시된 플레이트에 도말합니다. TSB 배지에서 접종액 50 µL를 피펫으로 취해 적절하게 라벨링된 혈액 한천 배지와 7H10 배지에 분주한 후, 순수 배양을 위해 분리 도말합니다.그 다음 접종된 trth 위에 또 다른 trth를 쌓고 이를 폐기물 용기에 조심스럽게 넣습니다. 마이크로타이터 플레이트에 접착 씰을 붙입니다. 그 후 흰색 뒷면을 이용하여 각 웰을 단단히 눌러 주름이 생기지 않도록 완전히 밀봉되었는지 확인합니다.결핵균 살균 소독제로 적신 페이퍼 타월로 마이크로타이터 플레이트를 닦아 소독합니다. 그다음 마이크로타이터 플레이트를 플라스틱 백에 넣고 열 밀봉기로 밀봉합니다. 마지막으로 네피, 필터 볼텍스, 플레이트 및 튜브를 포함한 모든 재료를 결핵균 살균 소독제로 닦아 소독합니다.소독이 확실히 이루어질 수 있도록 충분한 시간이 지난 후 pro spray를 사용합니다. pro spray의 경우 15분간 처리합니다. 플레이트는 스카치테이프로 테이핑하여 플라스틱 백에 넣고, 밀봉된 소모품들은 생물안전작업대에서 꺼내 패스스루(pass through)로 옮깁니다.폐기용 빨간색 봉투를 닫고 트위스트 타이로 밀봉한 후, 가운, 신발 덮개 및 장갑을 벗습니다. 전실로 이동하여 손을 씻은 다음, 호흡기 보호구를 제거하고 다시 손을 씻은 후 호흡기 보호구를 소독하여 보관합니다. 그리고 새 가운을 입고 BSL 3 구역을 나옵니다. 다음으로, 폐기물 용기를 오토클레이브로 멸균합니다.이후, BSL 2 실험실 내 35~37 °C, 5~10% CO2 인큐베이터에서 마이크로타이터 플레이트와 7개 H 10 및 blood auger 플레이트를 똑바로 세워 배양합니다. 플레이트가 밀봉되어 비닐 봉투에 들어 있으므로 이 방법이 허용됩니다. Mycobacterium tuberculosis의 세대 시간은 약 12~24시간이므로, 대조군 웰 바닥에 세포 펠릿이 형성되어 성장이 관찰되기까지 최소 일주일이 소요됩니다. 10일째 되는 날, 밀봉된 AST 마이크로타이터 플레이트를 미러 박스 플랫폼 위에 올려 수동으로 mirror read를 수행합니다.성장 여부를 시각적으로 확인하기 위해 데스크 램프를 사용하고, 최적의 대비가 나타나도록 필요에 따라 조절하십시오. 거울을 통해 성장 대조군 웰(이 경우 H 11 및 H 12)을 확인하십시오. 성장이 일어난 경우, 여기에서 보는 것과 같이 웰이 혼탁해지거나 침전물이 있는 것처럼 보입니다.이 예시와 같이 성장이 없는 경우, 웰은 투명하게 보일 것입니다. 이 경우, 플레이트를 다시 배양기에 넣고 최대 21일까지 배양을 계속하십시오. 각 조건에 대해 대조군과 성장을 비교하십시오.그 다음, 각 약물 기록에 대해 성장이 나타나지 않는 첫 번째 희석 배수를 확인합니다. 이것이 해당 약물의 최소 억제 농도(minimal inhibitory concentration) 또는 MIC가 됩니다. VisiOn과 같은 자동 플레이트 리더를 사용하여 결과를 분석하려면, 먼저 Myco TB AST 플레이트 소프트웨어를 실행하고 로그인하십시오. 바코드가 바깥쪽을 향하도록 밀봉된 플레이트를 배치합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 성장은 컴퓨터 화면상에서 탁도로 나타나거나 웰 바닥에 세포가 침전된 형태로 나타납니다.먼저, 성장 대조군을 확인하십시오. 이전과 동일하게 진행합니다. 만약 성장이 나타나지 않은 음성 결과라면, 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 최대 21일 동안 배양하십시오.결과가 양성인 경우, 각 약물에 대해 성장이 나타나지 않는 첫 번째 웰을 화면에서 터치하여 결과를 기록하십시오. 일부 경우에는 박테리아, 침전물 또는 약물이 웰 바닥으로 가라앉을 수 있습니다. '트레일링(trailing)'이라고 알려진 이 현상은 동일한 크기의 펠릿이 여러 웰에서 나타나는 것으로 확인되며, 이는 실제 양성 성장으로 간주되지 않습니다.다음으로, 7개의 H 10 및 혈액 한천 배지를 검사하여 세균 농도를 결정하고 순도를 평가합니다. 혈액 한천 배지에서는 48시간 후에 성장이 관찰되지 않아야 합니다. 혈액 한천 배지에서 성장이 나타나면 빠르게 성장하는 세균에 의해 오염되었음을 의미합니다.성장이 확인되면 마이크로타이터 시험을 반복해야 합니다. 7 H 10 순도 플레이트에는 한 종류의 미생물만 성장해야 합니다. Type EM tuberculosis는 황갈색을 띠며 주름지고 거친 표면으로 나타나야 합니다. 오염된 경우, 순수 배양물로부터 마이크로타이터 시험을 다시 수행해야 합니다.박테리아 농도를 평가하려면 7 H 10 플레이트의 콜로니 수를 측정하십시오. 그 다음, 동봉된 서면 문서의 표를 사용하여 콜로니 수를 계산하십시오. 환자 검체로부터 Mycobacterium tuberculosis를 배양하였으며, 이 비디오에서 설명한 대로 항생제 내성을 평가했습니다. 여기에 표시된 플레이트에는 12가지의 서로 다른 약물이 농도별로 배치되어 있으며, 상단이 가장 높은 농도이고 하단이 가장 낮은 농도입니다.약물의 최소 억제 농도(MIC)는 성장이 나타나지 않은 가장 낮은 약물 농도로 정의되며, 여기 표시된 이미지에서 Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)가 설정한 표준 분절점(breakpoints)을 사용하여 원으로 표시하였습니다. 여기에 제시된 데이터는 이 결핵균 균주가 Isid 및 Rifampin에 내성을 가질 것임을 시사합니다. In vitro 실험에서 oin, moxifloxacin, streptomycin, rifabutin을 포함한 여러 다른 약물에서 관찰된 높은 MIC 값은 EM 결핵 균주가 이러한 약제들에 대해 내성을 가지고 있음을 시사합니다.MIC 결과는 결핵 치료 경험이 풍부한 감염내과 전문의가 개별 맞춤형 치료 계획을 수립하는 데 활용해야 합니다. 이 기술을 숙달하면 분리균 한 개당 준비하는 데 약 40분이 소요됩니다. 본 절차를 수행할 때, 이는 호흡기 병원균이며 에어로졸이 발생할 수 있음을 유념하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 미량 액체 희석법(micro broth dilution method)을 이용한 mycobacterium tuberculosis의 항균제 감수성 시험 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. mycobacterium tuberculosis를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 필요한 경우 호흡기 보호와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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MODS의 결핵의 진단 방법과 내성 결핵을 multidrug

