Name: CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 학습하세요 PDMS 기반 일회용 마이크로플루이딩 칩을 사용하여 환자 혈액에서 CD4 양성 T 헬퍼 림프구를 정량화하고 포착하는 방법을. 이 기술은 자원이 제한된 환경에서 HIV 진단을 위한 면역학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> 안티 CD4 + biotinlayted 표면 microfluidic 채널을 준비합니다. </li><li> 주사기 펌프와 microfluidic 채널에 5 ML / 분 샘플 혈액의 10 ML을 주사. </li><li> PBS로 20 분 20 ML / 분 혈액을 밖으로 플러시. </li><li> 15 분 5ul/min에 희석 외과 lysing 솔루션 (PBS로 재고 솔루션에서 10 % 희석) 주사. </li><li> 15 분 알을 품다. </li><li> 5 ML / 20 분 분 주요 인 경우에는 3 번 CD + 항체 솔루션 (PBS로 재고 솔루션에서 10 % 희석) 주사. </li><li> 2 시간 동안 부화. </li><li> 5 ML / 15 분 분 PBS와 채널을 플러시. </li><li> 동시에 20 분 5 ML / 분 20 % AF488 CD4 + 항체, 0.2 % DAPI 주식 솔루션,와 10 %의 보조 인 경우에는 3 번 CD + 항체를 주사. </li><li> 20 분 품어. </li><li> 5 ML / 15 분 분 PBS와 채널을 플러시. </li><li> 형광 현미경으로 세포를 개수 : <ol><li> 화이트 (광학) - 흑백 : 셀 및 먼지 </li><li> UV (DAPI) - 블루 : 세포에만 </li><li> 블루 (CD4 +) - 초록색 : T - 림프구와 단핵구 </li><li> 그린 (인 경우에는 3 번 CD +) - 빨간색 : T - 림프구 전용 </li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>PDMS 마이크로채널</td><td></td><td></td><td></td><td>SU-8 몰드로 제작됨</td></tr><tr><td>혈액</td><td></td><td></td><td></td><td>정상인 피험자로부터 기증받은 혈액. Mass General Hospital, 10 X 고밀도 WBC 또는 Brigham and Women&amp;rsquo;s Hospital.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>완충액</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>1x Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphated Buffered Saline.</td></tr><tr><td>FACS 용해액</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>원액을 PBS로 10%까지 희석함.</td></tr><tr><td>Anti-CD4+ 비오틴화 항체</td><td></td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0704</td><td>Anti-CD4+ 비오틴화 항체로 표면 처리함. 0.2mg 원액과 1ml 탈이온수를 혼합한 후, 원액을 PBS/BSA로 10%까지 희석함.</td></tr><tr><td>goat anti-hCD3delta</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>원액을 PBS로 10%까지 희석함</td></tr><tr><td>rabbit anti-goat IgG PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>anti-CD3 항체용 2차 항체, 원액을 PBS로 10%까지 희석함</td></tr><tr><td>anti-human CD4+</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557695</td><td>Alexa Fluor 488 표지, 원액을 PBS로 20%까지 희석함.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>4&amp;rsquo;,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride 용액, 원액을 PBS로 0.2%까지 희석함.</td></tr></tbody></table>

