Microtiter 플레이트 형식의 맛을 희석하여 첫 번째와 두 번째 라인 의약품 Mycobacterium 결핵의 복합 항균 자화율 테스트

결핵균을 치료할 수 있는 약물이 상대적으로 적기 때문에 모든 약물에 대한 내성이 우려됩니다. 이 동영상 기사는 12가지 다른 미생물 약물에 대한 M 결핵의 항생제 내성을 동시에 테스트하는 절차를 설명합니다. 따라서, M 결핵의 항생제 내성을 신속하게 검출할 수 있는 능력은 항생제 감수성을 검사하기 위해 여기에서 내성 균주의 증가를 통제하려는 노력에 매우 중요합니다.

M 결핵은 고체 또는 육수 배지, 즉 박테리아 현탁액에서 처음 자랍니다. 접종물을 준비하여 1차 및 2차 약물을 포함한 12가지 약물의 다양한 농도를 포함하는 마이크로타이터 플레이트에 첨가합니다. 각 웰의 성장 정도는 미러 박스를 사용하여 수동으로 또는 반자동 플레이트 리더를 사용하여 측정됩니다.

결과 데이터는 테스트된 각 약물의 최소 억제 농도를 나타내며 테스트된 TB 균주가 어떤 항생제에 내성이 있는지 보여줍니다. 이러한 결과는 결핵 치료에 적합한 약물을 선택하는 데 도움이 됩니다. 안녕하세요, 제 이름은 Nancy Ek이고 미네소타 주 로체스터에 있는 Mayo Clinic의 Myco 세균학 연구소 소장입니다.

오늘은 결핵균에 대한 항생제 감수성 검사를 하는 방법에 대해 설명하려고 합니다. 매크로 국물 희석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 각 약물에 대해 MIC를 결정하고 12가지 항생제를 동시에 테스트한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 품질 전문가인 Kurt Jude가 실험실 벤치에서 작업하고 있습니다.

혈액 한천 플레이트, 3개의 Middlebrooks 7 H 10 플레이트, 식염수 트윈 유리 비드 튜브 및 마이크로타이터 플레이트에 환자의 이름과 검체 식별 번호를 표시하여 이 절차를 준비합니다. 또한 혈액 한천과 7개의 H 10 플레이트를 순도로 표시합니다. 이 7개의 H 10 플레이트 중 하나는 1:1 콜로니 수로, 다른 하나는 1:50 콜로니 수로 표시합니다.

그런 다음 트레이를 통과 통로에 놓습니다. 다음으로, 견고한 앞 가운, 머리 덮개, 장갑, 신발 덮개 및 인공 호흡기를 착용하여 레벨 3 생물 안전 BSL 3 시설에서 일할 준비를 합니다. 여기에는 파파 호흡기가 사용됩니다.

그런 다음 통과에서 트레이를 검색합니다. 다음으로 BSL 3 시설에서 생물 안전 캐비닛의 표면을 소독합니다. 그런 다음 소독제를 적신 종이 타월을 후드 내부에 놓고 종이 타월 옆의 통풍구 패널에서 약 6인치 떨어진 곳에 놓습니다.

접종 루프, 피펫 및 팁, 적절한 폐기물 처리 용기, 니파이, TER 및 와류를 배치합니다. 후드가 준비되면 McFarland 0.5 표준 A 7 H 9 육수와 OADC가 있는 랙과 식염수 비드 튜브와 함께 종이 타월 위에 유기체를 놓습니다. 이 설정은 솔리드, 미디엄에서 수행됩니다.

환자의 검체에서 고체 배지 배양물로부터 접종물을 준비합니다. 멸균 루프를 사용하여 콜로니를 긁어내고 식염수 트윈 유리 비드 튜브로 옮깁니다. 30초에서 60초 동안 현가장치를 소용돌이

샘플을 육안으로 검사하여 McFarland 표준과 비교합니다. 이체된 금액은 표준 이상이어야 합니다. 그렇지 않은 경우 박테리아 샘플과 와류를 더 추가하십시오. 다시.

McFarland 표준이 일치하면 더 큰 박테리아 덩어리가 가라앉을 수 있도록 접종물이 15분 동안 가라앉을 때까지 기다립니다. 다음으로, nefi TER을 사용하여 부유 박테리아의 밀도를 0으로 측정합니다. 니파이 테르.

먼저 nephi ter에 빈 식염수 비드 트윈 튜브를 놓습니다. 보정 버튼을 눌러 기기를 영점 조정한 다음 McFarland 0.5 표준을 Nephi ter에 놓고 보정 버튼을 다시 누릅니다. 기기가 보정되면 McFarland 표준을 제거하고 접종물을 삽입합니다.

