FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석
November 11th, 2011
중앙 신경 터미널에있는 보충 및 특정 시냅스 소포의 동원 (SV) 풀을 수치 라이브 형광 이미징 기술이 설명되어 있습니다. SV 재활용의 두 발만 내부 통제를 제공하는 동일한 신경 터미널에서 모니터링하고 있습니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 실시간 형광 이미징 기술을 사용하여 중추 신경 말단에 있는 특정 시냅스 소포 풀의 보충 및 동원을 정량화하는 것입니다. 이는 유효한 내부 제어를 제공하기 위해 동일한 신경 말단에 FM 염료를 사용하여 두 차례의 시냅스 소포 재활용을 모니터링함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 쉽게 해제할 수 있는 풀과 예비 풀은 상대적 풀 크기를 정량화할 수 있는 특정 언로딩 프로토콜을 사용하여 순차적으로 고갈됩니다.
다음으로, 선택한 변이가 시냅스 소포, 풀 보충 또는 동원에 미치는 영향을 연구하기 위해 로딩 또는 언로딩 조건을 변경합니다. 결과는 서로 다른 시냅스 물리적 풀의 FM d 로딩이 유발된 염료 언로딩의 정량화 및 분석을 기반으로 재현 가능하다는 것을 보여줍니다. 유창한 유전 리포터 제품군과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 세포내이입(endocytosis)을 겪은 시냅스 소포에 의한 웅덩이의 보충을 추적한다는 것입니다.
또한 정확한 정량화가 가능합니다. 이 프로토콜은 동일한 신경 말단에서 두 번 수행되어 내부 제어를 제공하기 때문입니다. 이 방법은 특정 세포내이입 모드에서의 조작이 전체 재활용 풀과 그 안에 있는 시냅스 CLE 풀(예: 쉽게 재사용할 수 있는 풀 및 예비 풀)의 보충에 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 시냅스, CLE, 세포내이입 및 외세포작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
기본 실험 설정은 도립 에피 형광 현미경, 냉각식 CCD 카메라, 형광 광원, 중력 관류 장치, 병렬 백금 전극 및 전기 자극기가 있는 이미징 챔버 및 컴퓨터로 구성되어야 합니다. FM 염료 표백을 방지하기 위해 샘플의 형광 조명을 최소화하여 어두운 곳이나 적색광 조건에서 실험을 수행합니다. 7일 된 spra dolly rat pup을 사용하여 소뇌 과립 뉴런의 기본 배양을 준비하여 이 절차를 시작합니다.
배양이 준비된 후, 1시간 후에 직경이 7mm를 초과하지 않는 물방울에 폴리 D 라이신으로 코팅된 25mm 커버 슬립의 중앙에 있는 뉴런을 플레이트화하고 7일 후에 2ml의 배양 배지를 뉴런에 추가합니다. 새 배지가 안정화될 수 있도록 실온에서 10분 동안 식염수 용액에 단일 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립을 제거하고 밑면과 부착된 셀 주변 부분을 작은 종이 타월이나 흡수성 종이로 말리십시오.
그런 다음 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 이미징 챔버 바닥에 붙입니다. 셀은 두 개의 평행 와이어 사이에 있어야 합니다. 충분한 실리콘 그리스를 사용하여 목욕 챔버 중앙을 침범하지 않고 챔버를 완전히 밀봉하십시오.
다음으로, 약 260 마이크로 리터의 식염수로 목욕 챔버를 부드럽게 채 웁니다. 그런 다음 입력 및 출력 튜브를 동일한 솔루션으로 채웁니다. 실리콘 그리스로 깨끗한 커버 슬립을 상단에 붙여서 챔버를 밀봉합니다.
그런 다음 입력 및 출력 튜브로 챔버에 갇힌 기포를 제거합니다. 그런 다음 이미징 챔버를 스테인리스 스틸 플랫폼에 고정시킵니다. 입력 튜브를 통해 식염수를 부드럽게 주입하여 누출을 확인합니다.
다음 단계는 조립된 챔버를 도립 현미경의 스테이지에 장착하는 것입니다. 중력 관류 시스템의 입구를 식염수로 프라이밍하고 챔버를 입구에 연결합니다. 그런 다음 챔버의 연결 와이어를 전기 자극기에 연결합니다.
