Name: FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충과 동원을 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 동일한 신경 말단에서 두 번의 소포 재활용을 모니터링하여 내부 대조군을 제공합니다.

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이 작품은 Wellcome 트러스트 (084277 참조)에서 부여에 의해 지원되었다.

1. 소뇌 과립 신경 세포의 준비 <ol><li> 약 100 25mm 직경의 coverslips (표 1) 압력솥. </li><li> 멸균 폴리 - D - 라이신 용액 (표 2)를 포함하는 50 ML 멸균 튜브에 장소 coverslips. 코트 coverslips를 2 H의 회전 플랫폼에 넣습니다. </li><li> 층류 흐름 후드의 살균 티슈에 드라이 코팅 coverslips (표 1). </li><li> 무균 6 잘 접시와 CO 2 배양기 (표 1) 따뜻한. Coverslips로 장소 coverslips은 사용하기 전에 4 ° C에서 1 달 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 지역 윤리위원회 지침에 따라 강아지 칠일 오래된 스프 Dawley 쥐를 안락사. 우리는 자궁 경부 전위를 사용하여 새끼를 euthanized. </li><li> 소뇌를 해부하다하고 인산염 소금 솔루션 (솔루션 B, 표 3) 버퍼를 포함하는 무균 배양 접시에 넣습니다. </li><li> 4-6 쥐 새끼에 대한 단계 1.5 1.6 반복합니다. </li><li> Cerebella은 다음 McIlwain 조직 조의 멸균 무대에 표시됩니다pper (표 1). 조직은 90 °를 통해 무대를 회전하고 과정을 반복하기 전에 375 μm의 간격으로 잘게 수 있습니다. </li><li> 썬 cerebella는 이전에 다음 ID로 37 기까지했다 트립신 용액 (솔루션 T, 표 4) ° C.로 전송됩니다 </li><li> 37 품어 cerebella ° C 부드러운 교반 약 5 분마다 20 분. </li><li> tryptic 소화하는 동안, 불꽃 폴란드어 세 멸균 유리 pipettes (표 1) 분젠 불꽃을 사용합니다. pipettes의 각 입을시 벌금 보어, 중간 구멍 및 넓은 구멍을 만들 불꽃을 사용합니다. </li><li> 솔루션 T 20 분 부화 후 benchtop의 원심 분리기에서 1 분 (표 1) 1,000그램에서 소뇌 정지 및 펠렛 세포에 트립신 / DNase 억제제 솔루션 20 ML (솔루션 W, 표 5)을 추가합니다. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다하고 넓은 구멍 피펫을 사용하여 농축 트립신 / DNase 억제제 (솔루션 C, 표 6) 1.5 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li>이것은 중요한 단계, 정지이 단계에서 동질해야합니다. </li><li> 10 ML 위에 레이어 세포 현탁액 prewarmed (37 ° C) 살균 15 ML 튜브에 소 혈청 알부민 보충 Earles 균형 소금 솔루션 (표 7). </li><li> 1천5백그램에서 5 분 정지를 원심과 prewarmed 2 MLS에있는 세포 펠렛 (37 ° C) 배지 (표 8).을 resuspend </li><li> 혈구계를 사용하여 셀 번호 (표 1)을 추정하고 ML 당 3.3 X 10 6 세포의 최종 밀도에 세포 현탁액을 희석. </li><li> 전지는 폴리 - D - 라이신 코팅 coverslips (최종 농도 2.5 × 10 5)의 중심에 세포 현탁액의 75 μl를 추가하여 도금입니다. </li><li> coverslips를 포함하는 문화 플레이트로 세포 수 있도록 60 분에 대한 CO 2 배양기에 배치됩니다dhere. </li><li> 각각 잘 도금 세포를 방해하고 CO 2 배양기로 배양 접시를 반환하지 않도록 돌봐으로 문화 매체의 1.5ml을 추가합니다. </li><li> 그 다음날은 mitotic 억제제 사이 토신의 arabinoside (표 8)과 보충 신선한 문화 매체와 문화 매체를 교체합니다. 문화에 glial 세포의이 체포 확산. </li></ol> 2. 실험 설정 <ol><li> 기본 실험 설치 (표 1 및 사용되는 특정 장비 및 소프트웨어에 대한 9 참조)은 다음으로 구성한다 : <ul><li> 거꾸로 에피 형광 현미경 </li><li> 냉각 CCD 카메라 </li><li> 형광등 광원 (단색 또는 필터 휠) </li><li> 중력 재관류 장치 </li><li> 병렬 백금 전극과 영상 챔버 </li><li> 전기 자극기 </li><li> 컴퓨터 </li><li> 이미지 수집 소프트웨어 </li></ul></li><li> 실험 빨간불이 cond에서 어두운이나 수행되어야샘플 최소 형광등 조명과 itions은 표백 FM 염료를 피할 수 있습니다. </li><li> 실험은 상온에서 수행하고 있습니다. 생리적 온도가 필요한 경우, 온도 제어 재관류 시스템을 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 샘플 준비 <ol><li> 문화는 체외에서 8-12일 후 사용해야합니다. </li><li> 새로운 매체 안정화를 허용하도록 실온에서 10 분에 대한 생리 식염수 (표 10)에 하나의 coverslip을 전송합니다. </li><li> , coverslip을 제거 아래쪽 및 종이 타월이나 흡수성 종이의 작은 조각으로 연결된 세포 주변 지역을 건조. </li><li> 접착제는 영상 챔버의 아래쪽에, 실리콘 그리스 (표 2) coverslip 사용합니다. 세포는 두 평행 전선 사이 여야합니다. 충분한 실리콘 그리스는 목욕 챔버의 중앙을 입력하는 기름없이 완전히 챔버 밀봉하는 데 사용되지만해야합니다. </li><li> 부드럽게 ~ 260 μl SA와 함께 목욕 챔버를 채울라인 솔루션과 다음 같은 솔루션을 입력 튜빙을 작성하십시오. </li><li> 접착제 챔버의 상단에 실리콘 그리스와 깨끗한 coverslip 그것을 날인합니다. 