확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 살모넬라 항원 대립유전자를 식별하는 것입니다. 이는 이러한 대립유전자와 관련된 특정 서열 차이를 식별하기 위해 타겟 PCR을 수행함으로써 달성됩니다. 대립유전자 특이적 프라이머가 포함된 PCR 반응 혼합물에 샘플 템플릿을 첨가하여 OH1 및 H2 대립유전자 타이핑을 진행합니다.

PCR은 써모사이클러(thermocycler)에서 수행합니다. 다음으로, 젤 전기영동을 통해 PCR 샘플을 크기별로 분리하여 각 샘플에 앰플리콘(amplicon)이 존재하는지 확인하고 그 크기를 측정하거나 이를 분리합니다. 이후 앰플리콘 크기를 PCR에 사용된 각 프라이머 세트의 예상 크기와 대조하여, 특정 살모넬라 항원의 동정을 나타내는 PCR 결과를 얻습니다.

PCR을 통한 대립유전자 분석 후, OH 1 및 H 2 다중 PCR 분석 결과를 바탕으로 혈청형(SEROVAR) 지정이 이루어집니다. 본 영상에서 설명하는 프로토콜이 SYP보다 갖는 주요 장점은 분석 속도가 빠르고, 결과 해석이 더 쉬우며, 비용이 적게 든다는 점입니다. 이 방법은 가금류 또는 낙농 농장 내부 또는 농장 간의 salmonella VARs 분포 및 지속성을 결정하는 것과 같이 역학 분야의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 함의는 Salmonella serovars arius 또는 urian에 의한 살모넬라증의 신속한 진단으로 확장됩니다. 이 방법의 시각적 시연은 이 PCR 기반 방법을 사용하여 살모넬라를 혈청형 수준까지 분석하는 방법을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 절차의 시연은 조지아 대학교 Lee Mauer 연구소의 연구원인 Adriana Pedroso와 Yin Chang이 수행하며, 이후의 PCR 반응을 위한 전세포 DNA 템플릿을 준비합니다.

먼저 1 mL의 LB 배지에 salmonella를 접종합니다. 단일 콜로니로부터 분리합니다. 200~250 rpm의 진탕 속도와 37 °C의 배양 온도에서 배양합니다.

다음 날, 1 mL 배양액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 약 2분 동안 4,500 ×g로 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그 다음 상층액을 흡입하여 제거하고, 박테리아 펠렛을 1 mL의 100% Ethanol에 재현탁합니다. 에탄올에 현탁된 세포를 실온에서 10분 동안 배양한 후, 이전과 동일하게 세포를 원심분리합니다. 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 1 mL의 멸균 증류수에 재현탁합니다. 마지막으로 세포 현탁액을 희석합니다.

증류수로 1:20으로 희석하여 PCR 준비 단계 전까지 최대 한 달 동안 -20 °C에서 보관합니다. PCR 반응 혼합물의 조제 및 분주는 물리적으로 분리된 공간에서 수행해야 하며, 가급적 UV 램프가 설치된 전용 PCR 워크스테이션에서 진행하는 것이 좋습니다. 먼저, UV 램프와 10% bleach를 이용한 닦아내기로 작업 표면을 오염 제거합니다. 그 다음, PCR 작업 전용으로 지정된 피펫과 배리어 피펫 팁을 사용하여 수행합니다.

먼저 프라이머를 증류수로 5 × 10⁻⁴ M 농도로 희석하여 마스터 프라이머 스톡을 만듭니다. 그다음, 이 스톡을 증류수로 1:20으로 희석하여 25 µM의 작동 농도로 맞춥니다. 냉동고에서 PCR 시약과 전세포 템플릿을 꺼내 얼음 위에서 해동합니다.

tac DNA polymerase는 필요할 때까지 냉동고에 보관하십시오. 서면 프로토콜의 표 1에 따라 PCR 시약들을 혼합합니다. 다음으로, PCR 반응액 9 µL를 피펫으로 분취합니다.

멸균된 96-웰 라운드 바텀 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 혼합합니다. 첫 번째 열의 상단부터 시작하여 아래로 내려간 다음 다음 열의 상단으로 이동하며, 첫 번째 웰에는 음성 대조군으로 사용할 증류수 1 µL를 첨가합니다. 이어서 두 번째 웰의 PCR 믹스에 양성 대조군 템플릿 0.5 µL를 분주하고, 세 번째 웰에는 E. coli K 12 DH5α 1 µL를 분주합니다.

세 번째 샘플 템플릿 1 µL를 나머지 웰에 추가합니다. H1 I 및 gyp PCR의 경우, Salmonella enterica CVaR TYM과 Enteritidis가 각각 I 및 G alleles의 양성 대조군으로 사용됩니다. Salmonella CVaR, Heidelberg 및 Haar는 r 및 z10 alleles를 검출하기 위한 두 번째 H1 allele 타이핑 PCR에서 각각 양성 대조군으로 사용됩니다. 다음으로 10 µL 용량의 유리 모세관을 Idaho technology용 지정 홀더에 배치합니다.

