초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

여기에 제시된 기술의 전반적인 목표는 초기 병아리 배아의 배양을 위해 초기 발달 과정에서 형태 유전학적 변형을 측정하기 위해 배아 조직을 라벨링하고 배양하는 것이며, 먼저 여과지 캐리어 방법을 사용하여 난자에서 배아를 제거하는 것으로 시작합니다. 실험 응용 분야에 따라 추출된 배아에 자성 철 입자를 통해 전달되는 형광 친유성 염료 또는 폴리스티렌 미세구로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 형광 현미경 검사 또는 광간섭 단층 촬영 이미징을 사용하여 배양 중 라벨을 추적합니다.

이미징 결과 형태 유전 변형 맵은 2 차원 및 3 차원 모두에서 조직 신장, 단축 및 전단 영역을 나타냅니다. 안녕하세요, 제 이름은 벤 필리스이고 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교 의생명공학과 래리 타보르 박사의 연구실에서 근무하는 대학원생입니다. 이러한 유형의 실험을 시작하기 전에 모델 시스템에서 관련 조직 배양 기술, 액세스할 수 있는 이미징 양식 및 실험에서 원하는 데이터 유형을 고려하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 2차원 또는 3차원으로 조직 변형을 분석하는 데 관심이 있습니까? 오늘 우리는 초기 병아리 배아에서 두 가지 보완적인 표지 기술을 보여줌으로써 이러한 질문 중 일부를 다룹니다. 안녕하세요, 제 이름은 Victor Varner이고 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학의 Larry Tabor 박사의 실험실에서 일하고 있습니다.

이 두 가지 기술 모두에서 우리는 초기 병아리 배아에 있는 수백 개의 세포를 빠르고 동시에 라벨링합니다. 이러한 표지의 움직임을 추적하면 이러한 세포가 최종적으로 거주하게 되는 조직을 결정할 수 있을 뿐만 아니라 초기 배아를 형성하는 조직 수준 변형을 정량화할 수 있습니다. 먼저, 햄버거와 해밀턴이 정의한 대로 원하는 단계까지 세로 방향으로 알을 품습니다.

150mm 페트리 접시 옆면에 있는 달걀 바닥을 깨뜨립니다. 껍질을 바닥에서 떼어내고 달걀의 내용물을 접시에 비우고 뭉툭한 집게를 사용하여 노른자에서 두꺼운 점성 알부민을 제거합니다. 이제 원형 여과지 중간에 구멍을 뚫습니다.

여과지 고리 중 하나를 노른자에 올려 배아가 고리의 중앙 구멍을 통해 보이도록 합니다. 마이크로 가위로 여과지 링의 바깥쪽 둘레를 다듬습니다. 그런 다음 노른자에서 배아가 부착된 종이를 가는 집게로 제거하고 배아를 PBS 욕조에 부드럽게 담그십시오.부착된 노른자 입자를 제거하려면 여과지 어셈블리를 35mm 배양 접시에 옮깁니다.

복부 쪽이 위로 향하게 놓고 두 번째 여과지 링과 함께 배아를 보냅니다. 금속 링으로 고정하고 배아를 배양 배지에 담그십시오. 배아가 완전히 잠기지 않으면 조직 기하학과 그에 따른 형태 형성이 비정상적으로 높은 표면 장력 부하에 의해 크게 변경될 수 있습니다.

배양 중에는 명시야 현미경을 사용하여 적절한 형태와 배아 단계를 확인합니다. 먼저 소량의 철 가루를 가지고 포화 염료와 알코올 몇 방울을 넣고 당긴 마이크로 피펫 끝으로 자연 건조시킵니다. 뭉친 철 입자를 분해하여 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

이온수 위치로 덮인 여러 번 헹굼 후, 수확된 배아 등쪽 부위는 넉넉한 배양 배지 층으로 덮인 35mm 배양 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 유리 바늘을 사용하여 빌린 막을 제거하고 전기 세포를 노출시킵니다. 이제 라벨링된 철 입자 열을 peor 피펫에 그립니다.

해부 현미경을 사용하여 피펫을 배아 바로 위에 위치시킵니다. 피펫을 손가락 끝으로 천천히 앞뒤로 굴려 배아 전체에 입자를 뿌립니다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양한 후 강한 자석을 사용하여 입자를 제거합니다.