cd4 + hiv에 대한 일회용 microfluidic 칩을 사용하여 t - 림프구 캡처

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

안녕하세요, 저는 하버드 MIT 보건과학 및 기술부(Division of Health Sciences and Technology)의 TI Mercy 교수님 연구팀에서 연구원으로 재직 중인 Richard Lin입니다. 제가 진행하고 있는 프로젝트는 자원이 제한된 환경에서 환자의 혈액 내 CD4 양성 및 C3 양성 T 림프구를 정량화하고 포획하는 것입니다.제 바로 앞에 있는 것은 PDMS(Polymethylsiloxane)로 구성된 마이크로 유체 장치입니다. 이 장치의 채널 높이는 50 µm이며, 장치 내 총 부피는 10 µL입니다. 따라서 이는 T 헬퍼 림프구를 포집하는 데 사용할 매우 정밀한 장치입니다.기본적으로 HIV 환자를 위한 진단 벤치마크입니다. 마이크로 유체 장치의 표면은 이미 단백질로 준비되었으며, 시린지에는 CD4 양성 항체가 들어 있습니다. 현재는 pH 7.4의 PBS 생물학적 완충액만 있는 상태이며, 이제 이를 채널로 흘려보내 과잉의 CD4 양성 항체를 씻어내겠습니다.이 단계에서는 단순히 잔여물을 씻어내려는 것이며 유속이 크게 중요하지 않으므로, 유속을 조절할 필요가 없습니다. 이곳이 장치의 입구가 될 것이며, 제 왼쪽이자 여러분의 오른쪽 방향이 출구가 될 것입니다. 이제 과량의 항체 용액을 씻어내겠습니다. 출구 쪽을 보시면 유체가 흘러나오는 것을 알 수 있는데, 매우 적은 양이지만 자세히 보시면 튜빙을 통해 채널에서 유체가 배출되는 것을 확인하실 수 있습니다.이제 과잉 항체 용액을 씻어냈으므로, 혈액을 주입할 준비를 할 수 있습니다. 먼저 입구에서 튜브를 분리하겠습니다. 이제 인혈(human blood), 전혈(whole blood)이 담긴 새 주사기를 준비하겠습니다.따라서 이는 환자 샘플이 아니라, 미세유체 장치에 혈액을 주입하기 위해 준비하는 동안 사용하는 건강한 피험자의 샘플입니다. 이제 주사기를 주사기 펌프에 장착하겠습니다. 전원을 켜면 주사기의 유속을 확인할 수 있으며, 유속은 5 µL/min으로 설정했습니다.이제 혈액 주입을 위한 준비를 하겠습니다. 시린지 펌프를 수직으로 배치할 것인데, 이는 혈구 세포가 침전되는 성질이 있어 세포가 채널 안으로 흘러 들어가게 하기 위함입니다. 따라서 세포가 튜빙 바로 근처인 바닥 쪽으로 침전되도록 하는 것이 좋습니다.이제 모든 설정이 완료되었습니다. 제 장치의 부피는 10 µL당 10 µL입니다. 그리고 채널 벽으로 흘려보내고자 하는 부피 또한 10 µL입니다.채널의 색상만으로 혈액이 충분히 흘러 들어갔는지 확인할 수 있습니다. 채널이 붉은색으로 완전히 채워지면 10 µL가 흘러 들어간 것이므로 시린지 범퍼를 멈춰야 합니다. 이제 시작 버튼을 누르면 작동하며, 때로는 혈액이 실제로 채널에 들어갈 때까지 시간이 걸리기도 합니다. 이는 주로 압력 때문입니다.예를 들어, 주사기를 장착한 후, 튜브 내의 혈액을 조정하기 위해 상황에 따라 액체를 흡입하거나 주입하기도 합니다. 따라서 어느 정도 시간이 걸릴 수 있지만, 일단 채널로 펌핑이 시작되면 유속은 우리가 원하는 대로 분당 1 µL로 설정됩니다. 그러므로 여기서 약간의 인내심을 가지고 기다려야 하며, 때로는 혈액이 채널로 들어가기까지 2~3분 정도 기다려야 할 수도 있습니다.현재 혈액이 채널로 들어가기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 따라서 장치가 거의 완전히 채워졌음을 알 수 있습니다. 이제 채널 내의 혈액을 씻어내기 위해 튜빙을 다시 PBS로 전환하겠습니다.이를 위해 튜빙을 제거할 때와 동일한 과정을 반복하겠습니다. PBS의 흐름 속도를 계속 조절해야 하므로 시린지 펌프는 여전히 필요합니다. 하지만 더 이상 혈액을 흘려보내지 않으며 PBS에는 세포가 없으므로, 시린지 펌프를 굳이 수직 상태로 유지할 필요는 없습니다.이제 모든 준비가 완료되었으므로, 장치 내의 혈액을 씻어내겠습니다. 여기 있는 sharp 버튼을 다시 누르겠습니다. 보시는 바와 같이, 장치가 점점 깨끗해지기 시작합니다. 가장자리에는 여전히 혈액이 약간 남아 있지만, 천천히 사라지고 있습니다.혈액이 모두 제거되면, 유량을 분당 5 µL에서 20 µL로 높입니다. 이렇게 변경하는 이유는 혈액 내에 C4 양성 항원을 가진 세포 유형이 실제로 두 가지 존재하기 때문입니다. 그중 하나가 우리가 찾고자 하는 T helper 림프구입니다.다른 하나는 우리가 단핵구라고 부르는 세포입니다. 우리는 장치가 단핵구와 T 도움 림프구를 모두 포착하는 것이 아니라, T 도움 림프구만을 특이적으로 포착하도록 해야 합니다. 