Name: 이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 Dictyostelium discoideum에서 화학주성을 연구하는 고급 형광 공초점 현미경법을 사용하여 GPCR 신호 전달 동역학을 실시간으로 관찰하는 방법입니다.

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이 작품은 NIAID, NIH에서 교내 기금에 의해 지원됩니다.

1. Dictyostelium의 discoideum의 chemotactic 관할 세포의 준비 <ol><li> chemoattractant 캠프 22 떨고 문화 D3 - T 리치 미디어의 성장 수확 전지 ° C.에 chemotactic 아르 D.의 discoideum 세포를 생성하려면 </li><li> (DB 버퍼 5 MM 나 2 HPO 4, 5 MM KH 2 PO 4, 2 MM MgCl 2, 0.1 MM CaCl 2 포함) 이외의 영양 발달 버퍼에 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 2x10 7 셀 / ML의 밀도에 DB 버퍼의 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 한 시간 만이라도 22 100 RPM ° C에서 250 ML 플라스크 10 ML 세포를 흔들어. </li><li> 75 NM 캠프의 최종 농도, 캠프 pulsing 치료로 지정된 프로세스를 달성 6 시간 이상 매 6 분마다 10 ML 세포에 7.5 μm의 캠프 주식 100 μl를 제공합니다. 캠프 pulsing 처리, D.의 5~6시간 후 discoideum 전지 캠프 기울기 방향으로 능력 chemotactic된다. </li><li> 5 분 200g에서 원심 분리하여 세포를 수집하고 DB 버퍼로 resuspend 셀 2.5 MM의 카페인을 포함, 22에서 200 rpm으로 흔들 ° C를 20 분에 대한 chemotactic 상황에 셀 basolate 수 있습니다. </li></ol> 2. 가시와 manipulatable chemoattractant 기울기의 이미징 chemotaxing 세포 <ol><li> 1 μm의 캠프 및 DB 버퍼에 0.1μg/μl에서 알렉사 594의 신선한 30 μl 솔루션 Backfill은 micropipette. </li><li> micropipette 홀더에 Femtotip를 첨부하고 압력 공급 장치로 튜브, Eppendorf FemtoJet 시스템을 연결합니다. </li><li> 안정적인 경사도를 확립하기 위해 지속적으로 압력을 제공하기 위해 micromanipulator를 전동 micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2)로 micropipette 어셈블리를 연결합니다. </li><li> 공촛점 현미경에 기름 40X 렌즈를 통해 DB 버퍼 6 ML 가득한 한 잘 LabTek 챔버를 마운트하고 볼 분야에 밝은 필드 광학, 센터 Femtotip을 사용합니다. </li><li> 압력 공급 장치의 전원을 켜고 캠프 / 알렉사 594 혼합물의 그라디언트를 확립 70 고전력 증폭기에 대한 보상 압력 (PC)를 설정합니다. </li><li> 캠프와 543 nm의 레이저 라인을 사용하여 여기 알렉사 594 형광 원하는 농도의 혼합 모니터링하여 캠프 그라데이션을 시각화. </li><li> 원하는 위치로 micropipette를 놓고 1 순위, 위치 2, 및 세포를 노출하기 위해 경사도를 조작하는 3 순위로 설정하는 micromanipulator의 자동 위치 기능을 사용하십시오. </li></ol> 3. 고정되어 nonpolarized 전지 시스템 야영 기울기 감지에 관여 영상 신호 이벤트를 용이하게 <ol><li> 카페인 치료 후, 3 분 500g에 세포 원심 분리기의 나누어지는를 제거합니다. </li><li> 버퍼를 제거하고 2.5 MM의 카페인을 포함하는 신선한 DB 버퍼와 5x10 5 셀 / ML로 세포를 희석. </li><li> 4 잘 챔버 각각 잘 수있는 단일 잘 챔버 또는 0.4 ML에 세포 현탁액 1 ML을 적용합니다. </li><li> 10 분 동안 신중하게 무소속의 세포를 제거하고 동일한 볼륨 대체 버퍼를 피펫 세포가 준수하도록 허용합니다. </li><li> 현미경 원하는 세포를 찾아 이미지를 시작합니다. </li><li> 꾸준한 그라데이션에 노출 세포의 구성 요소를 신호의 역학을 모니터하기위한 실험은 실험하기 전에 10 분 5.0 μm의 (최종 농도) Latrunculin B와 세포를 치료. </li></ol> 4. 동시 모니터링 heterotrimeric G 단백질 활성화 및 PIP 3 생산 <ol><li> CAMP 세포 공동 표현 GαCFP 및 YFPGβ을 (G 세포)와 세포 PIP 3 표시기 PH - GFP (PH 세포)가 7 표현.을 개발 pulsing </li><li> 1시 1분 비율 및 플레이트들을 한 잘 또는 4 - 음 실에서 함께 세포의 이러한 두 종류를 섞습니다. </li><li> 작성하고 10 나노미터 넓이로 464에서 624 nm의에 대한 스펙트럼 범위 내에서 람다 스택 수집 모드를 사용하여 방출 지문 참조 곡선 CFP, YFP와 GFP를 저장합니다. </li><li> G 세포와 464에서 10 nm의 증가와 544 nm의에 대한 스펙트럼 범위 내에서 동일한 람다 스택 수집 모드를 사용하여 PH 세포에서 PIP 3 제작에 동시에 이미지 G 단백질 활성화. </li><li> G.