1.5ml의 희석된 fm 염료로 뉴런을 관류합니다. 그런 다음 부착된 자극기를 사용하여 뉴런을 자극하여 염료 흡수를 유발합니다.자극 후 신선한 식염수로 뉴런을 2분 동안 관류하여 과도한 FM 염료를 씻어냅니다. 그런 다음 뉴런을 식염수에 8분 동안 보관합니다.
그 동안, 개별 FM D 부하 신경 말단이 보이는 축삭 네트워크를 찾습니다. 플루오레세인 파장을 사용합니다. 세포가 뭉쳐 있는 영역을 피하십시오.
그런 다음 나머지 기간 동안 약간의 드리프트가 발생했을 수 있으므로 이미지 획득 직전에 이미지의 초점을 다시 맞춥니다. 4초마다 한 프레임의 비율로 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다. 5-10개의 baseline 이미지를 획득한 후 2초 동안 30헤르츠의 자극을 전달하여 쉽게 방출할 수 있는 풀의 exocytosis를 유발합니다.
또 다른 10 개의 이미지를 획득 한 후, 시냅스 소포를 불러 일으키고, 자극 사이의 40 초 간격으로 10 초 동안 40 헤르츠의 3 가지 자극을 사용하여 예비 풀의 exocytosis를 유발하고, 또 다른 5-10 개의 이미지를 획득합니다. 그런 다음 이미지 획득을 일시 중지합니다. 뉴런이 최소 20분 동안 회복될 때까지 기다린 후, 대조 실험을 위해 S 2단계에서 이 S 1단계 프로토콜을 다시 반복합니다.
데이터 분석을 위해 이미지를 스택으로 변환합니다. image J 내장 기능을 사용하여 스택의 밝기와 대비를 조정하여 상당한 수평 드리프트가 발생한 경우 동적 범위를 최대화합니다. 실험하는 동안 이미지 J에서 stack reg 및 turbo reg 플러그인을 실행하여 이미지 스택을 정렬합니다.
그런 다음 런타임 시리즈 분석기 플러그인. 다음으로, 최소 90개의 신경 말단에 대한 관심 영역을 정의합니다. 활성 신경 터미널을 드러내기 위해 다이 언로딩 전과 후의 이미지를 전환하는 것이 도움이 됩니다.
이상적인 관심 영역 크기는 일반적인 신경 말단보다 약간 큰 영역입니다. 그런 다음 시간 경과에 따른 각 관심 영역의 총 형광 강도를 구합니다. 그런 다음 Microsoft Excel로 내보냅니다.
여기에 표시된 것은 소뇌 과립 뉴런에 80Hz 10초 자극을 사용하여 10마이크로몰 FM 1 43을 로드한 대조 실험의 흐름도입니다. 다음은 FM 1 43이 로드된 신경 터미널을 보여주는 이미지입니다. 다음은 활성 신경 말단을 식별한 후 분석을 위해 선택된 90개의 번호가 매겨진 관심 영역을 보여주는 동일한 이미지이며, 이는 선택한 시점의 신경 말단의 이미지입니다.
이러한 이미지는 서로 다른 시냅스 소포 풀이 고갈됨에 따른 형광의 변화를 설명하기 위해 유사 색상으로 표시됩니다. 마지막으로, 다음은 이러한 90개의 신경 말단의 정규화된 형광 단위를 보여줍니다. S 1 및 S 2 단계에서 각 순차적 자극의 형광 강하를 측정하고 S 1 단계와 S 2 상 간에 비교할 수 있습니다.
이 대조 실험에서 S 1과 S 2 모두 쉽게 방출할 수 있는 풀과 예비 풀의 크기가 동일했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생명 형광 이미징 기술을 사용하여 중추 신경 말단에 있는 특정 시냅스 소포 풀의 보충 및 동원을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 S 두 가지 실험 조건을 변경하기 전에 S one control 실험을 수행하여 세포 생존율과 반응성을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
개요
이 기사는 중추 신경 종말에서 특정 시냅스 소포 (SV) 풀의 보충 및 이동을 정량화하는 생체 형광 이미징 기술을 설명합니다. 이 방법은 같은 신경 종말에서 두 라운드의 SV 재활용을 모니터링할 수 있게 하여 정확한 정량화를 위한 내부 통제를 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경 과학
- 세포 생물학
- 이미징 기술
배경
- 시냅스 소포 동태를 이해하는 것은 신경 전달에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 생체 이미징 기술은 시냅스 과정을 실시간으로 연구하는 능력을 향상시킵니다.
