FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 형광 이미징 기술을 사용하여 중추 신경 말단 내 특정 시냅스 소포 풀의 보충 및 동원량을 정량화하는 것입니다. 이는 동일한 신경 말단에 FM 염료를 사용하여 두 차례의 시냅스 소포 재순환을 모니터링함으로써 유효한 내부 대조군을 확보하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 특정 언로딩 프로토콜을 사용하여 즉시 방출 가능 풀과 예비 풀을 순차적으로 고갈시키며, 이를 통해 상대적인 풀 크기를 정량화할 수 있습니다.

다음으로, 선택한 변동 사항이 시냅스 소포, 풀 보충 또는 동원화에 미치는 영향을 연구하기 위해 로딩 또는 언로딩 조건을 변경합니다. 결과에 따르면, 유도된 염료 언로딩의 정량화 및 분석을 기반으로 서로 다른 시냅스 물리적 풀의 FM d 로딩이 재현 가능함을 보여줍니다. fluent 계열의 유전적 리포터와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 내세포작용을 거친 시냅스 소포에 의한 풀의 보충을 구체적으로 추적할 수 있다는 점입니다.

또한 정밀한 정량화가 가능합니다. 이 프로토콜은 동일한 신경 말단에서 두 번 수행되므로 내부 대조군을 제공합니다. 이 방법은 특정 엔도사이토시스 모드의 조작이 전체 재활용 풀(total recycling pool)과 그 내부의 즉각 방출 가능 풀(readily reusable pool) 및 예비 풀(reserve pool)과 같은 시냅스 CLE 풀의 보충에 어떻게 영향을 미치는지와 같이 시냅스, CLE, 엔도사이토시스 및 엑소사이토시스 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

기본 실험 장치는 도립 에피 형광 현미경, 냉각 CCD 카메라, 형광 광원, 중력 관류 장치, 평행 백금 전극과 전기 자극기가 포함된 이미징 챔버 및 컴퓨터로 구성되어야 합니다. FM 염료의 퇴색을 방지하기 위해 시료에 대한 형광 조명을 최소화하여 암실 또는 적색광 조건에서 실험을 수행하십시오. 생후 7일 된 Sprague-Dawley 랫 펍을 사용하여 소뇌 과립 뉴런의 일차 배양물을 준비함으로써 이 절차를 시작하십시오.

배양 준비가 완료되면, poly D lysine이 코팅된 25 millimeter 커버슬립 중앙에 뉴런을 한 방울 떨어뜨려 분주하며, 이때 방울의 직경이 7 millimeter를 초과하지 않도록 합니다. 1시간 후, 뉴런에 2 millilitre의 배양액을 추가하고 7일 동안 배양합니다. 새로운 배지에서 안정화될 수 있도록 상온의 식염수 용액에 커버슬립을 10분 동안 담가 둡니다. 그 후, 커버슬립을 꺼내어 하단면과 부착된 세포 주변 영역을 작은 종이 타월이나 흡수지로 닦아 건조시킵니다.

그 후, 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 이미징 챔버 바닥에 접착합니다. 세포는 두 개의 평행한 와이어 사이에 위치해야 합니다. 배스 챔버 중앙부까지 침범하지 않도록 주의하며, 챔버를 완전히 밀봉할 수 있을 만큼 충분한 양의 실리콘 그리스를 사용하십시오.

다음으로, 배스 챔버에 약 260 µL의 생리식염수를 조심스럽게 채웁니다. 그런 다음 입구 및 출구 튜브를 동일한 용액으로 채웁니다. 깨끗한 커버슬립에 실리콘 그리스를 발라 상단에 부착함으로써 챔버를 밀봉합니다.

그 후, 입구 및 출구 튜브를 사용하여 챔버 내에 갇힌 공기 방울을 모두 제거합니다. 그런 다음 이미징 챔버를 스테인리스 스틸 플랫폼에 고정합니다. 입구 튜브를 통해 식염수를 천천히 흘려보내 누출 여부를 확인합니다.