이를 위해 유량을 증가시키는데, 이는 단핵구가 T 도움 세포보다 크기가 더 크기 때문입니다.따라서 유속을 높이면, 크기가 더 큰 단핵구는 CD4 양성 T 헬퍼 세포보다 표면에서 떨어져 나가려는 더 큰 압력을 받게 됩니다. 현재 약 20분이 경과했습니다. 제가 지금 손에 들고 있는 것은 용액입니다.이는 용혈 라이싱 솔루션(fax licensing solution)이라고 합니다. 이 솔루션의 목적은 적혈구를 용혈시키는 것입니다. 따라서 채널 내에 적혈구가 남아 있는 곳이라면 어디든 이 솔루션이 이를 용혈시킵니다.이것은 스톡 용액으로부터 10배, 총 100배 희석된 것입니다. 이제 시린지 펌프를 멈추고 튜빙을 제거한 뒤, 기본적으로 용액을 이 시린지에 있는 것으로 교체하겠습니다. 이제 기계를 멈추고, 튜빙을 제거하고, 이것을 떼어낸 다음, 이 시린지를 사용하여 새것으로 교체하겠습니다.이제 모든 준비가 되었으므로, 유량을 다시 5 µL/min으로 낮추겠습니다. 유량 설정을 20에서 5로 변경하고, 이제 fax license 용액을 20분 동안 흘려보내겠습니다. 이제 시작 버튼을 누릅니다.현재 우리 앞에 보이는 것은 10배 배율로 촬영한 장치의 광학 이미지입니다. 여기 있는 모든 흰색 점들이 세포임을 알 수 있습니다. 그렇다면 이 세포들이 우리가 찾고 있는 세포라는 것을 어떻게 확인할 수 있을까요?따라서 저희는 몇 가지 서로 다른 염색법을 사용하는데, 먼저 사용하는 염색법은 DPI라고 불리는 것으로, 이는 핵을 염색합니다. 기본적으로 백혈구와 같이 핵이 있는 모든 세포는 염색되는 반면, 핵이 없는 적혈구는 염색되지 않습니다. 이미지 전체에서 볼 수 있듯이, 모든 파란색 점들이 바로 그렇게 염색된 세포들입니다.세포입니다. 이제 다음 단계는 세포가 이른바 C4 양성 항원을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. 우리 장치의 전체 목적이 C4 양성 세포를 포집하는 것이므로 이는 매우 중요합니다.다음으로, 저희가 사용하는 형광 항체는 당연히 C4 특이적 항체입니다. 다음 슬라이드로 넘어가겠습니다. 이 사진에서 세포들이 훨씬 더 어둡게 보이는 이유는 저희가 사용하는 형광 항체가 보통 4-팩스(4-facts)용이기 때문입니다.따라서 희석 배수가 훨씬 높습니다. 하지만 자세히 살펴보면, 시야 전반에 여전히 점들이 흩어져 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 점들은 상당히 희미합니다.하지만 더 자세히 살펴보면 이 세포들이 CD4 양성임을 알 수 있으며, 이는 우리가 정확히 원하는 결과이므로 바람직합니다. 그리고 앞서 언급했듯이 다음 테스트 단계는 두 가지 서로 다른 유형의 CD4 양성 세포를 구분하는 것입니다. 하나는 우리가 원하는 T 도움 세포(T helper cells)이며, 다른 하나는 단핵구(monocytes)라고 불리는 세포들입니다.따라서 두 세포를 구별하기 위해 또 다른 형광 항체가 필요합니다. T 도움 림프구에는 CD3 양성 항원이 존재하지만, 단핵구에는 존재하지 않는다는 점을 이용합니다.다음으로 사용할 항체는 CD3 특이적 항체이며, 이 사진에서 확인할 수 있습니다. 다시 말씀드리면, 장치 곳곳에 점들이 흩어져 있는 것을 볼 수 있는데, 일부 세포는 더 밝게 빛나고 일부는 그렇지 않기 때문에 점들의 크기가 다르게 보일 수 있습니다. 즉, 이 경우에는 상당 부분 우연에 의한 것이지만, 대부분의 경우 이 밝은 빨간색 점들은 모두 세포입니다.따라서 다시 한번 확인하고자 하는 것은, 첫째로 우리의 세포들이 CD4 양성이며 CD3 양성인지 확인하는 것입니다. 이 경우 많은 세포가 CD3 양성임을 알 수 있으며, 이는 매우 바람직합니다. 이를 통해 포획의 특이성을 확보할 수 있기 때문입니다.크게 나타나는 부분들이 불순물일 수도 있지만, 많은 경우에 단순히 세포 하나에 CD3 플러시, 즉 CD3가 더 많이 결합된 상황이 발생하곤 합니다. 이 사진은 이 미세유체 장치를 통해 수집한 데이터 중 하나이며, 기본적으로 세포 캡처 프로(cell capture pro)입니다. 이전 슬라이드 등에서 보셨듯이, 세포가 포함된 사진이 많이 있었다는 것을 알 수 있습니다.그렇다면 이들이 실제로 어떻게 축적될까요? 이들은 세포 포집 프로파일로 축적되며, 이 경우 X축에는 입구로부터의 거리를, Y축에는 포집된 세포 수를 표시할 수 있습니다. 장치 전체를 통해 초기 밀도는 매우 높았다가 서서히 감소하는 것을 알 수 있는데, 이는 혈류에서 C4 양성 및 C3 양성 세포를 포집함에 따라 혈액 샘플 내 해당 세포의 농도가 감소할 것이라는 예상과 일치하는 결과입니다.그리고 이것이 기본적으로 저희의 데이터가 보통 제시되는 방식입니다.