홀더에 Rapid cycler를 고정한 후, 유리 모세관을 웰 바닥에 접촉시켜 각 모세관에 PCR 반응 혼합물을 충전합니다. 홀더를 기울여 액체가 튜브 아래로 이동하게 함으로써 모세관 끝단과 PCR 혼합물 사이에 공간을 확보합니다. 부탄 토치로 모세관의 양 끝을 열봉합하기 전, 모세관 튜브와 홀더를 Idaho technology rapid cycler에 넣고 서면 프로토콜의 표 1에 설명된 서모사이클러 프로그램을 사용하여 다양한 all ELO 유형의 PCR을 수행합니다.

써모사이클러 프로그램이 완료되면, 표준 절차에 따라 에티듐 브로마이드가 포함된 15 × 10 cm, 1.5% 분자생물학 등급 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기영동 단계를 진행하십시오. 겔이 응고되면, 0.25 mg/mL 농도로 200 µL가 미리 혼합된 1× TAE 전기영동 버퍼가 담긴 수평 침지형 전기영동 챔버로 겔을 옮기십시오.

6배 농도의 DNA 로딩 다이 40 µL가 포함된 DNA 분자량 마커를 준비하여, 첫 번째, 중간 및 마지막 웰에 미리 혼합된 DNA 분자량 마커 4.8 µL를 로딩합니다. 다음으로, 홀더에서 PCR 샘플 반응액이 들어 있는 유리 모세관을 꺼내 유리 커터로 모세관의 양 끝을 흠집 냅니다. 그런 다음 양손의 엄지와 검지를 유리 커터로 표시된 모세관의 양쪽에 대고 모세관을 꺾어 분리합니다. PCR 반응 혼합물의 반대쪽 끝에 모세관 디스펜서를 배치하고, 액체가 튜브의 맨 아래에 도달할 때까지 플런저를 천천히 시계 방향으로 돌립니다.

로딩할 웰에 모세관을 넣고 플런저를 시계 방향으로 천천히 돌려 정량된 샘플을 웰에 분주합니다. 모세관으로 웰을 찌르지 않도록 주의하며, 액체가 모세관에서 완전히 빠져나간 후에도 플런저를 계속 돌려 웰에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 모든 샘플과 표준 물질의 로딩이 완료되면, 전원 공급 장치의 정전압을 90 volts로 설정합니다.

전기영동이 완료되면, 젤을 UV 트랜스일루미네이터로 옮겨 DNA 단편과 분자량 표준물질을 시각화하고 gel dock XR 시스템으로 이미지를 캡처합니다. 마지막으로, 모세관 홀더를 10% 표백제에 15~30분 동안 담급니다. 증류수로 3회 헹군 후 PCR 준비실에 다시 놓아 자연 건조합니다.

이 첫 번째 에티듐 브로마이드 염색 젤은 salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa와 관련된 O 대립유전자에 대한 멀티플렉스 PCR 결과를 보여줍니다. 1번과 13번 레인에는 100 base pair DNA 래더가 포함되어 있습니다.

2번 레인에는 O 대립유전자 B, C1, C2, D1 및 E에 대한 멀티플렉스 PCR 대조군이 포함되어 있습니다. 나머지 3번에서 12번 레인에는 살모넬라 분리균이 포함되어 있습니다. 살모넬라 분리균의 대립유전자 지정은 왼쪽에서 오른쪽으로 사용된 대립유전자 프라이머 세트의 예측 결과 및 PCR 대조군의 크기와 일치하는 증폭 산물을 기준으로 결정됩니다. 증폭 산물의 크기는 다음과 같습니다: D1 620 base pairs, C2 400 base pairs, E 280 base pairs, C1 340 base pairs 및 B 560 base pairs.

이 이리듐 브로마이드 염색 젤은 eye 및 gm 대립유전자의 FLA 젤을 식별하기 위한 H1 대립유전자 멀티플렉스 PCR 결과를 보여줍니다. 젤은 이전에 보여준 것과 동일한 순서로 로딩되었습니다. 다시 한번, 왼쪽에서 오른쪽으로 사용된 4가지 H1 대립유전자 프라이머 세트에 대해 예측된 바와 같이, PCR 컨트롤과 크기가 일치하는 앰플리콘의 존재 여부에 따라 각 분리주에 H1 대립유전자가 할당됩니다.

앰플리콘 크기는 GM 310 base pairs, I 510 base pairs입니다. 이 에티듐 브로마이드 염색 젤은 gellin 대립유전자 r 및 z 10을 식별하기 위한 H one allele 멀티플렉스 PCR 결과를 보여줍니다. 젤 로딩은 앞서 설명한 방식과 동일하게 수행되었으며, 각 분리주에 할당되는 H one allele은 PCR 컨트롤과 크기가 일치하는 앰플리콘의 존재 여부에 따라 결정됩니다. 사용된 4가지 H one allele 프라이머 세트에 대해 예측된 바와 같이, 앰플리콘 크기는 R 170 base pairs 및 Z ten 360 base pairs입니다.

이 기술은 적절히 수행될 경우 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 진행하는 동안, PCR carryover 오염 가능성을 최소화하기 위해 템플릿 준비, PCR 셋업, 그리고 겔 전기영동 단계를 물리적으로 분리하여 수행하십시오.