에서 개별 채널에 CFP와 YFP 강도를 분리 수학적 람다 스택의 각 형광단의 기여를 계산에 저장 CFPand YFP 및 방출 지문을 사용하여 자이스 혈구 510META 소프트웨어의 선형 Unmixing 기능을 적용 </li><li> 같은 전략을 통해 수학적 PH 세포에 GFP 강도를 계산에 저장 GFP 배경 방출 지문을 사용하여 선형 Unmixing 기능을 적용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : <ol><li> D.의 훌륭한 모델 시스템 GPCR 중재 chemotaxis에 대한 discoideum. 사회 아메바, D. discoideum는 수명주기 동안 인상적인 chemotaxis를 전시하고 있습니다. 의 유전자 및 생화 학적 이점으로 인해, D. D는 강력한 s을 (를) 제공ystem는 chemotaxis를 연구하기 위해 서요. </li><li> 가시와 manipulatable chemoattract 필즈 세포의 Chemotaxis. 여기, 우리는 처음 10 μg / ML 혼합 2 μm의 캠프의 희석 시리즈 캠프 농도와 형광 염료 알렉사 594의 강도 사이의 선형 관계를 얻을 수있는 간단한 방법을 보여 알렉사 594 (그림 2A). 다음, 우리는 알렉사 594 (그림 그림. 2B)의 강도에 의해 그라디언트의 캠프 농도의 양적 측정을 수립, 또한, 그라디언트를 시각화하는 쉬운 방법을 제공합니다. </li><li> 세포 운동성가. 전지 분극 및 방향 감지와 uncoupled 굴지의 중합 억제제는 기존의 형태학의 극성을 제거하고 방향 감지의 세포 '능력 (그림 3A)를 유지하면서 또한 세포의 움직임을 방지합니다. 표시 및 manipulatable 캠프 자극의 고용 예를 균일하게 적용 stimulations하거나 그라데이션을 위해 입력을 보장합니다. 이 방법은 그라디언트 감지 기기의 주요 신호 구성 요소 CAMP 유발 재배포의 정량 분석​​이 가능합니다. 이러한 신호 구성 요소의 측정 spatiotemporal 역학은 우리가 그라디언트 (그림 3B)에 편광 생화 학적 반응을 생성하는 동안 신호 네트워크가 균일한 stimulations에 적응을 실현 방법을 이해하실 수 있습니다. </li><li> 안정된 구배에 노출시 신호 네트워크를 chemosensing의 속도론의 체계적 측정. 방향 - 감지은 세포가 처음 그라디언트가 발생할 때 각 구성 요소는 세포 분극의 설립에 기여하는 방법 구성 요소를 이해하기 위해 신호의 역학 / 속도론을 측정하는 중요한 그것입니다. 높은 템포 - 공간 해상도 라이브 셀 이미징의 응용, 우리는 먼저 꾸준한 캠프 기울기 (그림 4A - C)에 노출된 세포의 biphasic PIP3 생산을 보여줍니다. 라이브 셀 이미징을 적용, 우리는 체계적으로의 역학을 측정해야 방향 감지 PIP3 제작 (그림 4D, E)에 캠프 자극에서 특정 신호를 네트워크를. </li><li> 균일하게 적용 캠프 자극에 동시 모니터링 heterotrimeric G 단백질 활성화 및 PIP 세 생산. 포스터 공명 에너지 전송 (약식은 무서워) 캠프 자극시 heterotrimeric G 단백질 활성화 (분리)를 모니터링하는 효율적인 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 (그림 5 변화와 PIP의 멤브레인 translocation 각각 3 프로브, G 및 PH 세포에서 PH - GFP를 걱정 모니터링하여 heterotrimeric G 단백질 활성화 및 PIP 세 생산의 동시 측정을위한 편리한 쉽게 채택할 시스템을 설명 ). 어떤이 일시적 PIP 세 생산을 실행하는 동안 균일하게 적용 캠프 자극이 지속 G 단백질 활성화를 트리거합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : D.의 훌륭한 모델 시스템 GPCR의 중재를 chemotaxis에 대한 discoideum. A. 제도 방향 감지의 간단한 신호 경로를 보여줍니다. B. 캠프 그라디언트가 D.의 빠른 chemotaxis를 유도 discoideum 세포. 세포는 PIP 3 프로브, PH - GFP (녹색)을 표현한다. 그라데이션 (레드) 594 알렉사에 의해 시각입니다. 스케일 바 = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 가시와 manipulatable chemoattract 필즈 세포의 Chemotaxis. A. 그래프는 10 μg / ML 알렉사 594 혼합 2 μm의 캠프의 희석 시리즈 캠프 농도와 형광 염료 알렉사 594의 강도 사이의 선형 관계를 보여줍니다. 선형 관계에 의해 그라디언트의 캠프 농도 B. 양적 측정 A에서 형광 염료 알렉사 594의 캠프 농도와 강도의 <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 세포 운동성가 세포 분극 및 방향 감지와 uncoupled 있습니다. A. 이미지 굴지 중합 억제제 Latrunculin B의 치료에 의해 ​​고정되어 세포가 방향 감지의 기능을 유지할 것으로 나타났습니다. 세포는 PIP 3 프로브, PH - GFP (녹색)을 표현한다. 그라데이션 (레드) 594 알렉사에 의해 시각입니다. B. Manipulatable 캠프 자극과 고정되어 전지 시스템은 방향 감지의 핵심 질문을 해결하실 수 있습니다. 