확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 살모넬라 항원 대립유전자를 식별하는 것입니다. 이는 PCR을 표적으로 하여 이러한 대립유전자와 관련된 특정 염기서열 차이를 식별함으로써 달성됩니다. 샘플 템플릿을 대립유전자 특이적 프라이머와 OH 1 및 H 2 대립유전자 typing을 포함하는 A PCR 반응 혼합물에 첨가합니다.

PCR은 thermocycler에서 실행됩니다. 다음으로, PCR 샘플은 겔 전기영동을 사용하여 크기별로 분리하여 각 샘플에 존재하는 앰플리콘의 크기를 결정하거나 분리합니다. 그런 다음 앰플리콘 크기는 특정 살모넬라 항원의 식별을 보여주는 PCR 결과를 얻는 데 사용된 각 프라이머 세트의 예상 크기와 상관관계가 있습니다.

그런 다음 OH 1 및 H 2 multiplex PCR assay에 대한 결과를 기반으로 PCR SEROVAR 지정에 의한 대립유전자를 제공합니다. SYP에 비해 이 비디오에 설명된 프로토콜의 주요 장점은 빠르고 해석하기 쉬우며 비용이 저렴하다는 것입니다. 이 방법은 가금류 또는 낙농 농장 내부 또는 농장 간의 살모넬라 VAR의 분포 및 지속성을 결정하는 것과 같은 역학 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 살모넬라균, 혈청형, 아리우스 또는 소변에 기인하는 연어 오시스의 신속한 진단으로 확장됩니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것은 이 PCR 기반 방법을 사용하여 살모넬라균을 혈청형 수치로 유형화하는 방법을 이해하는 데 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 조지아 대학의 Lee Mauer Laboratories의 Adriana Pedroso와 Yin Chang 연구 과학자가 후속 PCR 반응을 위한 전체 세포 DNA 템플릿을 준비하기 위한 것입니다.

먼저 LB 육수 1ml에 살모넬라균을 접종합니다. 단일 군체에서 격리합니다. 분당 200-250회 회전으로 진탕하고 섭씨 37도의 배양 온도로 배양합니다.

다음날, 1 밀리리터 배양을 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 옮기고 4, 500 시간 중력에 대략 2 분 동안 현탁액을 중심분리하여 세포를 펠릿 다음 sup natant를 흡인하고, 그 후에 100%Ethanol의 1 밀리리터에 있는 세균성 펠릿을 resuspend하고, 10 분 동안 실온에 에탄올 중단한 세포를 배양하고 그 후에 세포에 그 후에 분리기를 것과 같이 세포에 분리기. 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁시키고, 원심분리 후 수피네이트를 흡입하고 펠릿을 1밀리리터의 멸균 증류수에 현탁시킵니다. 마지막으로 세포 현탁액을 희석합니다.

20명 중 1명은 증류수를 사용하여 PCR을 수행할 준비가 될 때까지 최대 1개월 동안 섭씨 영하 20도에서 보관하며, PCR 반응 혼합물의 준비 및 분주는 물리적으로 분리된 방에서 수행해야 하며 가급적이면 자외선이 장착된 전용 PCR 워크스테이션에서 수행해야 합니다. 먼저 자외선으로 작업면을 오염 제거하고 10% 표백제로 닦아 오염을 제거합니다. 다음으로, PCR 작업 전용으로 지정되고 배리어 피펫 팁이 장착된 피펫을 사용합니다.

먼저 프라이머를 증류수로 마이너스 4 어금니에 5 곱하기 10으로 희석하여 마스터 프라이머 스톡을 만드십시오. 그런 다음 25 마이크로 몰의 작업 농도를 얻기 위해 증류수로 20 분의 1을 희석하십시오. 냉동고에서 PCR 시약과 전체 세포 템플릿을 꺼내 얼음에서 해동합니다.

필요할 때까지 tac DNA 중합효소를 냉동실에 그대로 두십시오. 서면 프로토콜의 표 1에 따라 PCR 시약을 결합합니다. 다음으로, PCR 반응의 9 마이크로 리터를 피펫팅합니다.

멸균 96 둥근 바닥 웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰에 혼합합니다. 첫 번째 열의 맨 위에서 시작하여 열 아래로 이동한 다음 다음 열의 맨 위로 이동하여 첫 번째 우물에 1마이크로리터의 증류수를 추가하여 네거티브 컨트롤 역할을 합니다. 그런 다음 0.5 마이크로 리터의 양성 대조군 템플릿을 두 번째 웰의 PCR 혼합물에 분배하고 1 마이크로 리터의 대장균 K 12 DH 5 알파를 세 번째 웰에 분배합니다.

세 번째 샘플 템플릿 중 1마이크로리터를 나머지 웰에 추가하면 H one I 및 gyp PCR Salmonella entera, CVaR, TYM 및 Enteritis가 각각 눈 및 GM 대립유전자에 대한 양성 대조군 역할을 합니다. Salmonella CVaR, heidelberg 및 haar는 r 및 z 10 대립유전자를 각각 검출하기 위해 두 번째 H one 대립유전자 유형 PCR에 사용될 양성 대조군입니다. 다음으로 10마이크로리터 용량의 유리 모세관을 Idaho 기술을 위해 지정된 홀더에 배치합니다.