특정 조건에서 배양해 때 결핵은 Mycobacterium 마약 허용 biofilms를 형성합니다. 여기 culturing M.하는 방법을 설명 결핵 biofilms 및 약물 관용 persisters의 주파수를 결정. 이러한 프로토콜은 M.의 약물 내성의 메커니즘에 대한 연구를 위해 도움이 될 것입니다 결핵.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

출처: Koeth, LM, et. al., 호기성 성장 박테리아의 달바반신 체외 감수성 테스트에 대한 참조 국물 미세 희석 방법. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 그람 양성균에 대한 리포글리코펩타이드 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 국물 미세 희석 방법을 보여줍니다. 박테리아 콜로니 분리, 희석, 다양한 항생제 농도의 마이크로플레이트 웰 접종, 배양 순도 및 세포 수 검증을 다룹니다. 이 비디오는 또한 항생제 결합이 세포벽 합성을 방해하여 용해를 유발하는 방법과 눈에 보이는 성장 억제를 기반으로 MIC를 식별하는 방법을 설명합니다.

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이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis에 대한 항생제 효능을 결정하기 위한 육체 내 분석을 보여줍니다. 박테리아 배양액은 다양한 농도의 살균 항생제로 배양됩니다. 살균 효능은 레사주린(resazurin) 분석을 사용하여 생존 가능한 박테리아의 존재를 평가하여 측정됩니다.

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우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

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