스케일 바 = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : 지속적인 그라디언트에 노출시 신호 네트워크를 chemosensing의 속도론의 체계적 측정. A. 몽타쥬는 꾸준한 캠프 기울기 (적색)에 노출된 세포의 biphasic PIP 3 제작 (녹색). B. 이미지 C. C로 표시 PIP 세 생산의 속도론의 측정에 대한 관심 영역 (ROIs)를 보여줍니다 보여줍니다 . 동력학 O꾸준한 그라데이션에 노출 세포의 F PIP 세 생산. D. 제도 PIP 3 제작 캠프 자극의 방향 감지의 신호 네트워크를 보여줍니다. 안정된 구배에 노출시 그들의 운동은 E에서 동일한 색상 고체 라인에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 : GPCR 신호 네트워크의 동시 모니터링 멀티 이벤트. A. 제도 변화와 각각 PIP3 프로브, G 및 PH 세포에서 PH - GFP의 멤브레인 translocation을 걱정 모니터링하여 heterotrimeric G 단백질 활성화 및 PIP 세 생산의 동시 측정을 보여줍니다. G와 PH 세포의 무지개 이미지 B. 장면 보여줍니다 어떤이 과도 PIP3 생산을 실행하는 동안 균일하게 적용 캠프 자극은 주변 세포에 영구 G 단백질 활성화를 트리거 것을. 시간 점 4.9s, 10.2s 및 20.4s에 대한 전 (개로) 및 자극 후 수 있습니다. G 단백질 활성화하고 균일하게 적용 캠프 자극시 PIP3 생산 C. 속도론가.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
<li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li>
<li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li>
<li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li>
<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li>
<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포의 chemotactic 관할 단계에 도달하는 과정 야생 유형 D. discoideum 세포, 그건 소요 약 5 세포가 잘 편광 세포 형태학 및 신속한 세포 마이 그 레이션 (그림 1)을 표시하는 동안 잘 chemotactic 관할 무대로 그들을 유도하기 위해 상온에서 개발을 pulsing ~ 6 시간. 이러한 pulsing, 온도 및 다른 유전 배경에 대한 캠프 농도 등 여러 가지 요인은, chemotactic 유능한 단계에 도달하는 과정에 영향을 줄 수 있습니다. 캠프 기울기 가이드는 세포가 캠프의 소스​​, chemotaxis 지정 지시 셀 마이 그 레이션쪽으로 이동합니다. 편광 형태학 및 급속한 세포의 움직임 그러나 부족 개발 또는 그들의 유전자를 배경으로 인해 chemotactic 유능한 단계에 도달하지 않은 세포는 두 전형적인 기능을 표시하지 않을 수 있습니다. 한편, 때문에 이상 개발의 chemotactic 관할 무대를 통과 세포는 종종 영상 실험에...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> D3 - T 성장 미디어 </td><td> KD 의료 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 카페인 </td><td> 시그마 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> 분자 프로브 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 594 </td><td> 분자 프로브 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CAMP </td><td> 시그마 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT 프로그램 타이머 </td><td> ChronTrol 법인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 세 연동 펌프 </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 플랫폼 로터리 흔드는 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microcapillary 압력 공급 장치 </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단일, 4 잘 연구실 - 테크 II coverglass 챔버 </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META 또는 동급 형광 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td><td> 40X 1.3 NA 또는 60X 1.4 NA 오일 DIC 계획 - Neofluar 목표 렌즈 </td></tr><tr><td> 올림푸스 X81 또는 동급 </td><td> 하늘 </td><td></td><td> 100X 1.47 NA TIRF 객관적인 렌즈를 필요 </td></tr></tbody></table>

