인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

이 비디오는 췌장과 같은 전구 세포가 인슐린 발현 콜로니로 분화할 수 있도록 하는 3차원 배양을 생성하는 절차를 보여줍니다. 먼저, 3개의 EGFP Knockin 쥐 배아 줄기 세포주에 있는 신경세포에서 유래한 분화된 세포를 해리하고 분류하여 EGFP 발현을 통해 전구 세포와 같은 내분비를 농축합니다. EGFP 양성 분류 단일 세포는 마트리겔 및 성장 인자를 포함하는 반고체 배지에 도말됩니다.

이는 개별 전구 세포의 이동을 제한하는 동시에 체외에서 생존, 증식 및 분화를 허용합니다. 다음으로, 주어진 분류된 개체군에서 군체를 형성하는 전구 세포의 빈도를 계산하기 위해 독특한 형태학을 가진 결과 군체의 수를 계산하고 현미경으로 점수를 매겼습니다. Real-Time PCR 및 면역형광 현미경 검사에 의한 개별 집락의 분석은 NGN 3개의 양성 세포에서 유래한 집락에서 인슐린 발현을 보여주지만 NGN 3개의 음성 세포에서는 그렇지 않습니다.

현탁 배양에서 췌장 구체와 같은 기존 기술에 비해 이 기술을 사용하는 주요 이점은 이 기술을 통해 한 번에 더 많은 양의 세포를 동시에 검사하여 고유한 전구 창체 집락 형성 능력을 검사할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 췌장 줄기 세포와 전구 세포의 생물학에 관한 질문, 예를 들어 전구 세포가 어떤 마커를 발현하는지, 그리고 이러한 세포의 유지 자가 재생 및 분화에 어떤 내적 또는 외적 요인이 중요한지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 췌장 전구 세포를 식별하고 베타 세포와 같은 세포로 분화할 수 있다면 해당 세포를 사용하여 말기 1형 당뇨병 환자의 손상된 베타 세포를 대체할 수 있기 때문에 1형 당뇨병 치료로 확장될 수 있습니다.

또한 식민지 연구, 범 출생 후 및 성인 췌장, 골수, 간 및 비장의 전구 세포 형성과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리하고 분주를 준비하기 위해 마트리겔과 메틸셀룰로오스를 처리하는 것이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 저는 전구 세포와 췌장에서 분화된 자손 사이의 계통 관계를 다루는 클론 유전자 분석이 없다는 것을 알았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

이러한 집락 분석은 과거에 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 연구하는 데 중요한 역할을 했습니다. 저는 췌장 줄기세포 생물학을 연구하기 위해 이러한 분석이 필요하다는 것을 인식하고 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 반고체 중앙값 구성 요소가 본질적으로 점성이 있고 준비 및 디스펜싱 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

절차를 시연하는 것은 석사 학생인 Mr.Michael Winkler, 진정한 기술자인 Miss Nancy, 그리고 나중에 수행될 콜로니 분석을 위한 컨디셔닝 배지를 생성하기 위해 실험실의 포스톱 펠로우인 Dr.Lang Jing입니다. 뉴런 ES 세포는 in vitro에서 췌장과 같은 세포로 분화됩니다. 광학 현미경으로 6일 된 배아를 검사하여 이 절차를 시작합니다.

그들 중 적어도 30-40%는 직경이 150미크론 이상이어야 합니다. 더 큰 배아 몸체에는 향상된 분화를 암시하는 어두운 반점이 있어야 합니다. 80-100개의 배아체를 6개의 웰 부착 플레이트의 각 웰로 옮긴 다음 플레이트를 부드럽게 팽창시켜 배아체를 웰 중앙으로 모아 세포 간 접촉을 증가시킵니다.

이러한 접촉은 배아체에서 췌장과 같은 세포의 더 나은 발달을 초래합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 배양에 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 부드럽게 다시 놓습니다. 가 13.

배지를 4개의 니코틴아미드 엑센드를 포함하는 새로운 부착 배양 배지와 베타 B에서 활성을 가진 인간 재조합 배지로 교체하여 내분비 세포 분화를 유도합니다. 그런 다음 배양물을 배양기의 인큐베이터로 되돌립니다. 16일째, 배지를 수집하고 0.2미크론 폴리에테르 황산염 멤브레인을 통해 여과하여 세포 파편을 제거합니다.

