인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

본 영상에서는 췌장 유사 전구세포가 인슐린 발현 콜로니로 분화할 수 있도록 하는 3차원 배양 생성 절차를 보여줍니다. 먼저, neurogen in three EGFP Knockin 마우스 배아줄기세포주에서 유래한 분화 세포를 해리하고 EGFP 발현 여부에 따라 분류하여 내분비 유사 전구세포를 농축합니다. 이렇게 분류된 EGFP 양성 단일 세포를 matrigel과 성장 인자가 포함된 반고체 배지에 도말합니다.

이는 개별 전구세포의 이동을 제한하는 동시에, in vitro에서 이들의 생존, 증식 및 분화를 가능하게 합니다. 다음으로, 주어진 분리된 세포군 내에서 콜로니 형성 전구세포의 빈도를 계산하기 위해, 독특한 형태를 가진 결과 콜로니의 수를 현미경으로 계수하고 점수화했습니다. 실시간 PCR 및 면역형광 현미경을 이용한 개별 콜로니 분석 결과, ngn three 양성 세포에서 유래된 콜로니에서는 인슐린 발현이 나타났으나, NGN three 음성 세포에서 유래된 콜로니에서는 나타나지 않았습니다.

부유 배양 방식의 췌장 구체(pancreat spheres)와 같은 기존 기술보다 이 기술을 사용할 때 얻는 주요 이점은, 내재적인 전구세포 콜로니 형성 능력을 확인하기 위해 더 많은 양의 세포를 한 번에 동시에 검사할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 전구세포가 어떤 마커를 발현하는지, 그리고 이러한 세포의 유지, 자기 재생 및 분화에 어떤 내재적 또는 외재적 요인이 중요한지와 같은 췌장 줄기세포 및 전구세포의 생물학적 특성에 관한 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 제1형 당뇨병 치료로 확장될 수 있는데, 췌장 전구세포를 식별하고 베타 세포 유사 세포로 분화시킬 수 있다면, 이러한 세포들을 말기 제1형 당뇨병 환자의 손상된 베타 세포를 대체하는 데 사용할 수 있기 때문입니다.

또한 이 방법은 출생 후 및 성체 췌장, 골수, 간, 비장의 콜로니 형성 전구세포 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자들은 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리하는 과정과 분주 준비 과정에서 matrigel 및 methylcellulose를 다루는 것이 어려워 고전할 수 있습니다. 저는 췌장의 전구세포와 그 분화 후손 간의 계통 관계를 다루는 클론 형성 분석법이 없다는 것을 깨닫고 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.

이러한 콜로니 분석법은 과거 조혈모세포 및 전구세포 연구에 매우 유용하게 활용되었습니다. 저는 췌장 줄기세포 생물학 연구를 위해 이와 같은 분석법이 필요함을 인식했습니다. 반고체 배지 성분은 본질적으로 점성이 있어 조제 및 분주 단계를 익히기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

시연은 석사 과정생인 Mr. Michael Winkler, 테크니션인 Ms. Nancy, 그리고 추후 진행될 콜로니 분석에 사용할 조건 배지를 제조하기 위해 실험실에서 온 포스트닥터 Dr. Lang Jing이 진행하겠습니다. 뉴런 ES 세포는 인비트로(in vitro)에서 췌장 유사 세포로 분화됩니다. 이 절차는 광학 현미경으로 6일 된 배아체를 관찰하는 것으로 시작합니다.

배아의 최소 30~40%는 직경이 최소 150 µm여야 합니다. 더 큰 배아 체는 분화가 촉진되었음을 시사하는 암점이 포함되어 있어야 합니다. 6-웰 부착 플레이트의 각 웰에 80~100개의 배아 체를 옮긴 후, 플레이트를 부드럽게 흔들어 배아 체를 웰 중앙으로 모아 세포 간 접촉을 증가시킵니다.

이러한 접촉은 배아체로부터 췌장 유사 세포의 발달을 더욱 촉진합니다. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 배양 조건의 인큐베이터에 조심스럽게 다시 넣습니다. A 13.

니코틴아미드(nicotinamide)와 인간 재조합 active in beta B가 포함된 신선한 부착 배양 배지로 교체하여 내분비 세포 분화를 유도합니다. 그런 다음 배양물을 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 16일째에 배지를 수집하고 0.2 micron 폴리에테르설폰(polyethers sulfate) 막으로 여과하여 세포 파편을 제거합니다.

