이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum
2011년 9월 20일
여기, 우리는 chemotaxis를 조사에 대한 자세한 라이브 셀 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 마이 그 레이션 세포에서 이벤트를 신호의 spatiotemporal 역학을 모니터 형광 현미경 방법을 제시한다. 신호 이벤트의 측정은 더욱 GPCR - 신호 네트워크 chemoattractants 및 제어 진핵 세포의 방향 이주 감지 기울기를 달성 방법을 이해하기 위해 우리를 허용합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 고급 형광 컨포칼 현미경을 적용하여 딕티오스텔리움 원반형 듐 세포에서 화학 감지 중 신호 이벤트의 시공간 역학을 모니터링하는 것입니다. 다음으로, 화학유인물질 농도와 형광 강도 화학유인물질 사이의 선형 관계를 확립하기 위해 제어된 화학유인물질 구배를 이미지화합니다. 세 번째 단계는 순환 A MP 기울기 감지와 관련된 신호 이벤트를 이미징하기 위한 부동식 세포 시스템을 얻는 것입니다.
마지막 단계는 살아있는 세포에서 두 개의 G PCR R 제어 신호 전달 이벤트, 이종삼합체 G-단백질 활성화 및 PIP 세 가지 생산을 동시에 모니터링하는 것입니다. 궁극적으로 화학 유인제로 시뮬레이션된 단일 세포의 형광 강도의 시공간 변화. Cyclic A MP는 고급 컨포칼 현미경을 사용한 라이브 셀 이미징을 통해 시각화할 수 있습니다.
이 기술의 주요 장점은 생명 세포의 신호 이벤트에 대한 공간적 시간 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이러한 생활습관 측정을 통해 A-G-P-C-R 신호전달 네트워크가 어떻게 화학요법 유인 성분을 검출하고 적절한 반응을 생성할 수 있는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 라이프스타일 이미징 방법의 전문가인 Dr.Shu가 시연할 것입니다: 섭씨 22도의 진탕 배양에서 D 3 트리크 배지에서 자라는 화학 유인 고리형 A MP 수확 세포에 화학주성인 dsco dium 세포를 생성합니다.
비영양 발달 완충액에서 400Gs에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다. 실온에서 resus는 DB 버퍼의 셀을 밀리리터당 7번째 셀의 2배10배의 밀도로 현탁합니다. 10밀리리터의 발달 완충액에 있는 2,000만 개의 세포를 250밀리리터 플라스크로 옮긴 다음 100RP M에서 섭씨 22도에서 1시간 동안 세포를 흔듭니다.
그런 다음 다음 6시간 동안 6분마다 100마이크로리터의 7.5마이크로몰 사이클릭 A MP 스톡을 10밀리리터의 세포에 전달하여 75 아노 몰 사이클릭 A MP의 최종 농도를 달성합니다. 이제 이번에는 200Gs에서 원심분리를 통해 고리형 A MP 화학유인 수용 세포를 수집한 다음 2.5밀리몰 카페인을 함유한 DB 버퍼로 세포를 다시 현탁합니다. 섭씨 22도에서 20분 동안 세포를 다시 흔듭니다. 이번에는 200RPM에서 화학주성을 위해 세포를 살리메이트합니다.
먼저 DB 버퍼에서 마이크로리터당 0.1마이크로그램의 속도로 1마이크로몰 사이클릭 A MP 및 Alexa 5 94의 갓 준비된 30ml 용액으로 마이크로 피펫을 백필합니다. 그런 다음 Femto 팁을 마이크로파이펫 홀더에 부착하고 튜브를 압력 공급 장치에 연결합니다. 안정적인 그래디언트를 설정하려면 마이크로 피펫 어셈블리를 전동 마이크로 매니퓰레이터에 부착하십시오.