입력 및 출력 튜브는 챔버에 갇혀있는 공기 방울을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 전기 회로가 공기 방울에 의해 중단되지 것이 중요합니다. </li><li> 스테인레스 스틸 플랫폼 이미징 챔버를 Immobilise 부드럽게 입력 튜브를 통해 생리 식염수를 perfusing하여 누출이 있는지 확인합니다. </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에 조립 챔버를 탑재하고, 중력 재관류 시스템에 챔버를 연결, 먼저 생리 식염수로 입구를 준비하는 데. </li><li> 전기 자극기로 챔버의 와이어를 연결하는 연결합니다. </li><li> 석유 렌즈를 사용하면 목표에 침지 기름 한 방울을 추가합니다. 명시야 조명을 사용하여 챔버의 중앙에있는 세포에 초점. </li></ol> 4. S1 단계 <ol><li> 1.5 ML과 Perfuse 뉴런생리 식염수에 희석 FM 염색 (표 2). </li><li> 첨부된 자극기를 사용하여 염료 이해를 연상하는 뉴런을 자극. </li><li> 자극 후, 2 분 신선한 생리 식염수로 perfuse 뉴런 멀리 초과 FM 염료 (유량 7 ML / 분)을 씻어 있습니다. CGN 문화 시스템에 Glial 오염이 5 % 미만 14, 따라서이 시간 프레임은 염료를 제거하는 충분하다 . </li><li> 8 분을 위해 나머지 뉴런 둡니다. </li><li> 이 간격 동안, 개별 FM 염료 로드된 신경 단말이 표시를 사용하여 플루오레신 파장 (; 방출&gt; 550 nm의 여기, 480 NM)입니다 axonal 네트워크를 찾습니다. 세포 클러스터와 지역을 피하십시오.이 단계에서 최소로 조명을 계속 강한 여진이 염료 phototoxicity이 발생할 수 있기 때문입니다. 이 명백한 증거는 axons과 염료 하역 부족 (해결을 염료에 의한)의 blebbing 수 있습니다. </li><li> 다시 초점 이미지는 즉시 이미지 수집하기 전에 약간의 드리프트 때문에 나머지 기간 동안 발생했을 수 있습니다. 리&gt; </li><li> 한 프레임의 속도 매 4 S.에서 촬영된 이미지 수집을 시작합니다 </li><li> 5 인수 후 - 10 기준 이미지를, 2의 (60 행동 잠재력) 8 30 Hz에서 자극을 제공하여 RRP의 exocytosis를 연상 프레임 캡처 후 수동으로 즉시 자극 하십시요.. </li><li> 또 다른 10 이미지를 인수 후, 각 30의 간격이 8, 10의 (400 액션 잠재력) 40 Hz에서 세 stimulations를 사용하여 RP의 SV exocytosis를 보여주고 있습니다. </li><li> 또 5 습득 - 10 이미지와 다음 일시 정지 이미지 수집합니다. </li></ol> 5. 복구 단계 (그림 2 참조) <ol><li> 뉴런은 적어도 20 분 이상 복구할 수 있습니다. </li><li> 옵션 - endocytosis에 약물의 영향이 시험하는 경우,이 기간 (그림 2B) 3,8 중 약물 솔루션 perfuse 뉴런. </li></ol> 6. S2 단계 <ol><li> 로보기 같은 필드를 사용하여 제어 실험 S1 위상 프로토콜 (섹션 4) 반복S1 인치 </li><li> 옵션 - endocytosis에 약물의 효과가 검증이있다면, FM 염료 (그림 2B) 3,8와 보충 마약 솔루션 뉴런을 perfuse. </li><li> 옵션 - exocytosis에 약물 효과가 관심있는 또는 경우 이전과 RRP와 RP 하역의 자극 (그림 2C) 3시 두 약물 솔루션 perfuse 뉴런. </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> ImageJ 및 Microsoft Excel 또는 데이터 분석을위한 유사한 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 분석을 위해, 스택 형식의​​ 이미지 시퀀스가​​ 필요합니다. 일부 이미징 소프트웨어는 단일 이미지로 시퀀스를 내보낼 수 있습니다. 이 경우 스택에 ImageJ 내장 함수 이미지&gt; 스택&gt; 이미지를 사용하여 스택으로 이미지를 변환합니다. </li><li> 동적 범위를 극대화하기 위해 스택의 밝기와 대비를 조정합니다. 이미지&gt; 조정&gt; 밝기 / 명암 (그림 3A). </li><li> 중요한 수평 드리프트는 t 동안 발생한 경우그는 실험을 실행 StackReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a> )와 TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a> ImageJ에서) 플러그인 이미지 스택 (그림 3B)를 정렬하기 . </li><li> 시간 시리즈 분석기 플러그인 (실행 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a> ) (그림 3C)를. </li><li> 최소 90 신경 터미널을 통해 관심을 (ROIs)의 영역을 정의합니다. 이들은 동일해야합니다 (1.5 μm의 직경과 원형 ROIs) 그것은 전에 이미지 사이의 전환에 도움이되고 염료가 활성 신경 터미널 (또는 사전에 자극 이미지가 포스트 자극 이미지에서 빼서 수) 공개에 하역 후. 이상적 투자 수익 (ROI) 크기는 전형적인 신경 터미널 (그림 3C)보다 약간 더 큰 하나입니다. </li><li> 팀이 지남에 따라 각 투자 수익 (ROI)의 통합 / 총 형광 강도를 구합니다Microsoft Excel에서 (그림 3D 및 4A​​) 전자 및 수출. </li><li> S1과 S2 두 단계의 첫 번째 하역 자극 (그림 4B - C)에 대한 Y - 축 비행기의 흔적을 정렬하여 동일한 임의의 값으로 투자 수익 (ROI) 추적을 Normalise.이 배경 형광 강도의 작은 변화를위한 제어하는 것입니다. </li><li> S1과 (그림 4D) 다음과 S2에 대한 임의의 형광 유닛의 각 하역 자극에 의​​해 evoked 형광의 절대 감소를 측정 : <ul><li> 형광의 RRP = 변경 (ΔF은) 30 Hz에서 두의에 의해 발생 </li><li> ΔF의 RP = SUM은 3 X 40 Hz에서 10의에 의해 발생 </li><li> 총 재활용 수영장 = RRP + RP </li></ul></li><li> 7.9의 각 관련 매개 변수에 대해, 하나의 실험의 모든 신경 터미널을 통해 의미 가치를 계산합니다. </li><li> 통계 분석을 위해, 여러 독립적인 실험에서 얻은 값을 평균 수 있습니다 의미합니다. 오히려 신경 단말기의 수보다 coverslips의 숫자는 statistica로 사용해야리터 N. </li></ol> 8. 대표 결과 : CGNs가 동일 로딩 및 언로 드 단계의 두 라운드를 받았습니다 제어 실험은 그림 5에서 표시됩니다. 