초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

본 기술의 전반적인 목표는 초기 발달 과정 중 형태발생 변형을 측정하기 위해 배아 조직을 라벨링하고 배양하는 것입니다. 초기 닭 배아 배양을 위해, 우선 거름종이 운반체법을 사용하여 알에서 배아를 분리합니다. 실험적 응용 목적에 따라, 자성 철 입자를 통해 전달되는 형광 친유성 염료 또는 폴리스티렌 미세구체를 사용하여 추출된 배아를 라벨링합니다. 그 다음, 형광 현미경이나 광간섭 단층 촬영(optical coherence tomography) 영상을 이용하여 배양 과정 중 라벨의 이동을 추적합니다.

결과물인 형태발생 변형률 맵(morphogenetic strain maps)의 이미징을 통해 2차원 및 3차원 모두에서 조직의 신장, 단축 및 전단이 일어나는 영역을 확인할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 세인트루이스 워싱턴 대학교 의공학과 Larry Tabor 교수님 연구실의 대학원생 Ben Philis입니다. 이러한 유형의 실험을 시작하기 전에, 모델 시스템에 적합한 조직 배양 기술, 사용할 수 있는 이미징 방식, 그리고 실험을 통해 얻고자 하는 데이터의 유형을 고려하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 조직의 변형을 2차원 또는 3차원으로 분석하는 데 관심이 있으십니까? 오늘 저희는 초기 닭 배아에서 두 가지 상호 보완적인 라벨링 기법을 보여드림으로써 이러한 질문 중 일부에 대해 다루고자 합니다. 안녕하세요, 제 이름은 Victor Varner이며, 세인트루이스 워싱턴 대학교의 Larry Tabor 박사님 연구실에서 근무하고 있습니다.

이 두 가지 기술 모두에서, 우리는 초기 병아리 배아의 수백 개 세포를 빠르고 동시에 표지합니다. 이렇게 표지된 세포의 움직임을 추적하면, 이 세포들이 최종적으로 어느 조직에 자리 잡는지 결정할 수 있을 뿐만 아니라, 초기 배아를 형성하는 조직 수준의 변형을 정량화할 수 있습니다. 먼저, hamburger 및 Hamilton이 정의한 원하는 단계까지 알을 세로 방향으로 배양하십시오.

150 millimeter 페트리 접시 가장자리에 달걀 아랫부분을 부딪혀 깹니다. 아랫부분의 껍질을 벌려 달걀 내용을 접시에 붓고, 둔탁한 핀셋을 사용하여 노른자 주위의 끈적하고 두꺼운 알부민을 제거합니다. 이제 원형 거름종이 중앙에 구멍을 뚫습니다.

배아가 거름종이 링의 중앙 구멍을 통해 보이도록 노른자 위에 거름종이 링 하나를 올립니다. 미세 가위로 거름종이 링의 바깥쪽 둘레를 따라 다듬습니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 배아가 부착된 종이를 노른자에서 분리하고, 배아를 PBS 용액에 살짝 담급니다. 부착된 노른자 입자들을 제거하기 위해 거름종이 어셈블리를 35 millimeter 배양 접시로 옮깁니다.

배아의 복측이 위로 향하게 놓은 다음, 두 번째 필터 페이퍼 링으로 배아를 고정합니다. 금속 링으로 이를 고정한 후 배아를 배양액에 침지시킵니다. 배아가 완전히 잠기지 않으면, 비정상적으로 높은 표면 장력 부하로 인해 조직의 기하학적 구조와 이후의 형태 형성 과정이 크게 변할 수 있습니다.

배양 과정 중에 명시야 현미경을 사용하여 적절한 형태와 배아 단계를 확인하십시오. 먼저, 소량의 철 분말을 취해 포화 염료와 알코올을 몇 방울 가한 후, 뽑아낸 마이크로 피펫 팁으로 공기 건조시키십시오. 뭉쳐 있는 철 입자들을 분쇄하여 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.

이온수로 여러 번 헹군 후, 수확한 배아를 배양액이 충분히 담긴 35 millimeter 배양 접시에 등 쪽이 위로 향하게 놓습니다. 해부 현미경 하에서 유리 바늘을 사용하여 투명막을 제거하고 전기 피부 세포를 노출시킵니다. 이제 파스퇴르 피펫으로 표지된 철 입자 기둥을 흡입합니다.

해부 현미경을 사용하여 피펫을 배아 바로 위에 위치하도록 담급니다. 손가락 끝으로 피펫을 천천히 앞뒤로 굴려 배아 위에 입자를 뿌립니다. 37 °C에서 10분 동안 배양한 후, 강력한 자석을 사용하여 입자를 제거합니다.