1웰 실험실 기술 챔버에 6ml의 DB 버퍼를 채운 다음 시야의 Femto 팁인 Brightfield optics center를 사용하여 컨포칼 현미경의 40 x 오일 렌즈 위에 챔버를 장착합니다. 다음으로, 압력 공급 장치를 켜고 보상 압력을 70헥터 파스칼로 설정하여 순환 A MP Alexa 5 94 혼합물의 기울기를 설정합니다. 543 나노미터 레이저 라인의 여기를 사용하여 원하는 주기적 A MP 및 Alexa 5 94 형광 농도의 혼합물을 모니터링하여 주기적 A MP 구배를 시각화합니다.
마지막으로, 마이크로 매니퓰레이터의 자동 위치 지정 기능을 사용하여 마이크로 피펫을 원하는 위치에 놓고 위치 1, 위치 2 및 위치 3을 설정하여 세포가 노출되는 기울기를 조작합니다. 카페인 치료 후, 세포의 분취액을 제거하고 500Gs에서 3분 동안 세포를 펠렛으로 만듭니다. 실온에서 완충액을 제거하고 셀을 밀리리터당 5번째 셀의 10배로 희석합니다.
2.5 밀리몰 카페인을 함유 한 신선한 DB 버퍼. 그런 다음 1ml의 세포 현탁액을 단일 웰 챔버에 적용합니다. 세포가 10분 동안 부착되도록 한 후 완충액을 조심스럽게 피펫으로 분리하여 부착되지 않은 세포를 제거한 다음 동일한 부피의 새 DB 완충액으로 카페인으로 교체하여 이미징을 시작하고 현미경으로 원하는 세포를 찾습니다.
그런 다음 꾸준한 구배에 노출된 세포에서 신호 성분의 역학을 모니터링합니다. 실험하기 전에 10분 동안 5마이크로몰 LA truculent B로 세포를 처리합니다. 이 체계는 이 동영상에서 방향 감지의 간단한 신호 경로를 보여줍니다.
순환 A MP 구배가 PIP 3 프로브를 발현하는 세포인 D discost 세포의 빠른 화학주성을 유도하는 방법을 확인할 수 있습니다. P-H-G-F-P는 녹색으로 나타납니다. Alexa 5 94에 의해 시각화된 그라디언트는 빨간색으로 표시됩니다. 여기.
순환 A MP 농도와 형광 염료의 강도 사이의 선형 관계를 얻는 간단한 방법입니다. Alexa 5 94는 Alexa의 밀리리터당 10마이크로그램과 혼합된 2마이크로몰 순환 A MP의 희석 시리즈에 의해. 도 5 94가 표시되어 있습니다.
다음으로, Alexa 5 94의 강도에 의한 구배의 주기적 A MP 농도의 정량적 측정을 설정하는 쉬운 방법이 그래픽으로 시연됩니다. 이 그림은 액톤 중합 억제제인 lat truculent B에 의해 운동성이 억제된 세포가 어떻게 여전히 방향 감지 능력을 유지하는지 보여줍니다. 셀은 PIP 3 프로브, P-H-G-F-P를 발현하고 녹색으로 나타나며 빨간색 기울기는 Lexi 5 94에 의해 시각화됩니다.
이 영화에서는 비편광 단순화 세포 시스템과 조작 가능한 순환 A MP 자극을 사용하여 방향 감지에 대한 근본적인 질문을 해결할 수 있는 방법을 볼 수 있습니다. 빠른 속도의 공간 해상도를 가진 살아있는 세포 이미징의 응용을 보여주기 위해, 여기서는 PIP 3의 이위상 발현을 나타내는 녹색의 세포를 소개합니다. 꾸준한 주기에 대한 노출에 대한 응답으로 MP 구배가 빨간색으로 표시됩니다.