일련의 실험을 시작하면, 그것은 이와 같은 제어 실험 S1과 S2는 S2 중에 실험 조건을 변화하기 전에 비교할 수 있는지 확인하기 위해 매일 수행되는 것이 중요합니다. 이 예제에서는 CGNs는 80 Hz에서 10 님의 자극 (그림 5A)를 사용하여 10 μm의 FM1 -​​ 43 탑재했다. 그림 5B는 형광 puncta로 표현 FM1 -​​ 43 - 로드된 신경 터미널을 보여줍니다. 그림 5c 같이 ROIs 90 신경 터미널을 통해 정의되었다. ROIs의 동일한 집합 S1과 S2 모두 사용되었다. 모두 언로 드하는 동안, RRP 먼저 RP 3 연속 40Hz (10의) 자극 (그림 5A)와 하역 다음 30 Hz에서 (2들) 자극과 언로 드되었습니다. 각 자극하는 동안 형광 드롭은 명확하게 (5D - E 그림) 관찰 및 계량하실 수 있습니다. 조사하면 형광이 RRP에 해당하는 방울, RP 및 총 재활용 수영장 S1과 S2 모두 비교했다. 80 %가 S1과 S2에서도 RP에 살고있는 동안뿐만 아니라, 재활용 SVS의 20 %는 RRP에 살고. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 전형적인 FM 실험의 그림 1 도식 다이어그램. A) SV의 endocytosis는 FM 색소 (녹색으로 표시)의 면전에서 실행됩니다. 염료 invaginating 멤브레인 (단일 SVS 또는 일괄 endosomes)에 의해 이루어집니다. 플라즈마 막에 B)이 아닌 내면 염료는 재관류에 의해 씻겨이다. C) 형광의 손실 발생하는 플라즈마 막과 함께 릴리스 퓨즈에 대해 사용할 수 있습니다 SVS 표시 하역 자극의 신청시. D) 출시 라벨 SVS의 금액에 비례 형광 (ΔF)의 변화는 다음 계량하실 수 있습니다. _upload/3143/3143fig2.jpg "/&gt; 가능한 실험 프로토콜 2 도식 다이어그램을 그림. 세포가 로딩과 (S1과 S2) 하역 FM 염료의 두 ​​라운드를 받아야 제어 실험) 플로우 차트. 세포는 여러 자극의 범위를 사용하여 로드할 수 있습니다. 하역 단계는 10 s의 3 번 40 Hz에서 언로 드를 사용하여 RP 다음 RRP는 2의 30 Hz에서와 언로 드한다는 점에서 동일합니다 RRP 및 예약 수영장 내리기의 자극은 30 초 40 초, 다른 모든 자극으로 구분되었다. 전지는 S1과 S2 사이에 20 분에 대한 복구 남아 있습니다. B 중 하나에있는 물질의 효과를 테스트하기 위해 가능한 변경의 흐름 차트) endocytosis 또는 C) exocytosis도 표시됩니다. 대응 시험 약물이 표시된 기간 동안 의회에 perfused 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 이미지 J의 데이터 분석 화면 캡처 그림 3. 스크린샷이 표시됩니다이미지 J.를 사용) 밝기 및 대비 조정, B) 프레임 정렬, C) ROIs 선택, 그리고 D) 강도 값을 추출을위한 <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 Microsoft Excel에서 데이터 분석 4 스크린샷. 스크린샷은)는 이미지 J (1 일 칼럼에서 원시 데이터를 가져오기위한 표시됩니다 = 프레임 번호, 개별 신경 터미널에서 나머지 항목은 = 데이터) B) 시작시 임의의 값 (200)에 S1 기준 값 (프레임 10)의 조정 S1에 동일한 프로토콜을 사용하여 프레임 55에서 S2 기준 값의 첫 번째 자극의 C) 조정 및 Microsoft Excel을 사용하여 형광 안약 D) 측정. D에 표시된 평균 추적는 각 드롭 전후의 시간 지점을 정의하는 데 사용됩니다. 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 형광 방울의 크기는 C로 표시된 스프레드 시트에서 값에서 결정되어야 <img alt="그림 5" src='"/' files> 그림 5. 대표 제어 실험. CGNs가 80 Hz에서 (10의) 자극을 사용하여 10μM FM1 -​​ 43 탑재했다 제어 실험) 플로우 차트. S1과 S2 단계는 동일합니다. RRP 및 예약 수영장 내리기의 자극은 30 초 40 초, 다른 모든 자극으로 구분되었다. B) 신경 터미널을 보여주는 이미지는 FM1 -​​ 43 탑재. C) 90 번호를 ROIs을 보여주는 B로 동일한 이미지 분석을 위해 선택했습니다. D) 선택한 시간 지점에서 B에 빨간색 상자가 그려져 지역의 이미지. 자극을하기 전에 기초 =; 30 Hz에서 = 30 Hz에서 2의 자극 후, 40 Hz에서 1,2,3 = 각 40 Hz에서 10의 자극 후. 이러한 이미지는 형광의 변화 (오른쪽에 표시되는 스펙트럼 바) 설명하기 pseudocolor로 표시됩니다. E) C. 개인 자극에 묘사된 90 신경 터미널에서 얻은 ± SEM 추적이 가로 막대로 표시됩니다 의미합니다. 스케일 바 = 10 μm의.

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

FM 염료가 광범위하게 많은의 연결 준비에 신경 터미널 기능을 조사하는 데 사용됩니다. 그들은 어느 SV의 endocytosis, SV 매출액 또는 exocytosis 6 반응 속도론의 범위를 모니터링하기 위해 주로 고용되어있다. 설명 프로토콜은 특정 SV 수영장의 하역 차등을 검토하는 연구를 확장합니다. 이것은 SV 수영장의 보충 또한 동원 자신의 범위에 관한 추가 정보를 제공합니다. FM의 염료는 동일한 신경 터미널 내에 SV 재활용의 여러 라운드 레이블을 사용할 수 있습니다. 우리는 각 터미널에서 SV 회전율이 동일한 신경 터미널에 두번 모니터링할 수있는 프로토콜을이 속성을 이용하여 설계했습니다. 이것은 병렬로 인해 신경 터미널 11 SV 재활용의 이기종 자연 필수적이다 정확한 내부 통제를 제공합니다. 내부 통제로 S1 단계의 사용을 통해 RRP, RP 및 전체의 충진약물의 존재 SV 수영장은 안정과 직접적으로 비교할 수 있습니다. 재활용의 절대 크기의 정보를 제공하는 이외에, RRP와 RP 수영장 다른 자극 조건 하에서,이 프로토콜은 다음을위한 데이터를 제공할 수 - 1) 재활용 수영장의 함수로 RRP와 RP 사이 SVS의 파티션 S1과 S2, 2) 총 S1 재활용 수영장과 S1에서 같은 수영장의 함수로 S2에 정의된 SV 수영장 3) 상대적인 크기의 함수로 S2 수영장의 상대적 크기 (RRP와 RP). 