- 이전 방법은 특정 소포 풀을 효과적으로 추적할 수 있는 능력이 부족했습니다.
- 이 연구는 내부 통제를 제공함으로써 기존 기술을 개선하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 시냅스 소포 풀의 보충 및 이동을 정량화합니다.
- 같은 신경 종말에서 두 라운드의 시냅스 소포 재활용을 모니터링합니다.
- 소포 동태에 대한 다른 로딩 및 언로딩 조건의 영향을 평가합니다.
사용된 방법
- FM 염료를 사용한 생체 형광 이미징으로 시냅스 소포를 시각화합니다.
- 특정 프로토콜을 사용하여 즉시 방출 가능 및 예비 풀의 순차적 고갈합니다.
- 자극 중 소포 동태를 캡처하기 위한 타임랩스 이미징합니다.
- 형광 강도를 정량화하기 위해 이미지 처리 소프트웨어를 사용한 데이터 분석합니다.
주요 결과
- 이 기술은 시냅스 소포 로딩 및 언로딩의 재현 가능한 추적을 허용합니다.
- 내부 통제는 얻은 결과의 유효성을 향상시킵니다.
- 내식작용 모드의 조작은 소포 보충에 중대한 영향을 미칩니다.
- 정량적 분석은 시냅스 소포 풀 크기에 대한 통찰력을 제공합니다.
결론
- 이 방법은 시냅스 소포 동태를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.
- 시냅스 생리학의 주요 질문에 대답할 잠재력을 제공합니다.
- 이 연구 결과는 신경 전달 및 시냅스 가소성에 대한 미래 연구에 영향을 미칠 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables precise quantification of synaptic vesicle pool dynamics, supporting mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. By providing internal controls and differential pool analysis, it enhances predictive confidence in early discovery stages where vesicle trafficking mechanisms are therapeutic targets. The approach addresses variability across preparations, improving reproducibility for cross-functional collaboration in assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic vesicle trafficking pathways to validate targets involved in neurotransmitter release and recycling.
- Operational Value: Provides quantitative, reproducible measurements of readily releasable and reserve pool replenishment under varying stimulation conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates assay-ready readouts of vesicle mobilization kinetics that can be used to screen compounds affecting endocytosis or exocytosis.
- Operational Value: Uses FM dye labeling to produce quantal fluorescence signals proportional to vesicle release, enabling standardized, quantitative screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by quantifying how manipulations of endocytosis modes affect specific vesicle pools in cerebellar granule neurons.
- Operational Value: Enables within-preparation comparisons (S1 vs S2 phases) to control for biological variability, increasing assay reliability in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where understanding vesicle pool dynamics informs mechanism of action and compound effects on presynaptic function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how endocytosis pathways (e.g., clathrin-dependent vs activity-dependent bulk endocytosis) regulate vesicle pool mobilization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (fluorescence decay kinetics) that enable comparison of compound effects on vesicle recycling.
- Analytics: Provides time-resolved fluorescence intensity measurements from regions of interest, allowing calculation of pool-specific replenishment rates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant neuronal models to assess how genetic or pharmacological perturbations alter vesicle trafficking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging workflow that can be adapted across neuronal models and stimulation paradigms for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by isolating the contributions of specific synaptic vesicle pools to neurotransmission dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility through internal controls (dual-phase measurements in same nerve terminals) and standardized FM dye protocols.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in presynaptic target validation, supporting better go/no-go decisions in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on vesicle pool replenishment, a key presynaptic mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live fluorescence imaging and neuronal culture preparation, particularly for primary cerebellar granule neurons.
- Depends on inverted epifluorescence microscopy, cooled CCD camera, electrical stimulation, and perfusion systems for precise solution exchange.
- Necessitates standardization of staining, washing, and stimulation timing across runs to ensure comparable vesicle loading and unloading.
- Must account for variability in nerve terminal density and health, addressed by selecting active terminals and using internal controls.
- Limited to optically accessible preparations; not suitable for high-throughput formats without automation of imaging and analysis.
