CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

안녕하세요, 제 이름은 리처드 린(Richard Lin)이고, 하버드 MIT 보건 과학 및 기술 학부의 TI 머시 교수 그룹의 연구원입니다. 제가 진행하고 있는 프로젝트는 CD 4개 양성 T 림프구와 C3 양성 T 림프구를 정량화하고 캡처하는 것입니다. 환자의 혈액은 자원이 제한된 환경에서 사용되어야 합니다.

제 바로 앞에는 PDMS로 구성된 마이크로필 장치가 있는데, 이것이 바로 폴리메틸 슬론입니다. 장치, 채널 자체, 높이는 50마이크로미터 높이이고 장치의 총 부피는 10마이크로리터입니다. 이것은 T 보조 림프구를 포획하는 데 사용할 매우 정밀한 장치입니다.

기본적으로 HIV 환자에 대한 진단 기준입니다. 따라서 마이크로 유체 장치의 표면은 이미 주사기에 단백질과 CD 4 개의 양성 항체로 준비되었습니다. 현재 pH는 7.4인 PBS 생물학적 완충액만 가지고 있으며 이를 채널로 유입시켜 여분의 CD 4 양성 항체를 씻어낼 것입니다.

이 단계에서는 여분의 물건을 씻어내려고 하기 때문에 속도를 제어할 필요가 없으며 속도가 얼마인지는 실제로 중요하지 않습니다. 이것은 장치의 입구가 될 곳이고 이것은 우리, 내 왼쪽, 그리고 여기 당신의 오른쪽에 있는 콘센트가 될 것입니다. 이제 여분의 항체 용액을 씻어낼 것이고 배출구에서 액체가 나오는 것을 알 수 있다면 이것이 매우 미세한 양이라는 것을 알 수 있지만 자세히 보면 튜브를 통해 채널에서 공기 액체가 나오는 것을 볼 수 있습니다.

이제 우리는 여분의 항체 용액을 씻어냈으므로 이제 혈액을 주입할 수 있도록 준비할 수 있습니다. 이제 입구에서 튜브의 플러그를 뽑겠습니다. 이제 우리는 혈액, 인간의 혈액, 전혈을 위한 새로운 주사기를 열 것입니다.

따라서 이것은 환자 샘플이 아니라 건강한 샘플, 건강한 피험자 샘플이며 우리가 미세유체 장치에 혈액을 주입하기 위해 준비하는 동안 진행됩니다. 그래서 우리는 주사기를 주사기 펌프에 부착할 것입니다. 이제 전원을 켜면 주사기의 유속을 볼 수 있으며 분당 5마이크로리터로 설정했습니다.

이제 기본적으로 혈액을 주입할 준비를 합니다. 우리는 주사기 펌프를 수직으로 놓을 것인데, 우리가 알다시피 혈액 세포는 침전물을 만들고 우리는 세포가 채널로 흘러 들어가기를 원할 것이기 때문입니다. 그러니 차라리 세포 침전물을 우리 튜브 바로 근처에 있는 바닥으로 두십시오.

이제 모든 것이 준비되었습니다. 내 장치의 부피는 10 마이크로 리터 당 10 마이크로 리터입니다. 그리고 우리가 채널 벽으로 흐르고자 하는 부피도 10마이크로리터입니다.

그래서 채널의 색깔을 보는 것만으로도 혈액이 충분히 흐르고 있는지, 온통 빨갛게 채워져 있는지, 10마이크로리터로 혈액이 흐르고 있다는 것을 알 수 있고 주사기 범퍼를 멈춰야 합니다. 이제 시작 버튼을 누르면 때때로 시작되고 때로는 혈액이 실제로 채널로 들어가기까지 시간이 걸립니다. 그리고 이것은 많은 압력이 마음에 들기 때문입니다.