인수 시간 (운동 측정을위한 수집 시간이 가능하고 이미지 캡처 동기화 자동으로 언로 드처럼 신속한한다) 너무 느린이기 때문에 이것은 특정 프로토콜 그러나 하역 속도론에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 우리의 30 Hz에서 2 님의 자극은 hypertonic 자당 8 하역 RRP의 동일한 범위를 끝. RRP의 크기 때문에15 하역 hypertonic 자당에 의해 정의되고, 우리는 hippocampal 뉴런 16 연구와 계약에,이 프로토콜은 모든 RRP SVS를 언로 드되는 상태 수 있습니다. 예약 수영장은 거의 400 자극이 자극 때문에 (40 Hz에서 10의 각) 모든 염료로 분류 SVS의 95 %를 depletes 패러다임 (50 MM KCl 2 자극)에 염료의 동일한 금액을 언로 드 세 기차로 소진 8,17. RRP 및 보유 수영장 모두의 크기의 정확한 양을 정함 또한 CCD 카메라의 선형 동적 범위 내에서 정보를 취득에 따라 달라집니다. 이 간단한 프로토콜은 또한 더 이상 수정할 수 있습니다. 로딩 자극의 강도는 방법의 연결 활동 및 다른 endocytosis 모드는 SV 풀 보급에 영향을 결정하기 위해 다양한 수 있습니다. 필요한 경우 또한,로드 및 언로드보다보다 두 사이클도 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 overexpression 또는 중과 transfected 세포에도 사용할 수 있습니다shRNA 벡터. 기본의 연결을 문화의 낮은 transfection 효율로 인해, 표현 단백질은 형광 단백질 태그가 있어야합니다. 그것은이 형광 태그 (예를 들어, 시안이나 붉은 단백질을 사용) FM 염료 신호를 방해하지 않는 것이 중요합니다. 이 경우에는 볼 같은 분야에서 transfected 및 비 - transfected 세포에서 신경 터미널도 추가 제어 8로 비교할 수 있습니다. 섭동가 모두로드하는 동안 존재이기 때문에 이러한 실험에서 S1과 S2 사이의 하중 부하의 범위의 비교, 작은 가치입니다. SV 풀 사이에 염료 파티션 수는 있지만, 8 시각하실 수 있습니다. 유전자 기자 pHluorins도 기본의 연결을 문화 SV exocytosis와 endocytosis을 모니터 고용 수 있습니다했다. 이 프로브는 뱀파이어, synaptophysin 및 VGLUT1 18과 같은 태그 SV 단백질의 luminal 도메인의 산도 환경 산도에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용하여 </suP&gt;. 기공을 갖는 ATPase 억제제와 함께 사용하면, pHluorins는 SV 풀 동원 19 반응 속도론과 범위를 모두 보고할 수 있습니다. FM - 염료 기반의 접근 방식은 여기에서 설명한 것은 pHluorin 기술을 통해 몇 가지 이점을 가지고, 첫째, FM 염료는 SV의 endocytosis 모드 RRP 및 예약 풀 8 모아있는 정보를 제공합니다. 둘째 특정 SV 풀은 20 개의 다른 스펙트럼 특성을 가지고 있으며 마지막 transfection에 대한 요구가 없습니다 FM 염료로 분류하실 수 있습니다. 볼 수 있도록 endocytosis 동안 염료로로드해야 정의 SVS로부터 FM 염료는 휴식과 (pHluorins 19 대조적으로) 그러나 SV 풀을 재활용 사이의 SV 트래픽에 대한 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서 FM 염료와 pHluorins 모두 강점과 약점을 가지고 있으며 같은 질문을 해결하기 위해 독립적인 실험에 이용했을 때 가장 강력한 있습니다. 고품질의 이미지는 유효한 분석과 reproducib에 필수적인르 결과입니다. 수평 드리프트가 쉽게 해결할 수 있지만, Z - 축에 표류이 실험은 복구할 수 없습니다. 이러한 이유로, S1과 S2 언로 드를 시작하기 전에 이미지를 다시 집중하는 것이 중요합니다. 중요한 형광 부패가 발생하는 경우에, 붕괴의 수정은 (일반적으로 자극의 부재에서 FM -로드 세포에서 이전에 기록된 추적을 빼서으로) 적용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 감​​쇠 보정만이 어떠한 정량 분석​​을 위해 사용되는 그래픽 표현 및 없습니다 수행할 것을 권장합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM 목사 3 디지털 카메라 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio Observer.A1 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> 세포 배양 접시 (6 웰스) </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 657,160 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 (유니버설 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 인큐베이터 </td><td> Heraeus 인 스트 루먼트 </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> 팔콘 튜브 (50분의 15 ML) </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 210,261분의 188,271 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0.75 ∞ / 0.17 목표 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> 유리 coverslips (Ø25mm) </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> 유리 파스퇴르 pipettes (230 NM) </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> 혈구계 </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> 이미징 챔버 </td><td> 워너 </td><td> RC - 21 BRFS </td></tr><tr><td> 층류 후드 </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain 조직 헬리콥터 </td><td> Mickle 연구소 엔지니어링 주식 회사 </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> 수은 램프 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim 