두개골 방사선 치료에 의한인지 감소를 Quantifying

본 절차의 전반적인 목표는 두개골 방사선 조사에 의해 유도된 행동 및 인지 변화를 정량화하는 것입니다. 첫 번째 단계는 새로운 장소 인식 과제를 사용하여 해마 기반의 공간 인식 기억을 테스트하는 것입니다. 다음으로, 고가식 십자 미로 과제를 사용하여 불안 수준을 평가하고, 해마 및 편도체 의존적 맥락적 공포 조건화 과제를 사용하여 공포 기반 기억 형성을 평가하며, 이어서 편도체 의존적 단서 공포 조건화 과제를 측정합니다.

마지막 단계는 공간 학습, 공간 기억 및 역학습 능력을 평가하기 위해 모리스 수중 미로(Maurice Water Maze) 과제를 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 이 프로토콜은 두개강 방사선 조사로 인해 유발된 기분, 공간 및 비공간 학습과 기억의 변화뿐만 아니라 감각 운동 장애를 감지합니다. 이러한 방법은 두개강 방사선 조사가 행동과 인지에 미치는 영향에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

또한, 케모 브레인(chemo brain)이나 화학요법으로 인한 학습 및 기억 장애의 경우와 같이, 다른 치료의 원치 않는 부작용으로 인지 기능이 저하된 다른 상황에도 적용할 수 있습니다. 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 장비를 설정하고 최적화하는 데 시간이 많이 소요되므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 실험 절차가 엄격하게 제어되지 않으면 결과 해석이 어려울 수 있으며, 데이터의 변동성이 크면 대조군과 실험군 사이의 차이를 검출하기 어렵습니다.

이러한 방법론의 시각적 시연은 독자가 인지 테스트가 수행되는 실험실의 구성이나 세부 사항뿐만 아니라 적용된 구체적인 절차를 충분히 이해하는 데 매우 중요합니다. 동물을 일관되게 처리하기 위해, 먼저 테스트 환경을 철저히 세척하여 친숙화 단계를 시작하십시오. 70% ethanol로 동일한 플라스틱 블록 두 개를 닦아내고 이를 아레나 내의 특정 위치에 배치합니다. 동물을 아레나 중앙에 두고 자유롭게 탐색하도록 합니다.

5분 동안 탐색 행동을 점수화합니다. 자동 추적 시스템을 사용하여, 동물의 코가 블록의 반경 4cm 이내에 있고 블록을 향하고 있는 상태를 탐색으로 정의합니다. 시간이 종료되면 동물을 대기 케이지로 옮겨 5분 동안 더 유지합니다.

이 시간 동안 70% ethanol로 테스트 아레나를 세척합니다. 익숙해지기 단계 때와 동일한 공간적 위치에 블록 복사본 하나를 배치하고, 새로운 공간적 위치에 하나를 배치합니다. 5분의 지연 간격 후, 동물을 테스트 아레나에 다시 투입하여 5분간의 테스트 단계를 진행하며 3분 동안 자유롭게 탐색하도록 합니다.

친숙화 단계의 블록 공간 배치를 기억하고 있다면, 쥐는 새로운 공간 위치에 놓인 블록을 탐색하는 데 더 많은 시간을 소비할 것입니다. 다음 날, 동물들을 다시 아레나로 이동시킵니다. 24시간 후의 테스트 단계에서도 마찬가지로, 하나의 블록은 익숙한 위치에 두고 다른 하나는 새로운 위치에 배치합니다.

첫째, 동물을 아레나 중앙에 배치하고 3분 동안 탐색 행동을 기록합니다. 고가식 십자 미로(elevated plus maze)는 설치류의 불안 수준을 측정합니다. 테스트 전, 미로가 철저히 세척되었는지 확인하십시오.

먼저 동물을 미로의 중앙 부분에 두고 실험자와 반대 방향인 개방형 팔(open arm)을 향하게 한 뒤, 5분 동안 탐색하도록 합니다. 개방형 팔과 폐쇄형 팔(closed arm)의 진입 횟수 및 체류 시간은 자동 추적 소프트웨어를 사용하여 기록합니다. 쥐가 미로에서 떨어질 경우, 빠르게 개방형 팔 위로 다시 올려놓고 해당 사건을 기록합니다.

또한 모든 동결 행동과 그 가능한 원인들을 기록하십시오. 공포 조건화는 동물이 이전에 중립적이었던 자극에 대해 공포를 학습하는 행동 패러다임입니다. 첫째 날에 이를 유해 자극과 짝지어 줌으로써, 동물을 완전히 세척된 챔버 안에 넣으십시오.

세 단계로 구성된 훈련 시험을 시작합니다. 첫 번째는 5분간의 기저선 단계로, 이때는 훈련 단계 동안 전기 충격이나 톤을 가하지 않습니다. 이후 5분 동안 여러 차례의 톤-전기 충격 짝지어 제시를 수행합니다. 마지막으로, 훈련 후 단계에서 동물에게 다시 5분을 부여합니다.

충격이나 신호음이 없는 상태에서, 각 동물이 프리징(freezing) 상태로 머무는 시간의 비율을 기저 단계(baseline phase)의 마지막 60초와 훈련 후 단계(post-training phase)의 마지막 60초 동안 측정합니다. 24시간 후, 동물을 챔버로 다시 이동시켜 5분간 맥락 테스트(contextual test)를 수행하고, 테스트 1시간 후 프리징 상태로 머무는 시간의 비율을 기록합니다. 친숙한 맥락을 조성하기 위해 격자형 바닥을 제거하고, 챔버 외부에 패널을 추가하며, 향이 나는 가정용 세정제로 닦아냅니다.