예를 들어, 우리가 주사기를 거기에 놓을 때, 때때로 우리는 튜브의 혈액을 조정하기 위해 그에 따라 액체를 빼내거나 주입합니다. 따라서 시간이 걸릴 수도 있지만 채널로 펌핑을 시작하면 유속은 우리가 원하는 분당 ly로 설정됩니다. 그래서 우리는 여기서 조금 인내심을 가지고 기다릴 수도 있고, 때로는 혈액이 채널로 이동하기 시작하기 전에 2분, 3분 정도 기다려야

사실 여러분은 지금 피가 채널로 들어가기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 따라서 지금 장치가 거의 완전히 채워졌다는 것을 알 수 있습니다. 자, 이제 튜브를 PBS로 다시 전환하여 채널에 있는 혈액을 씻어낼 것입니다.

그리고 그렇게 하기 위해 우리는 튜브를 제거하기 위해 이미 했던 일을 반복할 것입니다. 우리는 여전히 PBS의 흐름 속도를 제어해야 하기 때문에 여전히 주사기 펌퍼가 필요합니다. 그러나 더 이상 혈액이 흐르지 않기 때문에 PBS에는 세포가 없기 때문에 주사기 펌프를 수직 위치에 둘 필요가 없습니다.

이제 모든 준비가 끝났고 장치에서 피를 씻어내고 바로 여기에서 날카로운 버튼을 다시 누르겠습니다. 보시다시피 장치가 정리되기 시작했습니다. 가장자리에는 여전히 약간의 피가 묻어 있지만 서서히 사라지고 있습니다.

따라서 모든 혈액이 사라지면 분당 5마이크로리터에서 분당 20마이크로리터로 속도를 높일 것입니다. 이러한 변화의 이유는 혈액 속에는 C 4개의 양성 항원을 가진 두 가지 유형의 세포가 있기 때문입니다. 그 중 하나는 우리가 찾던 T 도우미 림프구입니다.

다른 하나는 우리가 단핵구라고 부르는 것입니다. 우리는 장치가 T 보조 림프구와 단핵구를 모두 캡처하는 것이 아니라 T 도우미 림프구만 구체적으로 캡처하는지 확인하고자 합니다. 그리고 우리가 하는 방법은 단핵구가 T 헬퍼 세포보다 크기가 더 크다는 것을 알고 있기 때문에 유속을 증가시키는 것입니다.

따라서 유속을 증가시킴으로써, 더 큰 단핵구는 CD 4개의 양성 T 헬퍼 세포보다 표면을 떠나는 더 많은 압력을 경험하게 됩니다. 이제 20분 남았습니다. 그래서 지금 제 손에는 그것이 해결책입니다.

이를 팩스 라이선싱 솔루션이라고 합니다. 이를 위한 목적은 적혈구를 만드는 것입니다. 따라서 적혈구가 채널에 남아 있는 곳이면 어디든지 이 용액이 작용할 것입니다.

이것은 원액에서 10, 10배 희석됩니다. 이제 우리가 할 일은 주사기 펌퍼를 멈추고, 튜브를 제거하고, 기본적으로 용액을 이 주사기의 용액으로 교체하는 것입니다. 그래서 저는 이제 기계를 멈추고, 튜브를 제거하고, 이것을 제거하고, 이 주사기로 가져가고, 새 것으로 교체합니다.

자, 이제 모든 설정이 완료되었으므로 속도를 분당 5마이크로리터로 다시 줄이겠습니다. 따라서 20에서 속도를 클릭하고 5로 줄인 다음 이제 20분 동안 팩스 라이선스 솔루션을 사용할 것입니다. 이제 시작을 누릅니다.

그래서 지금 우리 앞에는 10배 배율로 촬영한 장치의 광학 이미지가 있습니다. 그래서 여러분은 이 모든 하얀 점들을 직접 구별할 수 있습니다. 그렇다면 이 세포가 우리가 찾고 있는 세포인지 어떻게 확인할 수 있을까요?

그래서 우리는 몇 가지 다른 염색을 사용하여 우리가 사용하는 첫 번째 염색이 우리가 dpi라고 부르는 것인지 확인합니다. 따라서 기본적으로 핵이 있는 모든 세포, 예를 들어 백혈구와 같이 모든 염색이 있는 반면 핵이 없는 적혈구는 염색되지 않으며 이미지 전체에 걸쳐 있음을 알 수 있습니다. 그것들은 모두 파란 점들이고 모두 파란 점들입니다.