시스템 전기 자극기 (100mV, 1ms pluse 폭) </td><td> Digitimer (주) </td><td> D330 </td></tr><tr><td> 재관류 펌프 </td><td> 왓슨 - Marlow </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Serological Pipettes (5/10/25 ML) </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> 셔터 컨트롤러 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> 주사기 (20 ML) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01 - B002 </td></tr><tr><td> 주사기 필터 (Minisart - 0.20 μm의) </td><td> Sartorius Stedim </td><td> 16,532 </td></tr><tr><td> VC - 6 여섯 채널 밸브 컨트롤러 </td><td> 워너 </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP FilteR 세트 (46 세트) </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> 표 1. 사용하는 특정 장비 및 장치 <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> FM1 -​​ 43 </td><td> BioScience 캠브리지 </td><td> BT70021 </td><td> 10 μm의 </td></tr><tr><td> FM2 - 10 </td><td> BioScience 캠브리지 </td><td> BT70044 </td><td> 100 μm의 </td></tr><tr><td> 폴리 - D - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P7886 </td><td> 15 μg / ML </td></tr><tr><td> 실리콘 그리스 </td><td> 시그마 </td><td> 85,403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> 표 2. 사용되는 특정 시약 <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 </td><td> A4503 </td><td> 0.3 % </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G5767 </td><td> 0.25 % </td></tr><tr><td> MG4 SO · 7H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> M2773 </td><td> 1.5 MM </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> Gibco </td><td> 21,300 </td><td> 960 mg/100의 ML </td></tr></tbody></table> 각 준비 신선한 100ml를 만들 사용하기 전에 - 살균 필터 표 3. CGN 준비를위한 솔루션 B <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> 솔루션 B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 ML </td></tr><tr><td> 트립신 (5 밀리그램 / ML 주식, -20 ° C) </td><td> 시그마 </td><td> T9201 </td><td> 한 ML </td></tr></tbody></table> 표 4. CGN 준비를위한 솔루션 T <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> 솔루션 C </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3.2 ML </td></tr><tr><td> 솔루션 B </td><td align= &quot;센터&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16.8 ML </td></tr></tbody></table> 표 5. CGN 준비를위한 솔루션 W <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNase, 0.5 ML 재고 당 500 U, -20 ° C) </td><td> 시그마 </td><td> D5025 </td><td> 0.5 ML </td></tr><tr><td> MgSO 4 명이 7H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> M2773 </td><td> 1.5 MM </td></tr><tr><td> 솔루션 B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 대두 트립신 억제제 (SBTI, 0.5 ML 재고 당 0.5 MG, -20 ° C) </td><td> 시그마 </td><td> T9003 </td><td> 0.5 ML </td></tr></tbody></table> 표 6. CGN 준비를위한 솔루션 C <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 </td><td> A4503 </td><td> 4퍼센트 </td></tr><tr><td> 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24,010 </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> MgSO 4 명이 7H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> M2773 </td><td> 3 MM </td></tr></tbody></table> 표 7. CGN 준비를위한 EBSS 솔루션 <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> 사이 토신 β - D - arabinofuranoside (ARA - C) * </td><td> 시그마 </td><td> C1768 </td><td> 10 μm의 </td></tr><tr><td> Foetal 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 