필요한 경우, 자석을 미세 핀셋의 자성 쌍에 부착하고, 자성화된 핀셋을 사용하여 잔류 철 입자를 조심스럽게 제거하십시오. 이어서 배아의 명시야 이미지와 형광 이미지를 모두 획득하십시오. 22 gauge 바늘을 사용하여.

PBS에 분산된 직경 10 µm의 검은색 마이크로구체 용액을 10 cc 주사기에 흡입합니다. 그런 다음 컴퓨터 하드 드라이브를 사용하여 인입된 유리 바늘의 끝을 비스듬하게 깎고 비드 용액을 채웁니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 용액이 팁 끝까지 도달하도록 마이크로 피펫을 가볍게 튕겨줍니다.

유리 니들을 배아와 동일한 시야에 위치시킵니다. 피펫 팁에서 비즈가 흘러나오는지 확인하십시오. 이제 피펫 팁을 뇌관(brain tube)의 루멘 내부로 삽입합니다.

조직의 복측 바닥을 뚫지 않도록 주의하십시오. 비드와 액체가 내강으로 진입함에 따라 조직이 일시적으로 부풀어 오르는 것을 관찰하십시오. 그 후 유리 니들을 빠르게 제거하십시오.

마지막으로, 뇌 튜브의 내부 루멘에 비드 밀도가 충분한지 확인합니다. 명시야 현미경을 사용하여, 명시야 이미지나 광간섭 단층 촬영 데이터 세트를 획득하기 전 20~30분 동안 비드를 침강시킵니다. 첫 번째 이미지를 획득한 후, 샘플이 담긴 35 millimeter 배양 접시를 최대 7개까지 150 millimeter 페트리 접시에 넣고 전체 어셈블리를 작은 플라스틱 백에 넣습니다.

가습을 위해 백에 탈이온수를 몇 방울 넣은 다음, 95% 산소와 5% 이산화탄소 혼합 가스로 백을 채웁니다. 다음 이미지 촬영 시점까지 배아를 37 °C 인큐베이터에 보관하십시오. 라벨이 부착된 배아를 1.2 mL의 배양액이 담긴 delta T 디쉬에 넣고 37 °C로 유지되는 유리 덮개로 디쉬를 덮습니다. 미니 펌프 가변 유량 장치에서 공급되는 95% O2 5% CO2 혼합 가스로 배아에 지속적으로 가스를 공급하십시오. 이제 소프트웨어를 설정하여 원하는 시간 간격으로 이미지를 자동으로 획득하도록 합니다.

실험 과정 동안 레이블은 자동 또는 수동으로 추적할 수 있으며, 마커 좌표에 대한 형태발생 변형 맵(morphogenetic strain maps)을 계산할 수 있습니다. 본 실험에서는 머리 주름 형성 과정 중 전기피부 세포의 움직임을 레이블링하고 추적하기 위해 철 입자 기법을 사용하였습니다. 초기 닭 배아의 경우, 형광 레이블링된 세포들이 배아 전체에 분포되었습니다.

ex ovo 배양 과정 중 다양한 간격으로 배아의 명시야 및 형광 이미지를 촬영하였습니다. 이는 트랙 표지의 움직임을 관찰하기 위함입니다. 누적된 데이터는 머리 주름(head fold) 형성 과정 중 진화하는 형태 형성 변형률(morphogenetic strain) 분포의 계산을 가능하게 합니다.

마찬가지로, 초기 닭 뇌의 중뇌-후뇌 경계에서 조직의 움직임을 추적하기 위해 폴리스티렌 미세구체 기법이 사용되었습니다. 비드가 뇌 내강의 모든 측면에 부착되는 경향이 있어, 이 방법은 뚜렷한 3D 변형을 처리할 수 있다는 점에 유의하십시오. 6시간 동안 비드의 움직임을 추적한 후, 마커 좌표를 통해 변형률을 계산하여 길이 방향 및 원주 방향의 조직 변형을 특성화할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 조직 배양 및 라벨링을 직접 구현하는 데 필요한 일부 실험 단계에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 여기서 제시하는 프로토콜 기술은 천연 조직에 대한 침습성을 최소화하며, 비용이 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용한다는 점에서 특히 유리합니다. 이러한 실험들은 특히 배아 발달의 역학 연구에 매우 유용합니다.

표지 세포의 추적된 움직임을 사용하여 계산된 변형장은 형태 형성의 물리적 모델을 테스트하고 구축하는 데 모두 사용될 수 있기 때문입니다.