는 셀입니다. 이제 다음 단계는 세포가 C 4 양성 항원이라고 부르는 것을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. 우리 장치의 전체 목적은 C 4 개의 양성 세포를 캡처하는 것이기 때문에 이것은 매우 중요합니다.

다음으로 우리가 사용하는 형광 항체는 물론 C 4에 특이적입니다. 그리고 다음 슬라이드로 이동합니다. 이 그림에서, 세포가 훨씬 더 어둡게 나오는 이유는 우리가 사용하는 형광 항체가 일반적으로 사실에 대한 것이기 때문입니다.

따라서 희석률이 훨씬 높습니다. 그러나 상당히 자세히 살펴보면 여전히 이 필드 뷰 주위에 흩어져 있는 점이 있음을 알 수 있습니다. 그들은 상당히 어둡습니다.

그러나 더 자세히 살펴보면 이러한 세포가 DC에 긍정적으로 표시된다는 것을 알 수 있으며, 이는 정확히 우리가 원하는 것이기 때문에 좋습니다. 다음 검사는 아까 말씀드렸듯이 C, 4개의 양성 세포에는 두 가지 유형이 있습니다. 하나는 우리가 원하는 T 도우미 세포이고 다른 하나는 우리가 단핵구라고 부르는 세포입니다.

따라서 두 세포를 구별하기 위해 또 다른 형광 항체가 다시 필요합니다. 그래서 우리는 T 보조 림프구에서 우리가 CD라고 부르는 3개의 양성 항원을 가지고 있다는 것을 알고 있습니다. 단핵구의 경우 그렇지 않습니다.

우리가 사용하는 다음 항체는 이 그림에서 볼 수 있는 CD 3 특이적입니다. 다시 말씀드리지만, 점들이 장치 주변에 흩어져 있다는 것을 알 수 있는데, 그 점들이 더 커 보이는 이유는 어떤 세포는 더 밝게 빛나기도 하고, 어떤 세포는 그렇지 않기 때문입니다. 이 경우 많은 것들이 우연에 달려 있지만 대부분의 경우 밝은 빨간색 점으로 표시된 이 점들은 모두 세포입니다.

그래서 우리는 다시 말하지만, 우리가 원하는 것은 첫째, 우리의 세포가 CD 4 양성이고 CD 3 양성인지 확인하는 것입니다. 이 경우 많은 세포가 d CD 3 양성이라는 것을 알 수 있습니다. 그것은 우리의 캡처에 특이성을 제공합니다.

큰 도즈는 쓰레기일 수 있지만 많은 경우 일어나는 일은 때때로 세포가 더 많은 CD 3 플러시, CD 3 플러시를 모으는 것입니다. 이 사진에서 이것은 이 마이크로 유체 장치를 위해 수집한 데이터 중 하나이며 기본적으로 세포 포획 전문가입니다. 그러니까 이전 것에서, 아시다시피, 슬라이드든, 뭐든, 여러분은 셀이 있는 그림들이 많이 있었다는 것을 알 수 있습니다.

그러나 그들은 실제로 무엇을 위해 축적됩니까? 글쎄, 그들은 셀 캡처 프로파일에 축적되며, 이 경우 X축에는 입구로부터의 거리가 있고 Y축에는 캡처 셀 디스크가 있는 플롯을 그릴 수 있습니다. 그리고 여러분은 장치 전체에 걸쳐, 아시다시피, 여러분의 밀도가 처음에는 매우 높다가 서서히 감소한다는 것을 알 수 있는데, 이것이 우리가 예상하는 바입니다, 왜냐하면 우리는 혈류에서 C 4 양성 세포와 3 po, C3 양성 세포를 포착하고 혈액 샘플에서 이러한 세포의 농도를 감소시킬 것이기 때문입니다.

그리고 이것은 기본적으로 우리의 데이터가 일반적으로 표시되는 방식입니다.