접종물 판독값은 McFarland 표준 판독값과 동일해야 합니다. 판독값이 너무 낮으면 튜브를 제거하고 플레이트에서 더 많은 박테리아를 옮기십시오. 그런 다음 소용돌이치고 샘플을 다시 읽으십시오.

판독값이 너무 높으면 튜브 소용돌이에 식염수 트윈을 추가합니다. 그런 다음 샘플을 다시 읽습니다. 박테리아의 농도가 McFarland 표준과 일치할 때까지 필요에 따라 접종물을 계속 조정합니다.

그런 다음 200마이크로리터 피펫과 긴 에어로졸 내성 피펫 팁을 사용하여 튜브의 상단 1/3에서 100마이크로리터의 접종물을 제거합니다. 바닥에 침전되는 덩어리를 방지하기 위해 Middlebrook seven H nine broth는 접종된 육수를 20초 동안 천천히 소용돌이하여 접종물을 플레이트하고 제조업체의 패키지에서 마이크로타이터 플레이트를 제거하는 것으로 시작합니다. 건조제가 파란색이거나 호일 패키지가 손상된 경우 사용하지 마십시오.

플레이트에는 이미 가장 효과적이거나 1차 약물 및 2차 약물을 포함하여 각 웰에서 테스트할 12개의 항균제가 들어 있습니다. 에어로졸이 생성되지 않도록 주의하면서 7개의 H 9 국물 접종물을 trth에 조심스럽게 붓습니다. 그런 다음 여기 그림과 같이 라벨이 바깥쪽을 향하도록 마이크로 역가 플레이트를 놓고 12채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 100마이크로리터의 접종물을 추가합니다.

다음으로, 콜로니 계수를 수행하기 위한 플레이트를 준비합니다. 먼저, 포지티브 컨트롤 웰에서 1마이크로리터의 샘플 루프를 1:1로 표시된 7개의 H 10 플레이트로 옮겨 희석되지 않은 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 루프를 사용하여 여기에 표시된 대로 플레이트에 줄무늬를 만듭니다.

다음으로, 1-50 희석을 준비하려면 포지티브 컨트롤 웰에서 1마이크로리터 루프를 옮기고 50마이크로리터의 물줄기가 있는 튜브로 소용돌이칩니다. 이 희석액 1마이크로리터는 1에서 50으로 표시된 플레이트에 있습니다. trth에서 50마이크로리터의 접종물을 적절하게 라벨링된 혈액 한천과 7개의 H 10 플레이트에 피펫팅하여 분리 플레이트를 접종합니다.

그런 다음 접종된 trth 위에 다른 trth를 쌓고 폐기 용기에 부드럽게 넣습니다. 마이크로타이터 플레이트에 접착 씰을 놓습니다. 그런 다음 흰색 뒷면을 사용하여 각 웰을 단단히 눌러 적절한 천장을 확인하고 주름이 없는지 확인합니다.

마이크로 역가 플레이트는 결핵 소독제를 적신 종이 타월로 닦아 소독합니다. 그런 다음 마이크로타이터 플레이트를 비닐 봉지에 넣고 열 밀봉으로 닫습니다. 마지막으로 니파이, 리터 와류, 판 및 튜브를 포함한 모든 재료를 결핵 소독제로 닦아 소독합니다.

여기서 프로 스프레이는 소독을 위해 충분한 시간이 경과한 후에 사용됩니다.프로 스프레이의 경우 15분. 플레이트는 스카치 테이프로 테이프로 감겨 비닐 봉지에 넣고 밀봉된 소모품은 생물 안전 캐비닛에서 꺼내 통과시킵니다.

이 시점에서 버려진 빨간 봉투는 닫혀 트위스트 타이로 밀봉되어 가운, 부츠, 장갑을 제거했습니다. 대기실로 이동하여 손을 씻은 후 호흡기를 제거하고 소독 및 보관한 후 다시 손을 씻고 새 가운을 입고 BSL 쓰리 스위트를 떠납니다. 다음으로, 폐기 용기를 고압증기멸균합니다.

그런 다음 BSL 2 실험실에서 섭씨 35-37도의 인큐베이터에서 마이크로타이터 플레이트와 7개의 H, 10 및 혈액 오거 플레이트를 오른쪽이 위로 향하게 하여 5-10%CO2로 배양합니다. 플레이트가 잘 밀봉되어 있고 비닐 봉지에 담겨 있기 때문에 mycobacterium tuberculosis 생성 시간은 약 12-24시간이므로 대조군 바닥에서 세포 펠릿이 형성되는 것을 볼 수 있으려면 최소 일주일이 걸릴 것입니다. 글쎄, 10일째에는 밀봉된 ST 마이크로 역가 블레이드를 미러 박스의 플랫폼에 놓아 수동 미러 판독을 수행합니다.