이 이미지는 PIP 3 생산의 동역학 측정을 위한 관심 영역을 보여줍니다. 꾸준한 구배에 노출되었을 때 세포의 앞면과 뒷면에서 PIP 3 생성의 동역학은 각각 검은색과 회색으로 표시된 앞면과 뒷면의 PIP 3 생성과 함께 여기에 제시되어 있습니다. 라이브 셀 이미징을 적용하여 주기적 A MP 자극에서 PIP 3 생성에 이르기까지 방향성 감지 특정 신호 네트워크의 역학을 체계적으로 측정했습니다.
이 방식은 주기적 A MP 자극에서 PIP 3 생성에 이르는 방향 감지의 신호 네트워크를 보여줍니다. 각 구성 요소의 역학은 동일한 색상의 선으로 표시됩니다. 이 첫 번째 그림에서는 균일하게 적용된 주기적 A MP 자극이 지속적인 G 단백질 활성화를 유발하는 방법을 보여 주며, 이는 일시적인 PIP 3 생성을 유발합니다.
G 및 pH 세포의 무지개 이미지는 균일하게 적용된 순환 A MP 자극이 세포 주변부에서 지속적인 G 단백질 활성화를 유발하며, 동시에 일시적인 PIP 3 생성을 유발한다는 것을 보여줍니다. 여기에서는 균일하게 적용된 순환 A MP 자극에 대한 G 단백질 활성화 및 PIP 3 생성의 동역학을 보여줍니다. 이러한 실험을 시도하는 동안 핵심은 반응성 세포, 세포의 다양한 유전적 배경 및 환경 조건을 얻는 것임을 명심하는 것이 중요합니다.
이미징 획득 조건은 모두 세포 생리학을 변화시키고 세포의 반응을 떨어뜨릴 수 있습니다. 이 절차에 따라 컴퓨터 모델링을 적용하여 신호 네트워크 내의 동적 상호 작용이 어떻게 세포 행동을 유발하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 진핵 화학 세금 분야의 연구자들을위한 길을 열어줍니다.
화학유인 물질 감지의 계산 모델을 개발할 수 있습니다. 이 모델은 신호 이벤트의 역학을 시뮬레이션하는 데 사용할 수 있습니다. 모델 개선과 라이프스타일 측정 간의 상호 작용은 화학 세금에 대한 더 깊은 이해로 이어질 수 있습니다.
이 동영상을 시청한 후 고급 형광 컨포칼 현미경을 적용하여 살아 있는 세포의 신호 전달 이벤트를 모니터링하는 방법을 더 잘 이해하셨기를 바랍니다. 이 방법을 공부에 적용할 수 있기를 바랍니다.
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개요
이 기사는 Dictyostelium discoideum 세포에서 화학택시스를 조사하기 위한 고급 생체 세포 이미징 방법을 설명합니다. 형광 현미경을 사용하여, 이 연구는 화학 흡인제에 반응하는 방향성 이동 동안 신호 전달 이벤트의 시공간 역학을 모니터링합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 이미징 기술
배경
- Dictyostelium discoideum은 화학택시스를 연구하기 위한 모델 유기체로 사용됩니다.
- GPCR 신호 전달 네트워크를 이해하는 것은 세포 이동 메커니즘을 설명하는 데 중요합니다.
- 형광 현미경은 세포 과정의 실시간 관찰을 가능하게 합니다.
- 기울기 감지는 환경 신호에 반응하는 방향성 이동에 필수적입니다.
연구 목적
- 고급 형광 공초점 현미경을 적용하여 화학택시스 중 신호 전달 이벤트를 모니터링합니다.
- 화학 흡인제 농도와 형광 강도 사이의 관계를 확립합니다.
- 생체 세포에서 신호 전달 이벤트의 시공간 변화를 시각화합니다.
사용된 방법
- 화학택시스에 적합한 Dictyostelium discoideum 세포 준비.
- 제어된 화학 흡인제 기울기 이미징.
- 이미징을 위한 고정 세포 시스템 확립.
- G-단백질 활성화 및 PIP3 생산의 동시 모니터링.