cd4-t-lymphocyte-capture-using-a-disposable-microfluidic-chip-for-hiv

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microfluidic 장치를 사용하여 셀 캡처

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에&gt; 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

이 프로토콜의 목표는 폐쇄형 사이토카인 포획 시스템을 통합하고 전담 직원이나 GMP 시설의 사용이 필요하지 않은 벤치탑의 자동화된 2세대 세포 농축 장치를 사용하여 병원체 특이적 임상 등급 T 세포를 제조하는 것입니다. 생성된 거대세포바이러스 pp65 특이적 T 세포는 환자에게 직접 투여할 수 있습니다.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

여기서, 우리는 나노 유체 장치에 있는 급성 사건 및 생산적인 HIV-1 감염을 위해 단 하나 세포가 감시되는 프로토콜을 제시합니다. 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의합니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 이미징을 위한 첫번째 방법이다 운동및 분자 상호 작용을 연구하기 위하여.

다중 매개 변수 광유체 플랫폼을 사용하여 칼슘 유입 및 HIV-1 감염의 단세포 특성화

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

학습하세요 PDMS 기반 일회용 마이크로플루이딩 칩을 사용하여 환자 혈액에서 CD4 양성 T 헬퍼 림프구를 정량화하고 포착하는 방법을. 이 기술은 자원이 제한된 환경에서 HIV 진단을 위한 면역학 연구에 활용됩니다.

CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

더 많은 동영상 탐색