책상 램프를 사용하여 성장을 시각화하고 최상의 대비를 얻기 위해 필요에 따라 조정하십시오. 이 경우 성장 조절 우물인 H 11 및 H 12를 거울을 보고 확인하십시오. 성장이 있으면 우물이 흐리게 보이거나 여기에 표시된 것처럼 침전물이 있는 것처럼 보입니다.

이 예에서 볼 수 있듯이 성장이 없으면 우물이 깨끗한 것처럼 보입니다. 이 경우 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 최대 21일 동안 배양을 계속하십시오. 각 조건에 대해 성장과 대조군을 비교합니다.

그렇다면, 각 약물 기록에 대해 성장이 없는 첫 번째 희석입니다. 이는 약물이 자동 플레이트 리더기를 사용하여 결과를 검사하기 위한 최소 억제 농도 또는 MIC로, Vision은 ST 플레이트 소프트웨어인 Myco TB를 열고 바코드가 바깥쪽을 향하도록 밀봉된 플레이트를 제자리에 로그인하는 것으로 시작합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 성장은 탁도 또는 컴퓨터 화면의 우물 바닥에 있는 세포의 침전물로 나타납니다.

먼저 성장 조절 장치를 검토하십시오. 이전과 같습니다. 이것이 성장에 부정적인 경우, 플레이트를 최대 21일 동안 인큐베이터에 다시 넣으십시오.

이것이 긍정적이면 첫 번째 웰을 터치하여 결과를 기록하면 각 약물의 화면에 성장이 표시되지 않습니다. 어떤 경우에는 박테리아, 침전물 또는 약물이 우물 바닥으로 침전됩니다. 트레일링(trailing)으로 알려진 이 현상은 동일한 크기의 펠릿을 가진 여러 개의 우물에 의해 표시되며 실제로 양의 성장으로 간주되지 않습니다.

다음으로, 7개의 H 10 및 혈액 한천 플레이트를 검사하여 박테리아 농도를 측정하고 순도를 평가합니다. 혈액 한천 플레이트는 48시간 후에 성장하지 않아야 합니다. 혈액 한천 플레이트의 성장은 빠르게 성장하는 박테리아에 의한 오염을 나타냅니다.

성장이 있는 경우 마이크로타이터 테스트를 반복해야 합니다. 7개의 H 10 순수성 판에는 1개의 유기체의 성장이 있어야 합니다. EM형 결핵은 담황색, 착색, 주름지고 거칠게 나타나야 합니다.오염된 경우 순수 배양에서 Microtiter 테스트를 반복해야 합니다.

박테리아 농도를 평가하려면 7개의 H 10 플레이트에 있는 콜로니를 세십시오. 그런 다음 함께 작성된 문서의 표를 사용하여 식민지 수를 계산합니다. Mycobacterium tuberculosis는 환자 표본에서 배양되었으며 항생제 내성은 여기에 표시된 플레이트의 이 비디오에 설명된 대로 평가되었으며, 12개의 서로 다른 약물이 농도가 증가함에 따라 농도가 증가하고 있으며 농도가 가장 높은 농도는 맨 위에, 가장 낮은 농도는 맨 아래에 있습니다.

약물의 최소 억제 농도 또는 MIC는 어떠한 성장도 보이지 않는 약물의 가장 낮은 농도로 표시되었으며, 임상 및 실험실 표준 연구소(Clinical and Laboratory Standards Institute)에서 설정한 표준화된 중단점을 사용하여 여기에 표시된 이미지에서 원으로 표시되어 있습니다. 여기에 나타난 데이터는 이 결핵 균주가 이시드와 리팜핀에 내성이 있음을 시사합니다. 시험관 내에서, oin, moxifloxacin, streptomycin 및 rifabutin을 포함한 여러 다른 약물에서 볼 수 있는 높은 마이크는 이러한 물질에 대한 EM 결핵 균주의 내성을 시사합니다.

MIC 결과는 결핵 치료에 경험이 있는 감염병 전문가가 개별화된 치료 계획을 개발하는 데 사용해야 합니다: 이 기술을 마스터하면 하나의 분리물을 설정하는 데 약 40분이 걸립니다. 이 절차를 시도하는 동안 이것이 호흡기 병원체라는 것을 기억하는 것이 중요하며 일단 점으로 에어로졸을 생성하면 이 비디오를 시청한 후 마이크로 브로스 희석 방법을 사용하여 결핵균, 항균 감수성 검사를 설정하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 결핵균을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 필요한 경우 항상 호흡기 보호와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.