이 시점부터 수집된 배지는 조건화 배지(conditioned medium)로 지칭합니다. 조건화 배지를 15 mL 원추형 폴리프로필렌 튜브에 분주하고, 사용 직전까지 -80 °C에서 보관합니다. neurogenin 3는 발달 과정 중 췌장 내분비 전구세포에서 발현되는 전사 인자입니다. neurogenin 3를 발현하는 내분비 전구세포는 최종적으로 췌장의 알파, 베타, 델타, 엡실론 및 췌장 폴리펩타이드 발현 세포로 분화합니다. NGN3를 발현하는 세포의 식별을 용이하게 하기 위해, 넉인(knockin) 마우스 ES 세포주에서 NGN3 유전자 좌의 한쪽 대립유전자를 EGFP 리포터 유전자로 대체하였습니다. 결과물로 생성된 세포주는 NGN3-EGFP로 명명되었습니다. 분화된 NGN3-EGFP 양성 및 NGN3-EGFP 음성 세포를 얻기 위하여.

먼저 16일째에 트립신을 사용하여 배양 플레이트에서 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포 덩어리를 collagenase B 및 DNase I과 함께 배양한 후 40 또는 70 마이크론 메쉬에 통과시킵니다. 다음으로 DPI를 첨가하고, 세포 크기와 과립도를 각각 나타내는 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter)을 기준으로 세포 분류기(cell sorter)를 통해 세포를 분류합니다.

그 다음, 세포가 아닌 잔해물을 제거하기 위해 게이트를 설정합니다. 사멸 세포를 구별하기 위해 DPI를 사용하며, 이들은 양성으로 염색됩니다. 405~413 nm에서 여기시키고 454/40 필터로 방출광을 검출했을 때, 펄스 폭의 게이팅을 통해 전자 전방 산란 펄스의 폭을 확인하여 더블릿(doublets)을 찾아내며, 이는 형광 활성 세포 분류기(FACS)의 EGFP 채널 FL1 대 자가형광 게이팅을 거치기 전에 제거해야 합니다.

왼쪽 패널에 표시된 TL과 같은 대조군 부모 세포주의 16일 차 세포를 사용하여 진성 형광을 조사하면, 오른쪽 패널에서 보는 바와 같이 NGN3 EGFP 양성 세포군을 시각화할 수 있습니다. 정렬 과정 중 NGN3 EGFP 음성 세포의 오염을 제한하기 위해, NGN3 EGFP 양성 세포의 정렬 게이트를 화살표로 표시된 것처럼 의도적으로 오른쪽으로 이동시킵니다. 게이트 설정이 완료되면, NGN3 EGFP 양성 세포와 NGN3 EGFP 음성 세포를 정렬하여 도말 준비 시까지 얼음 위에서 보관합니다.

실험 전날 밤에 Matrigel을 4°C 얼음 위에 둡니다. 실험 당일에는 다음의 시약 또는 용액들을 얼음 위에 준비합니다: DMEM/F12, methyl cellulose, conditioned media, FCS, nicotinamide, XTEND 4, VEGF A 및 recombinant human active TGF-β. 사용 전 최소 30분 전에 200 µL 피펫 팁의 멸균 박스를 -20°C에 둡니다. 분리된 세포를 플레이팅하기 위한 준비로, 먼저 반고체 배지 성분들을 5 mL 폴리스티렌 튜브에 추가해야 합니다. 먼저, 16.5 gauge 바늘을 사용하여 3.3% methyl cellulose 용액을 소량 시린지에 취합니다.

그런 다음 즉시 용액을 밀어내어 공기를 배출하십시오. 이렇게 하면 시린지의 dead space가 용액으로 채워져 반고체 용액의 부피를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이어서 기포가 형성되지 않도록 주의하며, 정해진 양의 methyl cellose 용액을 흡입하여 5mL 튜브에 분주하십시오.

FCS 니코틴아마이드, $\beta$-FGF, VEGF A 및 DMEM/F12가 포함된 조건화 배지를 추가합니다. 그다음 차가운 피펫 팁을 사용하여 매트리젤(matrigel)을 추가합니다. 마지막으로, 5 mL 튜브에 원하는 양의 분리된 세포를 넣습니다.