이미징 g - 단백질 결합 수용체 (gpcr) - 중재 신호 행사 그 제어 chemotaxis dictyostelium discoideum</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

대부분의 진핵세포 세포는 자신의 환경에서 화학적 신호의 기울기를 감지하고 이에 따라 1 마이그레이션할 수 있습니다. 이 가이드 셀 마이 그 레이션은 이러한 세포의 연결 2, 3의 면역 세포와 patterning의 인신 매매는 그들의 기능을 수행하는 다양한 세포에 필수적인 것입니다 chemotaxis로라고합니다. G - 단백질 결합 수용체의 큰 가족 (GPCRs)는 생체내 4 셀 마이 그 레이션을 직접하기 위해 chemokines로 알려진 변수 작은 펩티드를 감지합니다. chemotaxis 연구의 최종 목표는 GPCR 기계 감각의 케모카인 그라디언트와 컨트롤 chemotaxis에 선도적인 이벤트를 신호 방법을 이해하는 것입니다. 이를 위해, 우리는 실시간으로, chemoattractant의 그라데이션에 chemoattractants, 세포 운동의 spatiotemporal 농도를 모니터링하는 이미징 기술을 사용, GPCR은 heterotrimeric G - 단백질의 활성화를 중재하고, 5-8 진핵 세포의 chemotaxis에 관련된 세포내 신호 이벤트 . 간단한 진핵 생물, Dictyostelium의 discoideum은 leukocytes의 것과 유사 chemotaxic 동작을 표시하고, D. discoideum는 진핵세포 chemotaxis를 공부에 대한 핵심적인 모델 시스템입니다. 자유 생활 amoebae, D.으로 discoideum 세포가 풍부한 매체 나눕니다. 기아되면 세포들은 multicullular 구조를 형성 CAMP - 중재 chemotaxis를 통해 집계되는 발달 프로그램을 입력합니다. 캠프 chemotaxis에 관련된 대부분의 구성 요소 D.으로 확인되었습니다 discoideum. GPCR에 캠프의 바인딩 (cAR1)는 Gγ 및 Gβγ의 subunits 7, 9, 10로 heterotrimeric의 분리 G - 단백질을 유도. Gβγ subunits는 회전 활성화의 PI3K에서, 세포막 11-13에 PIP 3에 PIP 2 변환 RAS를 활성화해야합니다. PIP 3 따라서 멤브레인 14, 15 이러한 단백질을 모집, pleckstrin의 상동 (PH) 도메인과 단백질에 대한 구속력이 사이트의 역할을합니다. cAR1 수용체의 활성화는 또한 PIP 2 16, 17 PIP 3 dephosphorylates PTEN의 멤브레인 연결을 제어합니다. 분자 메커니즘은 evolutionarily 같은 neutrophils 18 인간 세포의 케모카인 GPCR - 중재 chemotaxis에 보존되어있다. 우리는 D.의 chemotaxis를 공부에 대한 다음과 같은 방법을 제시 discoideum 세포. 1. chemotactic 컴포넌트 세포의 준비. 2. 캠프 기울기에 세포의 영상이 chemotaxis. 3. 한 살 세포에서 G - 단백질 heterotrimeric의 GPCR 유도된 활성화를 모니터링. 4. 실시간으로 한 라이브 세포 이미징 chemoattractant - 트리거 다이나믹 PIP 3 응답. 우리 개발한 이미징 방법은 인간 leukocytes의 chemotaxis을 연구에 적용할 수 있습니다.