10,106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G5767 </td><td> 30 MM </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 시그마 </td><td> G3126 </td><td> 이 MM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 </td><td> P5405 </td><td> 25 MM </td></tr><tr><td> 최소한의 필수 중간 (가상) </td><td> Gibco </td><td> 21,090 </td><td> 500 ML </td></tr><tr><td> 페니실린 (P) / 스트렙토 마이신 (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td> 100 U / ML (P), 100 μg / ML (S) </td></tr></tbody></table> * 아라 - C는 1 DIV의 이후 매체에 추가되어야합니다 표 8. CGN 준비를위한 문화 미디어 <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 버전 </th><th> 회사 </th></tr><tr><td> AxioVision 상대적. </td><td> 4.8 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> 건강의 국립 연구소 </td></tr><tr><td> Microsoft Excel을 </td><td> 2003 </td><td> 마이크로 소프트 </td></tr></tbody></table> 표 9. 특정 컴퓨터 소프트웨어 사용 <table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 아무 카탈로그 없습니다. </th><th> 집중 </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2 시간 2 O </td><td> 시그마 </td><td> C7902 </td><td> 1.3 MM </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G5767 </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 </td><td> P5405 </td><td> 3.5 MM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 시그마 </td><td> P9791 </td><td> 0.4 MM </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> M0250 </td><td> 1.2 MM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71,378 </td><td> 170 MM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71,627 </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> 나이 SO 4 </td><td> BDH 실험실 소모품 </td><td> 10,264 </td><td> 1.2 MM </td></tr><tr><td> TES </td><td> 시그마 </td><td> T1375 </td><td> 20 MM </td></tr></tbody></table> 표 10. 생리 식염수 (산도 7.4)

fm 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

중앙 신경 터미널에서 신경 전달 물질 릴리스 후, SVS는 신속하게 endocytosis에 의해 검색됩니다. 주소 SVS는 다음 신경 전달 물질과 리필 및 exocytosis 1,2 사용할 수 있습니다 SVS로 정의된 재활용 수영장, 다시 가입하고 있습니다. 쉽게 releasable 수영장 (RRP)와 예약 수영장 (RP) - 재활용 수영장은 일반적으로 별개의 두 수영장으로 세분화 될 수 있습니다. 그들의 이름이 암시로 RRP는 RP SVS는 강렬한 자극 1,2 동안에만 출시하는 동안 즉시 융합에 대해 사용할 수 있습니다 SVS로 구성되어 있습니다. 1) 이해하기 위해 이러한 SV 수영장의 차등 보충보고 신뢰성있는 분석을하는 것이 중요합니다 어떻게 SVS의 endocytosis의 다른 모드 이후 트래픽 (예 : clathrin 종속 endocytosis 및 활동에 의존 대량 endocytosis) 및 2) 메커니즘 다른 자극에 대한 응답으로 RRP와 RP 모두 동원을 조절. FM의 염료는 정기적으로 채용 아르에드는 양적 중앙 신경 터미널에서 3-8 SV 매출액을보고합니다. 그들은 세포막에 걸쳐 지질 이중층에 가역 파티션을 허용 소수성 탄화 수소 꼬리와 친수성 ​​머리 그룹 차단 통로 있습니다. 염료는 수용액에서 약간의 형광지만, 막 9 분할 때 자신의 양자 수율이 크게 증가합니다. 따라서 FM 염료 적극적으로 SVS를 재활용 추적에 이상적 형광 프로브입니다. 다음과 같은 FM 염료의 사용을위한 표준 프로토콜입니다. 먼저 그들은 뉴런에 적용되며 (그림 1) endocytosis 동안 촬영하고 있습니다. 비 내면 염료는 재활용 수영장 내에 플라즈마 막, 재활용 SVS의 재배 포할에서 씻겨 후. 이러한 SVS는 다음 하역 자극 (그림 1)를 사용 고갈됩니다. SVS의 FM 염료 라벨이 quantal 10 때문에, 결과 형광 드롭 출시 vesicles의 금액에 비례합니다. 따라서 SVS의 재활용과 융합은 PR에서 생성된endocytosis의 evious 라운드가 안정적으로 계량하실 수 있습니다. 여기, 우리는 정보의 두 개의 추가 요소를 얻기 위해 수정되었습니다 프로토콜을 제시한다. 첫째, 순차 하역 자극이 differentially 특정 SV 수영장의 보충의 부량 수 있도록, RRP와 RP를 언로 드하는 데 사용됩니다. 둘째, 각 신경 터미널 두 번 프로토콜을 겪습. 따라서, S1에서 동일한 신경 터미널의 반응은 내부 통제를 제공하고, S2 단계 (그림 2)에서 시험 물질의 존재에 대해 비교할 수 있습니다. 다른 신경 터미널 건너편 SV 재활용의 범위 11 높은 변수이기 때문에 이것은 중요합니다. 모든 자기편 기본의 연결을 문화가이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 그러나 도금 밀도, 솔루션 및 자극 조건 소뇌 과립 뉴런 (CGNs) 12,13에 최적화되어 있습니다.