세포의 조기 자극을 방지하기 위해 항상 세포를 가장 마지막에 첨가하십시오. 그런 다음 튜브 캡을 단단히 닫고 손으로 강하고 철저하게 흔들어 섞어줍니다. 흔드는 과정에서 기포가 발생하므로, 작은 기포가 표면으로 올라올 때까지 또는 5분 동안 튜브를 얼음에 박아 두십시오.

18.5 gauge 바늘이 장착된 1 mL 시린지를 사용하여 반고체 배지 세포 혼합물을 소량 흡입하고, 시린지 내부의 공기를 즉시 제거합니다. 그다음, 24-웰 저부착 플레이트(low attachment plate)의 각 웰 중앙에 반고체 세포 혼합물 500 µL를 천천히 분주합니다. 각 샘플은 4중 반복(quad duplicate)으로 플레이팅해야 하며, 가로로 배치된 24-웰 플레이트의 가장 안쪽 4개 열만 배양에 사용합니다.

세포가 포함된 배양액의 습도 유지를 돕기 위해 나머지 웰을 멸균수로 채웁니다. 플레이팅 직후, 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다.

단일 세포들이 웰 전체에 무작위로 고르게 분포되어 있습니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 공기 조건에서 8~12일 동안 배양합니다. 8~12일간의 배양 후, 현미경으로 세포를 다시 관찰합니다.

이는 배양 시 매트리젤(matrigel)이 고르게 분포된 좋은 예시입니다. 여기는 매트리젤이 불균일하게 분포되어 아파치 프레임워크(Apache framework)가 형성된 예시입니다. 매트리젤이 없는 곳에서는 콜로니가 성장하지 않습니다.

이것은 반고체 배지 혼합물에 Matrigel을 첨가하지 않은 웰의 배경 예시입니다. 생성된 콜로니 수를 측정하기 위해 플레이트 아래에 격자를 부착하십시오. 그 후 10배 대물렌즈를 사용하여 콜로니를 관찰하고 측정하십시오. 배지의 3차원적 특성으로 인해 콜로니들이 서로 다른 초점에 나타날 것입니다.

따라서 광학 현미경 관찰 중에 각 콜로니에 대한 초점 조절이 필요할 수 있습니다. 8~12일 후 반고체 배양액 내의 인슐린 발현 콜로니를 촬영한 대표 사진이 여기에 제시되어 있으며, 화살표로 표시된 콜로니들은 무작위로 분포되어 있고 직경 약 60~100 microns의 작고 어두우며 빛 반사가 없는 클러스터 형태로 나타납니다. 개별적으로 수작업으로 채집한 콜로니에 대해 후속 미세유체 R-T-P-C-R 분석을 수행한 결과, 이전 보고와 일치하게 인슐린 2와 글루카곤의 발현이 확인되었습니다. 이러한 결과는 단일 NGN three EGFP 양성 세포가 초기 1차 파동(first wave)과 유사한 내분비 세포를 닮은, 두 가지 아일렛 호르몬을 동시에 포함하는 콜로니로 분화할 수 있음을 보여줍니다. 신규 인슐린 생성 마커인 eptide의 단백질 발현은 전장 형광 염색(whole mount fluorescent staining)을 통해 확인되었습니다.

요약하자면, 본 보고서에서 설명한 대로 인슐린 발현 집락 형성 단위 분석을 수행하면, 여기서 그리고 이전 보고서에서 입증한 바와 같이 집락을 형성할 수 있는 개별 전구세포의 수를 용이하게 결정할 수 있으며, in vitro에서 쥐 ES 세포로부터 유도된 NGN EGFP 양성 세포를 선별하고 ngn three EEG FP 음성 세포를 배제함으로써 인슐린 발현 집락 형성 단위를 농축할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 선별 후 1~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 세포를 단일 세포 현탁액으로 완전히 해리시키고, 매트리젤(matrigel)의 응고를 방지하기 위해 모든 배양 성분을 얼음에 보관하며, 세포의 조기 자극을 피하기 위해 세포를 튜브에 가장 마지막에 넣어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는, 단일 세포가 집락 형성 개시에 충분한지 등의 추가적인 질문에 답하기 위해 단일 세포 조작과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 췌장 줄기세포 및 전구세포 생물학 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어줄 것입니다. 이를 통해 연구자들은 자기 복제 능력과 베타 세포 유사 세포로의 분화 능력을 탐구할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 인슐린을 발현하는 콜로니 형성 전구세포에 대한 정량적 콜로니 분석법을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.