여기, 우리는 chemotaxis를 조사에 대한 자세한 라이브 셀 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 마이 그 레이션 세포에서 이벤트를 신호의 spatiotemporal 역학을 모니터 형광 현미경 방법을 제시한다. 신호 이벤트의 측정은 더욱 GPCR - 신호 네트워크 chemoattractants 및 제어 진핵 세포의 방향 이주 감지 기울기를 달성 방법을 이해하기 위해 우리를 허용합니다.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

많은 진핵세포는 주변 환경의 화학적 신호 구배를 감지하고 그에 따라 이동할 수 있습니다 1. 이러한 유도된 세포 이동을 ...라고 합니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 고급 형광 공초점 현미경을 적용하여 dictyostelium discoid dium 세포의 화학 감지 과정 중 발생하는 신호 전달 이벤트의 시공간적 역동성을 모니터링하는 것입니다. 먼저, 화학 주성 능력을 갖춘 dictyostelium discoid dium 세포를 준비합니다. 다음으로, 조절된 화학 유인물질 구배를 이미징하여 화학 유인물질의 농도와 형광 강도 사이의 선형 관계를 설정합니다. 세 번째 단계는 cyclic A MP 구배 감지에 관여하는 신호 전달 이벤트를 이미징하기 위해 이동하지 않는 세포 시스템을 구축하는 것입니다.마지막 단계는 살아있는 세포 내에서 G PCR R 조절 신호 전달 이벤트인 heterotrimeric G-protein 활성화와 PIP three 생성을 동시에 모니터링하는 것입니다. 궁극적으로 화학 유인물질로 자극된 단일 세포 내 형광 강도의 시공간적 변화를 확인할 수 있습니다. Cyclic A MP는 고급 공초점 현미경을 이용한 살아있는 세포 이미징을 통해 시각화할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포 내 신호 전달 사건에 대한 시공간적 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이러한 생체 내 측정은 AGPCR 신호 전달 네트워크가 어떻게 화학 유인 물질 성분을 감지하고 적절한 반응을 생성하는지에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 합니다. 시연은 생체 이미지 분석법 전문가인 Dr.Shu가 진행하겠습니다. 화학 유인 물질인 cyclic AMP에 대해 화학 성성을 갖는 Dictyostelium 세포를 생성하기 위해, 22 °C의 진탕 배양기에서 D3 trich 배지로 배양 중인 세포를 수확합니다.400 Gs에서 5분 동안 원심분리하여 비영양 발달 버퍼(non nutrient developmental buffer)로 세포를 두 번 세척합니다. 실온에서 세포를 2 × 10⁷ cells/mL 밀도의 DB 버퍼에 다시 현탁합니다. 발달 버퍼 10 mL에 담긴 2,000만 개의 세포를 250 mL 플라스크로 옮긴 후, 22 °C에서 100 RPM으로 1시간 동안 흔들어 섞어줍니다.그 다음, 최종 농도가 75 nM cyclic AMP가 되도록 향후 6시간 동안 6분마다 10 mL의 세포에 7.5 µM cyclic AMP 스톡 100 µL를 투여합니다. 이제 원심분리기를 사용하여 200 ×g에서 cyclic AMP 화학 유인 물질에 반응하는 세포를 수집한 다음, 2.5 mM 카페인이 포함된 DB 버퍼로 세포를 재현탁합니다. 화학주성을 위해 세포를 22 °C에서 200 RPM으로 20분 동안 다시 흔들어 섞어줍니다.먼저 1 µM cyclic AMP와 0.1 µg/µL Alexa 594가 포함된 DB 버퍼 내의 30 mL 신선하게 조제된 용액으로 마이크로 피펫을 백필합니다. 