다음 단계는 조립된 챔버를 도립 현미경의 스테이지 위에 장착하는 것입니다. 중력 관류 시스템의 입구에 식염수를 채워 프라이밍하고 챔버를 입구에 연결하십시오. 그런 다음 챔버의 연결 와이어를 전기 자극기에 연결하십시오.

희석된 fm dye 1.5 milliliters를 사용하여 뉴런을 관류합니다. 이어서 연결된 자극기를 사용하여 뉴런을 자극함으로써 염료 섭취를 유도합니다. 자극 후에는 신선한 식염수로 뉴런을 2분 동안 관류하여 과량의 FM dye를 씻어냅니다. 그런 다음 뉴런을 식염수 상태로 8분 동안 유지합니다.

그동안 개별 FM D가 로딩된 신경 말단이 보이는 축삭 네트워크를 찾으십시오. 이때 플루오레세인 파장을 사용하십시오. 세포가 밀집된 영역은 피하십시오.

휴식기 동안 약간의 드리프트가 발생했을 수 있으므로, 이미지 획득 직전에 즉시 초점을 다시 맞춥니다. 4초마다 한 프레임의 속도로 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다. 5~10장의 기저선 이미지를 획득한 후, 2초 동안 30 Hz 자극을 주어 즉시 방출 가능 풀(readily releasable pool)의 엑소사이토시스를 유도합니다.

10장의 이미지를 추가로 획득한 후, 40 Hz의 자극을 10초 동안 3회 가하고 자극 간 간격을 40초로 설정하여 예비 풀의 시냅스 소포 외배출을 유도한 다음, 5~10장의 이미지를 추가로 획득하십시오. 그 후 이미지 획득을 일시 중지합니다. 뉴런이 최소 20분 동안 회복되도록 한 뒤, 대조군 실험을 위해 이 S1 단계 프로토콜을 S2 단계에서 다시 반복하십시오.

데이터 분석을 위해 이미지를 스택으로 변환하십시오. ImageJ 내장 함수를 사용하여, 상당한 수평 드리프트가 발생한 경우 스택의 밝기와 대비를 조정하여 동적 범위를 최대화하십시오. 실험 중에 ImageJ의 stack reg 및 turbo reg 플러그인을 실행하여 이미지 스택을 정렬하십시오.

그 다음, 런타임 시리즈 분석기 플러그인을 실행합니다. 이어서, 최소 90개의 신경 말단에 대해 관심 영역(ROI)을 설정합니다. 염료 제거 전후의 이미지를 번갈아 확인하면 활성 신경 말단을 찾아내는 데 도움이 됩니다.

이상적인 관심 영역(ROI)의 크기는 일반적인 신경 말단보다 약간 더 큰 크기입니다. 그런 다음, 시간 경과에 따른 각 관심 영역의 총 형광 강도를 구하십시오. 그 후, Microsoft Excel로 내보내십시오.

여기에 소뇌 과립 뉴런에 80 Hz 10초 자극을 가하여 10 µM FM 1-43을 로딩한 대조 실험의 흐름도가 제시되어 있습니다. 여기는 FM 1-43이 로딩된 신경 말단을 보여주는 이미지입니다. 여기는 활성 신경 말단을 식별한 후 분석을 위해 선택한 90개의 번호가 매겨진 관심 영역(ROI)을 보여주는 동일한 이미지이며, 이들은 선택된 시점에서의 신경 말단 이미지들입니다.

이 이미지들은 서로 다른 시냅스 소포 풀이 고갈됨에 따른 형광 변화를 보여주기 위해 유사 색상(pseudo color)으로 제시되었습니다. 마지막으로, 여기 90개 신경 말단의 정규화된 형광 단위가 표시되어 있습니다. S1 및 S2 단계에서, 각 연속 자극에 따른 형광 감소량을 측정하여 S1 단계와 S2 단계 간에 비교할 수 있습니다.

이 대조 실험에서는 S one과 S two 모두에서 즉각 방출 가능 풀과 예비 풀의 크기가 동일하게 나타났습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 라이브 형광 이미징 기술을 사용하여 중추 신경 말단에서 특정 시냅스 소포 풀의 보충 및 동원량을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, S two 실험 조건을 변경하기 전에 S one 대조 실험을 실시하여 세포 생존력과 반응성을 확인하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.