Rapid cycler가 홀더에 고정되면 모세관을 웰 바닥에 닿게 하여 각 유리 모세관에 PCR 반응 혼합물을 로드합니다. 홀더를 기울여 액체가 튜브 아래로 이동할 수 있도록 하고 끝과 PCR 혼합물 사이에 공간을 확보합니다. 모세혈관의 양쪽 끝을 밀봉하기 위해 부탄 토치로 유리관을 가열하기 전에 모세관 튜브와 홀더를 Idaho Technology rapid cycler에 넣고 PCR의 다양한 모든 ELO 유형에 대한 서면 프로토콜의 표 1에 설명된 열순환기 프로그램을 사용합니다.

thermocycler 프로그램이 완료되면 15 x 10 센티미터 동안 겔 전기 영체 단계를 진행하십시오. 1.5 % 분자 생물학 등급은 표준 절차에 따라 브롬화 나트륨을 함유 한 겔을 발생시켰다. 일단 젤이 응고되면, milliliter당 0.25 milligrams의 200 microliters를 premixed

DNA 로딩 염료 부하의 6배인 40마이크로리터, 첫 번째, 중간 및 마지막 웰에 미리 혼합된 DNA 분자량 마커 4.8마이크로리터가 있는 DNA 분자량 마커. 다음으로, PCR 샘플 반응을 포함하는 유리 모세관을 홀더에서 제거하고 모세관의 양단을 유리 커터로 에칭합니다. 그런 다음 양손의 엄지와 검지를 유리 절단기로 표시된 모세관의 양쪽에 놓고 모세관을 스냅하고 모세관을 스냅하고 모세관 디스펜서를 PCR 반응 혼합물의 반대쪽 끝에 놓고 액체가 튜브의 맨 아래에 올 때까지 플런저를 시계 방향으로 천천히 돌립니다.

모세관을 적재할 웰에 놓고 플런저를 시계 방향으로 천천히 돌려 폴 가중된 샘플을 돌출부에 분배합니다. 글쎄요, 마지막 액체가 모세관을 떠난 후에도 플런저를 계속 돌려 모세관으로 우물에 구멍을 뚫거나 기포가 우물에 유입되지 않도록 주의하십시오. 모든 샘플과 표준물질이 로드되면 전원 공급 장치의 정전압을 90볼트로 설정합니다.

전기영동이 완료되면 겔을 UV 트랜스 조명기로 옮겨 겔 도크 XR 시스템에서 DNA 단편과 분자량 표준물질 캡처 이미지를 시각화합니다. 마지막으로 모세관 홀더를 10% 표백제에 15-30분 동안 넣습니다. 증류수로 세 번 헹구고 PCR 설정실에 다시 넣어 자연 건조합니다.

이 첫 번째 아테륨 브로마이드 염색 겔은 살모넬라 엔테라 바, 장염, hadda Heidelberg.Antifa와 관련된 O 대립 유전자에 대한 다중 PCR 결과를 보여줍니다. 레인 1과 13에는 100의 기본 페어가 포함되어 있습니다. DNA 사다리.

2열에는 O 대립유전자 B, C 1, C 2, D 1 및 E에 대한 다중 PCR 대조군이 포함되어 있으며, 나머지 3열에서 12열에는 살모넬라 분리물이 포함되어 있습니다. PCR 대조군의 크기와 일치하는 앰플리콘을 기반으로 그리고 왼쪽에서 오른쪽으로 사용된 대립유전자 프리마 세트에 대해 예측된 대로 Salmonella isolate에 대립유전자 지정이 부여됩니다. 이들 앰플리콘 크기는 다음과 같다: D1,620 염기쌍, C,2,400염기쌍,E1,280염기쌍,C,C,1,340염기쌍 및 B,560염기쌍.

이 이리듐 브로마이드 염색 겔은 대립유전자, 눈 및 gm에서 FLA 겔을 식별하기 위한 H one 대립유전자 다중 PCR 결과를 보여줍니다. 겔은 이전에 표시된 것과 동일한 순서로 적재되었습니다. 다시 말하지만, H one 대립유전자는 PCR 대조군과 크기가 일치하는 앰플리콘의 존재 여부와 왼쪽에서 오른쪽으로 사용된 4개의 H one 대립유전자 프라이머 세트에 대해 예측된 대로 각 분리물에 할당됩니다.

앰플리콘 크기는 GM 310 염기쌍 및 I 510 염기쌍입니다. 이 척추 아테륨 브로마이드 염색 겔은 겔린 대립유전자 r 및 z 10을 식별하기 위한 H one 대립유전자 다중 PCR 결과를 보여줍니다. 다시, 겔은 앞서 나타낸 것과 동일한 방식으로 로딩되었고, PCR 대조군과 크기가 일치하는 앰플리콘의 존재에 따라 H 하나의 대립유전자를 각 분리체에 할당하고, 사용된 4개의 H 1 대립유전자 프라이머 세트에 대해 예측된 바와 같이, 앰플리콘 크기는 R 170 염기쌍 및 Z 10 360 염기쌍이다.

이 기술은 적절하게 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 PCR 캐리오버 오염 가능성을 최소화하기 위해 템플릿 준비 PCR 설정 및 겔 전기영동을 물리적으로 분리해야 합니다.