주요 결과
- 생체 세포에서 주기적 AMP 기울기 감지의 성공적인 시각화.
- 신호 전달 이벤트의 시공간 역학 시연.
- 화학 흡인제 농도와 형광 강도 사이의 선형 관계 확립.
- 진핵 세포의 방향성 이동 메커니즘에 대한 통찰력.
결론
- 이 연구는 세포 수준에서 화학택시스를 이해하기 위한 틀을 제공합니다.
- 고급 이미징 기술은 중요한 신호 역학을 밝힐 수 있습니다.
- 연구 결과는 세포 이동 메커니즘에 대한 더 넓은 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding GPCR-mediated chemotaxis signaling networks provides predictive value for target validation in immune cell trafficking and inflammatory disease models. The imaging approach enables mechanistic de-risking by resolving spatiotemporal dynamics of heterotrimeric G-protein activation and PIP3 production, key nodes in eukaryotic directional sensing. This supports early discovery decisions by linking receptor engagement to downstream effector pathways with quantitative, single-cell resolution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates GPCR-triggered G-protein dissociation as a proximal event in chemotaxis pathway validation.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of heterotrimeric G-protein activation kinetics in live cells under controlled gradient conditions.
- Predictive Value: Correlates GPCR stimulation with transient PIP3 production, informing on PI3K pathway engagement and signal fidelity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a linear relationship between chemoattractant concentration and fluorescent intensity for quantitative gradient sensing.
- Operational Value: Provides an immobile cell system compatible with high-resolution confocal imaging for consistent signal detection.
- Assay Readiness: Supports preparation of chemotactically competent cells for reproducible stimulation and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrates evolutionary conservation of GPCR-βγ-Ras-PI3K-PTPN signaling in human leukocyte chemotaxis.
- Mechanistic De-risking: Visualizes spatiotemporal PIP3 dynamics at the leading edge, linking receptor activation to cytoskeletal remodeling.
- Pathway Clarification: Resolves temporal order of persistent G-protein activation followed by transient PIP3 production during gradient sensing.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling real-time, single-cell analysis of GPCR signaling dynamics, supporting hypothesis testing and pathway validation before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports interrogation of GPCR-mediated heterotrimeric G-protein activation as a function of chemoattractant gradient exposure.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts for chemoattractant concentration and PIP3 production, enabling dose-response and kinetic profiling.
- Analytics: Provides spatiotemporal fluorescence intensity measurements that allow comparison of signaling kinetics between cellular compartments.
- Translational Research: Connects Dictyostelium GPCR signaling to human neutrophil chemotaxis via conserved PIP3-dependent effector recruitment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for monitoring GPCR effector pathways across multiple chemotaxis models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic insight into GPCR signal propagation from receptor to second messenger production in live cells.
- Operational Value: Standardized preparation of chemotactically competent cells and gradient generation for reproducible imaging.
- Strategic Value: Reduces ambiguity in target pathway activation by resolving concurrent signaling events with temporal resolution.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of GPCR targets based on pathway engagement and signal dynamics.
Implementation Considerations
- Expertise in live cell fluorescence microscopy and chemotaxis assay preparation.
- Access to confocal microscopy with laser excitation and gradient generation hardware.
- Standardization of cell density, chemoattractant dosing, and caffeine treatment for motility control.
- Adaptation considerations for expressing fluorescent biosensors (e.g., PH-GFP, Alexa 594) in diverse model systems.
- Limitations include phototoxicity risks during prolonged imaging and variability in cell responsiveness due to genetic or environmental factors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Chemotactic Competent Cells of Dictyostelium discoideum
2:57
Imaging Chemotaxing Cells in a Visible and Manipulatable Chemoattractant Gradient
4:16
Immobile Nonpolarized Cell Systems Facilitate Imaging Signaling Events Involved in cAMP Gradient Sensing
5:05
Representative Images of cAMP Gradient-induced PIP3 Expression
7:58
Conclusion