그다음 펨토 팁(Femto tip)을 마이크로 피펫 홀더에 장착하고 튜빙을 압력 공급 장치에 연결합니다. 안정적인 구배를 형성하기 위해, 마이크로 피펫 어셈블리를 전동 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다.1구 랩테크 챔버(lab tech chamber)에 DB 버퍼 6 mL를 채운 다음, 명시야 광학계를 사용하여 공초점 현미경의 40x 오일 렌즈 위에 챔버를 장착하고 펨토 팁(Femto tip)이 시야에 들어오게 합니다. 이어서 압력 공급 장치를 켜고 보정 압력을 70 hPa로 설정하여 cAMP Alexa 594 혼합물의 구배를 형성합니다. 543 nm 레이저 라인으로 여기시켜 원하는 농도의 cAMP와 Alexa 594 형광 혼합물을 모니터링함으로써 cAMP 구배를 시각화합니다.마지막으로, 마이크로 매니퓰레이터의 자동 위치 지정 기능을 사용하여 마이크로 피펫을 원하는 위치에 배치하고, 세포가 노출되는 기울기를 조절할 수 있도록 위치 1, 위치 2, 위치 3을 설정합니다. 카페인 처리 후, 세포의 일부를 취해 500 Gs에서 3분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 상온에서 버퍼를 제거하고 세포를 mL당 5 × 10⁵ cells 농도로 희석합니다.2.5 mM caffeine이 포함된 신선한 DB 버퍼를 사용합니다. 그 후, 세포 현탁액 1 mL를 단일 웰 챔버에 분주합니다. 세포가 부착될 때까지 10분 동안 기다린 후, 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 버퍼를 조심스럽게 피펫으로 제거합니다. 이어서 동일한 부피의 caffeine이 포함된 신선한 DB 버퍼로 교체하여 이미징을 시작하고, 현미경으로 원하는 세포를 찾습니다.그런 다음, 일정 농도 기울기에 노출된 세포 내 신호 전달 구성 요소의 역학을 모니터링합니다. 모든 실험을 시작하기 전, 세포를 5 µM LA truculent B로 10분 동안 처리하십시오. 이 도식은 본 영상에서 다루는 방향성 감지의 간략한 신호 전달 경로를 보여줍니다.PIP three 프로브를 발현하는 D discost 세포의 신속한 화학주성이 cyclic A MP 농도 구배에 의해 어떻게 유도되는지 확인할 수 있습니다. P-H-G-F-P는 녹색으로 나타납니다. Alexa 5 94로 시각화한 농도 구배는 적색으로 나타납니다.cyclic AMP 농도와 형광 염료의 강도 사이의 선형 관계를 얻는 간단한 방법입니다. 2 µM cyclic AMP를 10 µg/mL Alexa 594와 혼합한 희석 계열을 통해 Alexa 594를 처리하는 과정이 제시되어 있습니다.다음으로, Alexa 594의 강도를 통해 기울기에 따른 cyclic AMP 농도를 정량적으로 측정하는 간편한 방법이 도식적으로 제시됩니다. 이 그림은 액틴 중합 억제제인 latrunculin B에 의해 운동성이 억제된 세포들이 여전히 방향성 감지 능력을 유지하고 있음을 보여줍니다. 세포는 PIP3 프로브인 PH-GFP를 발현하여 녹색으로 나타나며, 적색의 기울기는 Alexa 594로 시각화됩니다.본 영상에서는 비편극화된 단순화된 세포 시스템과 조절 가능한 cyclic AMP 자극을 이용하여 방향성 감지의 근본적인 질문들을 어떻게 해결할 수 있는지 확인할 수 있습니다. 높은 시공간 해상도의 살아있는 세포 이미징 응용 사례를 보여주기 위해, 여기서는 빨간색으로 표시된 일정한 cyclic AMP 구배에 노출되어 PIP three의 이상성 발현을 보이는 녹색 세포를 보여줍니다.이 이미지는 PIP3 생성 역학 측정을 위한 관심 영역을 보여줍니다. 