필요한 경우 자석을 한 쌍의 미세한 집게에 자석을 부착하고 자성 집게를 사용하여 남아 있는 철 입자를 조심스럽게 제거합니다. 배아의 명시야와 형광 이미지를 모두 획득합니다. 22 게이지 바늘 포함.

PBS의 검은색 10마이크로미터 직경 마이크로스피어 용액을 10cc 주사기로 당깁니다. 그런 다음 컴퓨터 하드 드라이브를 사용하여 당겨진 유리 바늘의 끝을 비스듬하게 만들고 비드 용액으로 채웁니다. 마이크로 피펫을 가볍게 튕겨 용액이 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 팁에 도달하도록 합니다.

유리 바늘을 배아와 같은 시야에 놓습니다. 피펫 팁에서 비드가 흘러나오는지 확인합니다. 이제 피펫 팁을 뇌관의 내강에 삽입합니다.

조직의 복부 바닥을 뚫지 않도록 주의하십시오. 구슬과 액체가 내강으로 들어갈 때 조직의 일시적인 팽창을 모니터링합니다. 그런 다음 유리 바늘을 빠르게 제거하십시오.

마지막으로, 뇌관의 내강에서 충분한 비드 밀도를 확인합니다. 명시야 현미경을 사용하여 비드를 20-30분 동안 가라앉힌 후 명시야 이미지 또는 광간섭 단층촬영 데이터 세트를 획득합니다. 첫 번째 이미지를 획득한 후 150mm 페트리 접시에 최대 7개의 35mm 배양 접시를 놓고 전체 어셈블리를 작은 비닐 봉지에 넣습니다.

가습을 위해 백에 탈이온수 한 방울을 넣은 다음 95% 산소와 5% 이산화탄소의 혼합물로 백을 채웁니다. 다음 이미징 시점까지 배아를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고, 라벨이 붙은 배아를 1.2ml의 배양 배지가 들어 있는 델타 T 접시에 넣고, 섭씨 37도로 유지되는 유리 뚜껑으로 접시를 덮고, 미니 펌프 가변 흐름 장치에서 공급되는 95%O2 5%CO2 가스 혼합물로 배아를 융합합니다. 이제 시간 간격을 원하는 이미지를 자동으로 획득하도록 소프트웨어를 설정합니다.

실험이 진행되는 동안 라벨을 자동 또는 수동으로 추적할 수 있으며 마커 좌표에 대한 형태발생학적 변형 맵을 계산할 수 있습니다. 여기서, 철 입자 기법은 머리 주름 형성 중 전극 세포의 움직임을 라벨링하고 추적하는 데 사용되었습니다. 초기 병아리 배아에서는 형광 표지된 세포가 전체 배아에 분포되어 있었습니다.

배아의 명시야 및 형광 이미지는 난자 배양 중에 서로 다른 간격으로 캡처되었습니다. tract 레이블의 움직임을 모니터링합니다. 누적 데이터를 통해 머리 주름이 형성되는 동안 진화하는 형태 유전학적 변형 분포를 계산할 수 있습니다.

유사하게, 폴리스티렌 미스피어 기술은 초기 병아리 뇌의 중간 뒷뇌 경계에서 조직의 움직임을 추적하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 구슬이 뇌 내강의 모든 면에 달라붙는 경향이 있기 때문에 뚜렷한 3D 변형을 처리할 수 있습니다. 6시간 동안 비드 움직임을 추적한 후 마커 좌표를 통해 변형을 계산하여 세로 및 원주 방향의 조직 변형을 특성화할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 자신의 조직 배양 및 라벨링을 구현하는 데 필요한 몇 가지 실험 단계에 대해 잘 알게 될 것입니다. 여기에 제시된 프로토콜 기술은 네이티브 조직에 대한 침습을 최소화하고 비용이 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 물질을 포함한다는 점에서 특히 유리합니다. 이러한 실험은 배아 발달의 역학에 대한 연구에 특히 유용합니다.

라벨링된 세포의 추적된 움직임을 사용하여 계산된 변형 필드는 형태 형성의 물리적 모델을 테스트하고 구성하는 데 사용할 수 있습니다.