중앙 신경 터미널에있는 보충 및 특정 시냅스 소포의 동원 (SV) 풀을 수치 라이브 형광 이미징 기술이 설명되어 있습니다. SV 재활용의 두 발만 내부 통제를 제공하는 동일한 신경 터미널에서 모니터링하고 있습니다.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

중추 신경 말단에서 신경전달물질이 방출된 후, 시냅스 소포(SV)는 세포내섭취(endocytosis)를 통해 빠르게 회수됩니다. 회수된 시냅스 소포는 그 후 ...로 다시 채워집니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 형광 이미징 기술을 사용하여 중추 신경 말단 내 특정 시냅스 소포 풀의 보충 및 동원량을 정량화하는 것입니다. 이는 동일한 신경 말단에 FM 염료를 사용하여 두 차례의 시냅스 소포 재순환을 모니터링함으로써 유효한 내부 대조군을 확보하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 특정 언로딩 프로토콜을 사용하여 즉시 방출 가능 풀과 예비 풀을 순차적으로 고갈시키며, 이를 통해 상대적인 풀 크기를 정량화할 수 있습니다.다음으로, 선택한 변동 사항이 시냅스 소포, 풀 보충 또는 동원화에 미치는 영향을 연구하기 위해 로딩 또는 언로딩 조건을 변경합니다. 결과에 따르면, 유도된 염료 언로딩의 정량화 및 분석을 기반으로 서로 다른 시냅스 물리적 풀의 FM d 로딩이 재현 가능함을 보여줍니다. fluent 계열의 유전적 리포터와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 내세포작용을 거친 시냅스 소포에 의한 풀의 보충을 구체적으로 추적할 수 있다는 점입니다.또한 정밀한 정량화가 가능합니다. 이 프로토콜은 동일한 신경 말단에서 두 번 수행되므로 내부 대조군을 제공합니다. 이 방법은 특정 엔도사이토시스 모드의 조작이 전체 재활용 풀(total recycling pool)과 그 내부의 즉각 방출 가능 풀(readily reusable pool) 및 예비 풀(reserve pool)과 같은 시냅스 CLE 풀의 보충에 어떻게 영향을 미치는지와 같이 시냅스, CLE, 엔도사이토시스 및 엑소사이토시스 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.기본 실험 장치는 도립 에피 형광 현미경, 냉각 CCD 카메라, 형광 광원, 중력 관류 장치, 평행 백금 전극과 전기 자극기가 포함된 이미징 챔버 및 컴퓨터로 구성되어야 합니다. FM 염료의 퇴색을 방지하기 위해 시료에 대한 형광 조명을 최소화하여 암실 또는 적색광 조건에서 실험을 수행하십시오. 생후 7일 된 Sprague-Dawley 랫 펍을 사용하여 소뇌 과립 뉴런의 일차 배양물을 준비함으로써 이 절차를 시작하십시오.배양 준비가 완료되면, poly D lysine이 코팅된 25 millimeter 커버슬립 중앙에 뉴런을 한 방울 떨어뜨려 분주하며, 이때 방울의 직경이 7 millimeter를 초과하지 않도록 합니다. 1시간 후, 뉴런에 2 millilitre의 배양액을 추가하고 7일 동안 배양합니다. 새로운 배지에서 안정화될 수 있도록 상온의 식염수 용액에 커버슬립을 10분 동안 담가 둡니다. 그 후, 커버슬립을 꺼내어 하단면과 부착된 세포 주변 영역을 작은 종이 타월이나 흡수지로 닦아 건조시킵니다.그 후, 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 이미징 챔버 바닥에 접착합니다. 세포는 두 개의 평행한 와이어 사이에 위치해야 합니다. 배스 챔버 중앙부까지 침범하지 않도록 주의하며, 챔버를 완전히 밀봉할 수 있을 만큼 충분한 양의 실리콘 그리스를 사용하십시오.다음으로, 배스 챔버에 약 260 µL의 생리식염수를 조심스럽게 채웁니다. 그런 다음 입구 및 출구 튜브를 동일한 용액으로 채웁니다. 깨끗한 커버슬립에 실리콘 그리스를 발라 상단에 부착함으로써 챔버를 밀봉합니다.그 후, 입구 및 출구 튜브를 사용하여 챔버 내에 갇힌 공기 방울을 모두 제거합니다. 그런 다음 이미징 챔버를 스테인리스 스틸 플랫폼에 고정합니다. 입구 튜브를 통해 식염수를 천천히 흘려보내 누출 여부를 확인합니다.다음 단계는 조립된 챔버를 도립 현미경의 스테이지 위에 장착하는 것입니다. 중력 관류 시스템의 입구에 식염수를 채워 프라이밍하고 챔버를 입구에 연결하십시오. 그런 다음 챔버의 연결 와이어를 전기 자극기에 연결하십시오.희석된 fm dye 1.5 milliliters를 사용하여 뉴런을 관류합니다. 