일정 농도 구배에 노출되었을 때 세포의 앞부분과 뒷부분에서 일어나는 PIP3 생성 역학이 여기에 제시되어 있으며, 앞부분과 뒷부분의 PIP3 생성은 각각 검은색과 회색으로 표시되었습니다. 살아있는 세포 이미징을 적용하여, cAMP 자극부터 PIP3 생성에 이르기까지 방향성 감지 특이적 신호 전달 네트워크의 역학을 체계적으로 측정하였습니다.이 모식도는 cyclic AMP 자극부터 PIP3 생성까지의 방향성 감지 신호 전달 네트워크를 보여줍니다. 각 구성 요소의 역학은 동일한 색상의 선으로 표시되어 있습니다. 첫 번째 영상에서는 균일하게 가해진 cyclic AMP 자극이 어떻게 지속적인 G 단백질 활성화를 유발하고, 이것이 다시 일시적인 PIP3 생성을 일으키는지가 나타나 있습니다.G 및 pH 세포의 다채로운 이미지들은 균일하게 적용된 cyclic AMP 자극이 세포 주변부에서 지속적인 G-단백질 활성화를 유발하며, 동시에 일시적인 PIP3 생성을 촉발한다는 것을 보여줍니다. 여기에서는 균일하게 적용된 cyclic AMP 자극에 따른 G-단백질 활성화와 PIP3 생성의 역학이 나타나 있습니다. 이러한 실험을 수행할 때, 세포의 서로 다른 유전적 배경과 환경 조건에 따라 반응성 있는 세포를 확보하는 것이 핵심이라는 점을 유념하는 것이 중요합니다.이미징 획득 조건은 모두 세포 생리에 변화를 주어 세포의 반응성을 낮출 수 있습니다. 본 절차 이후, 신호 전달 네트워크 내의 동적인 상호작용이 어떻게 세포 행동을 유발하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 컴퓨터 모델링을 적용할 수 있습니다. 이러한 방법들은 진핵생물 화학성으로(chemo taxes) 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어줄 것입니다.화학유인물질 감지에 대한 계산 모델을 개발할 수 있습니다. 이 모델은 신호 전달 이벤트의 역학을 시뮬레이션하는 데 사용될 수 있습니다. 모델의 정교화와 라이프스타일 측정 사이의 상호작용은 화학성(chemotaxis)에 대한 더 깊은 이해로 이어질 수 있습니다.이 영상을 통해 살아있는 세포 내의 신호 전달 이벤트를 모니터링하기 위해 고급 형광 공초점 현미경을 적용하는 방법에 대해 더 잘 이해하셨기를 바랍니다. 이 방법을 귀하의 연구에 응용하시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

ECIS / 택시 시스템은 세포 chemotaxis를 측정하는 자동화된 실시간 분석이다. 본 분석에서는 세포 표적 전극에 도착하는 아가로 오스의 레이어 아래로 이동합니다. 세포 운동은 AC 전류를 0으로 저항의 발병에 의해 측정됩니다.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

정량의 화학 주성 반응을 평가하는...

C. elegans의 주 화성 분석

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

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Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

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Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

학습하세요 Dictyostelium discoideum에서 화학주성을 연구하는 고급 형광 공초점 현미경법을 사용하여 GPCR 신호 전달 동역학을 실시간으로 관찰하는 방법입니다.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum

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