단서 공포 조건화를 테스트하려면, 동물을 새로운 맥락에 배치하고 이전에 유해 자극과 짝지어진 톤의 유무에 따른 freezing 행동을 기록합니다. 모리스 수중 미로(Morris Water Maze)는 불투명한 물이 담긴 대형 풀에서 원격 단서를 사용하여 잠긴 탈출 플랫폼의 위치를 찾는 공간 학습 테스트입니다. 이 과제는 8일에 걸쳐 수행되며, 단서 테스트, 습득, 24시간 탐색 테스트, 그리고 역전 학습 테스트의 네 단계로 구성됩니다.

대기 중인 테스트를 시작하려면, 동물이 탈출 위치를 명확하게 인식할 수 있도록 플랫폼 중앙에 뚜렷한 흑백 깃발을 설치하십시오. 각 CUD 테스트 시행마다 동물을 수조 외곽의 서로 다른 미리 정해진 시작 위치에 배치하고, 플랫폼을 다른 구역으로 이동시키십시오. 네 번의 시행 각각에 대해 동물이 탈출 플랫폼을 찾을 수 있도록 30초의 시간을 부여하십시오.

최대 시간에 도달하면, 동물을 손으로 직접 안내하여 이동시킵니다. 동물을 따뜻한 케이지에 넣기 전 20초 동안 플랫폼 위에 머물게 합니다. 다음 날부터 5일 연속으로 하루에 4회씩 시행하는 습득 단계를 시작합니다.

이 단계에서는 숨겨진 플랫폼이 동일한 위치에 유지되며, 동물은 그곳으로 이동하는 방법을 학습합니다. 원거리 방 단서를 이용하여 동물을 미리 정해진 서로 다른 시작 지점에서 풀에 넣습니다. 각 시행마다 공간 학습의 척도로서 플랫폼을 찾는 데 걸리는 평균 잠복기와 이동 경로 길이를 기록합니다.

동물이 최대 수영 시간인 60초 이내에 탈출하지 못한 경우, 플랫폼으로 수동으로 안내하여 20초 동안 머물게 합니다. 마지막 훈련 시행 24시간 후에 플랫폼을 제거한 상태에서 62번째 탐색 시행(probe trial)을 실시하여, 이전에 플랫폼이 있었던 구역에 대한 동물의 선호도를 측정합니다. 이 탐색 시행 후, 플랫폼을 동일한 구역에 다시 배치하고 역전 학습(Reversal Learning) 테스트를 위해 세 차례의 추가 습득 시행을 진행합니다.

8일째에 플랫폼을 새로운 위치로 이동시킵니다. 동물을 풀에 넣고 이전 위치와 새로운 위치에서 플랫폼을 찾는 데 소비한 시간의 양을 측정합니다. 새로운 장소 인식 과제(Novel Place Recognition Task)에서 대조군 및 조사된 동물의 결과는 친숙화 단계 동안 두 위치가 동일하게 탐색되었음을 보여주었습니다.

그러나 대조군 동물들은 5분 및 24시간의 지연 시간 후 새로운 공간 위치에 대해 뚜렷한 선호도를 보인 반면, 방사선 조사 동물들은 그렇지 않았습니다. 고가식 십자 미로(elevated plus maze)에서 대조군과 방사선 조사 동물들은 우연히 기대되는 시간보다 오픈 암(open arms)을 탐색하는 시간이 더 적었습니다. 챔버에 처음 노출되었을 때의 프리징(freezing) 백분율은 다음 날 훈련 후 기간과 비교했을 때 매우 낮았습니다.

친숙한 맥락 내에서는 여전히 freezing 행동이 증가했으나, 조사(irradiated)된 동물을 새로운 맥락에 두었을 때 그 정도는 훨씬 낮았습니다. freezing 행동은 기저 수준으로 돌아왔으나, 모리스 수중 미로(Morris Water Maze)에서 톤(tone)을 제시하자 다시 증가했습니다. 과제 제어 동물은 조사된 동물에 비해 반복적인 시행을 통해 탈출 플랫폼을 더 빠르게 찾았습니다. 또한 조사된 동물은 24시간 후의 탐색 시험(probe trial)에서 플랫폼까지 도달하는 데 더 많은 시간과 더 긴 경로가 소요되었습니다. 플랫폼의 위치를 변경하는 역전 학습 테스트(Reversal Learning Test) 동안, 정상 동물은 점차 이전 사분면에서의 탐색을 중단하고 새로운 플랫폼 위치를 학습하는 반면, 조사된 동물은 그렇지 않았습니다.

이러한 과업을 수행하는 동안, 데이터 분석 전에 해결해야 할 추적 문제뿐만 아니라 모든 비정상적인 사건이나 행동에 대해 상세히 기록하는 것이 중요합니다. 실험동물을 다루는 일은 위험할 수 있으므로, 이러한 절차를 수행할 때는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 또한, 동물의 안전하고 윤리적인 사용을 위해 기관의 승인을 받고 기관 및 연방 가이드라인을 준수하는 것이 매우 중요합니다.