이 시점부터, 수집된 배지는 컨디셔닝 배지라고 불리며, 컨디셔닝 배지를 15 밀리리터 원추형 폴리프로필렌 튜브로 분취하고 섭씨 영하 80도에서 사용할 때까지 보관합니다. 신경원을 3개로 발현하는 내분비 전구체는 궁극적으로 췌장 알파, 베타 델타 엡실론, 췌장 폴리펩티드 발현 세포로 분화하여 NG N 3 유전자좌의 1개 대립유전자를 발현하는 세포의 동정을 용이하게 하고, 노킨 쥐 ES 세포주에서 EGFP 리포터 유전자로 대체하였다. 생성된 세포주는 분화된 NGN 3 EGFP 양성 및 NGN 3 EEG FP 음성 세포를 얻기 위해 NGN 3 EGFP로 지정되었습니다.

세포는 16일째에 트립신에 의해 배양판에서 먼저 부착되어 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 세포 덩어리는 콜라겐 분해 효소 B와 DNA 1로 배양되어 40 또는 70 미크론 메쉬를 통과합니다. 다음 DPI가 추가되고 셀이 셀 정렬기에서 정렬되어 전방 대 측면 산란을 정렬하며, 이는 각각 셀 크기와 세분성을 나타내는 플롯입니다.

그런 다음 비세포 파편을 제거하기 위해 게이트를 그립니다. DPI는 양성으로 염색되는 죽은 세포를 구별하는 데 사용됩니다. 4 0 5 to four 13 nanometer에서 여기하고 펄스 폭의 4 54 40 필터 게이팅으로 방출을 감지하면 전자 순방향 산란 펄스의 너비는 이중선을 나타내며, 이는 EGFP 채널 FL 1과 자가형광의 형광 활성화 세포 분류기 게이팅을 통과하기 전에 제거해야 합니다.

왼쪽 패널에 표시된 TL과 같은 대조군 모세포주로부터의 16일째 세포를 사용하여 실제 형광을 비추므로 NGN 3개의 EEG FP 양성 세포 집단을 오른쪽 패널에서 볼 수 있듯이 시각화할 수 있습니다. NGN 3 EGFP 양성 세포의 비닐 분류 게이트는 분류 중 NG N 3 EEG FP 음성 세포의 오염을 제한하기 위해 화살표로 표시된 것처럼 의도적으로 오른쪽으로 이동합니다. 게이트가 설정되면 NGN 3 EEG, FP 양성 및 NGN 3 EGFP 음성 세포를 분류하여 도금을 준비하는 데 사용할 때까지 얼음에 보관합니다.

실험 전날 밤 섭씨 4도의 얼음 위에 마트리 젤을 놓습니다. 그러나 실험 당일, 다음 시약 또는 용액을 얼음 D-M-E-M-F 12 메틸 셀룰로오스 조절 매체 FCS 니코틴아미드 XTEND에 4개의 VEGF A 및 베타 B에서 활성인 재조합 인간에 200마이크로리터 피펫 팁이 담긴 멸균 상자를 놓고 사용하기 최소 30분 전에 섭씨 영하 20도에서 분류된 세포를 플레이트할 준비를 합니다. 반고체 매체 구성 요소는 먼저 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 추가해야 합니다. 먼저 16 및 반 게이지 바늘을 사용하여 소량의 3.3% 메틸 셀로스 용액을 주사기에 끌어들입니다.

그런 다음 즉시 용액을 밀어 공기를 배출하십시오. 이렇게 하면 주사기의 데드 스페이스가 용액으로 채워지고 반고체 용액의 부피를 정확하게 측정할 수 있습니다. 그런 다음 기포 형성을 피하고 의도한 부피의 메틸 셀로스 용액을 5ml 튜브에 추출하여 분배합니다.

베타 B, VEGF A 및 D-M-E-M-F 12에서 4개의 활성을 확장하는 조절된 매체 FCS 니코틴아미드를 추가합니다. 그런 다음 차가운 피펫 팁을 사용하여 마트리겔을 추가합니다. 마지막으로 5밀리리터 튜브에 원하는 양의 정렬된 세포를 추가합니다.