이어서 연결된 자극기를 사용하여 뉴런을 자극함으로써 염료 섭취를 유도합니다. 자극 후에는 신선한 식염수로 뉴런을 2분 동안 관류하여 과량의 FM dye를 씻어냅니다. 그런 다음 뉴런을 식염수 상태로 8분 동안 유지합니다.그동안 개별 FM D가 로딩된 신경 말단이 보이는 축삭 네트워크를 찾으십시오. 이때 플루오레세인 파장을 사용하십시오. 세포가 밀집된 영역은 피하십시오.휴식기 동안 약간의 드리프트가 발생했을 수 있으므로, 이미지 획득 직전에 즉시 초점을 다시 맞춥니다. 4초마다 한 프레임의 속도로 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다. 5~10장의 기저선 이미지를 획득한 후, 2초 동안 30 Hz 자극을 주어 즉시 방출 가능 풀(readily releasable pool)의 엑소사이토시스를 유도합니다.10장의 이미지를 추가로 획득한 후, 40 Hz의 자극을 10초 동안 3회 가하고 자극 간 간격을 40초로 설정하여 예비 풀의 시냅스 소포 외배출을 유도한 다음, 5~10장의 이미지를 추가로 획득하십시오. 그 후 이미지 획득을 일시 중지합니다. 뉴런이 최소 20분 동안 회복되도록 한 뒤, 대조군 실험을 위해 이 S1 단계 프로토콜을 S2 단계에서 다시 반복하십시오.데이터 분석을 위해 이미지를 스택으로 변환하십시오. ImageJ 내장 함수를 사용하여, 상당한 수평 드리프트가 발생한 경우 스택의 밝기와 대비를 조정하여 동적 범위를 최대화하십시오. 실험 중에 ImageJ의 stack reg 및 turbo reg 플러그인을 실행하여 이미지 스택을 정렬하십시오.그 다음, 런타임 시리즈 분석기 플러그인을 실행합니다. 이어서, 최소 90개의 신경 말단에 대해 관심 영역(ROI)을 설정합니다. 염료 제거 전후의 이미지를 번갈아 확인하면 활성 신경 말단을 찾아내는 데 도움이 됩니다.이상적인 관심 영역(ROI)의 크기는 일반적인 신경 말단보다 약간 더 큰 크기입니다. 그런 다음, 시간 경과에 따른 각 관심 영역의 총 형광 강도를 구하십시오. 그 후, Microsoft Excel로 내보내십시오.여기에 소뇌 과립 뉴런에 80 Hz 10초 자극을 가하여 10 µM FM 1-43을 로딩한 대조 실험의 흐름도가 제시되어 있습니다. 여기는 FM 1-43이 로딩된 신경 말단을 보여주는 이미지입니다. 여기는 활성 신경 말단을 식별한 후 분석을 위해 선택한 90개의 번호가 매겨진 관심 영역(ROI)을 보여주는 동일한 이미지이며, 이들은 선택된 시점에서의 신경 말단 이미지들입니다.이 이미지들은 서로 다른 시냅스 소포 풀이 고갈됨에 따른 형광 변화를 보여주기 위해 유사 색상(pseudo color)으로 제시되었습니다. 마지막으로, 여기 90개 신경 말단의 정규화된 형광 단위가 표시되어 있습니다. S1 및 S2 단계에서, 각 연속 자극에 따른 형광 감소량을 측정하여 S1 단계와 S2 단계 간에 비교할 수 있습니다.이 대조 실험에서는 S one과 S two 모두에서 즉각 방출 가능 풀과 예비 풀의 크기가 동일하게 나타났습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 라이브 형광 이미징 기술을 사용하여 중추 신경 말단에서 특정 시냅스 소포 풀의 보충 및 동원량을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, S two 실험 조건을 변경하기 전에 S one 대조 실험을 실시하여 세포 생존력과 반응성을 확인하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

FM의 염료는 시냅스 역학의 이해에 귀중한 도움이되었습니다. FMS는 일반적으로 다른 자극 조건 동안 형광 현미경으로 다음 있습니다. 그러나, 전자 현미경과 함께 FM 염료의 photoconversion는 시냅스 부튼스의 다른 ultrastructure 구성 요소 간의, 서로 다른 시냅스 소포의 수영장의 시각화 수 있습니다.

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

배우세요 FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충과 동원을 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 동일한 신경 말단에서 두 번의 소포 재활용을 모니터링하여 내부 대조군을 제공합니다.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

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