세포의 조기 자극을 피하기 위해 항상 세포를 마지막에 추가하십시오. 그런 다음 튜브를 단단히 닫고 손으로 튜브를 세게 철저히 흔듭니다. 흔들면 기포가 생성되므로 튜브를 얼음 위에 5분 동안 또는 작은 기포가 표면화될 때까지 놓습니다.

18 및 18 게이지 반 게이지의 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하여 소량의 반고체 매체 세포 혼합물을 끌어들이고 즉시 주사기의 공기를 배출합니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 반고체 셀 혼합물을 24 웰 낮은 부착 플레이트의 각 웰 중앙으로 직접 천천히 분배합니다. 각 샘플은 쿼드 복제로 도금되어야 하며, 수평 방향의 24웰 플레이트의 내부 4개만 배양에 사용됩니다.

배양물을 포함하는 세포의 가습을 돕기 위해 나머지 웰에 멸균수를 채웁니다. 도금 직후. 광학 현미경으로 세포를 봅니다.

단일 세포는 웰 전체에 무작위로 고르게 분포되어 있습니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 공기에서 8일에서 12일 동안 세포를 배양합니다. 8일에서 12일 동안 배양한 후 현미경으로 세포를 다시 관찰합니다.

이것은 배양에 고르게 분포된 모트리겔의 좋은 예입니다. 다음은 Apache 프레임워크를 초래하는 불균등하게 분포된 matri gel의 예입니다. 군체는 마트리 겔이 없는 곳에서는 자라지 않습니다.

이것은 반고체 매체 혼합물에 마트리 겔이 첨가되지 않은 우물의 배경의 예입니다. 결과 군체를 계산하려면 플레이트 아래에 그리드를 부착하십시오. 그런 다음 10배 대물 렌즈를 사용하여 매체의 3차원 특성으로 인해 군체를 관찰하고 계산하면 군체가 다른 초점에 나타납니다.

따라서, 반고체 배양에서 인슐린을 발현하는 인슐린의 대표적인 사진 현미경 사진으로 관찰하는 동안 각 콜로니에 대한 초점의 조정이 필요할 수 있으며, 8 내지 12일 후에 여기에 표시되며, 화살표로 표시된 콜로니는 무작위로 분포되어 약 60 내지 100미크론의 직경을 갖는 작고 어둡고 비광 반사 클러스터로 나타납니다. 개별적으로 엄선된 콜로니에 대한 후속 미세유체 R-T-P-C-R 분석은 이전 보고서와 일치하는 인슐린 2와 글루카곤의 발현을 밝혔습니다. 이러한 결과는 단일 NGN 3 EGFP 양성 세포가 원시 제 1 파와 같은 내분비 세포를 동시에 닮은 두 개의 구멍 호르몬을 포함하는 콜로니로 분화하는 능력을 보여주며, 펩타이드의 단백질 발현, 새로운 인슐린 생산에 대한 마커는 전체 마운트 형광 염색을 사용하여 확인되었습니다.

요약하면, 인슐린 발현 콜로니 형성 단위 분석이 본 보고서에 예시된 바와 같이 수행될 때, 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가진 개별 전구 세포의 수는 여기에서 입증된 바와 같이 쉽게 결정될 수 있으며, 이전 보고서에서 입증된 바와 같이, 인슐린 발현 콜로니 형성 단위는 NGN EGFP 양성으로 분류하여 농축할 수 있지만, in vitro에서 rine ES 세포에서 유래한 ngn 3개의 EEG FP 음성 세포는 그렇지 않습니다. 이 기술은 1-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 분류 후 이 절차를 시도하는 동안 세포를 단일 세포 현탁액으로 완전히 해리하고 모든 배양 성분을 얼음 위에 두어 마트리겔의 응고를 방지하고 세포의 조기 자극을 피하기 위해 세포를 튜브에 마지막에 추가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 단일 세포 조작과 같은 다른 방법은 단일 세포가 발달 후 집락 형성을 시작하기에 충분한지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.

이 기술은 췌장 줄기 및 전구 세포 생물학 분야의 연구자들에게 길을 열어줄 것입니다. 이를 통해 세포와 같은 베타에 대한 자가 재생 능력과 분화 능력을 탐구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인슐린이 집락 형성 전구세포를 발현하기 위한 정량적 집락 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.