Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

고해상도의 심층 구조 이미징을 위해 투명성을 위해 형광 단백질과 지질을 발현하는 세포가 제거된 깨끗한 마우스 뇌를 취합니다.

하이드로겔 메쉬는 생체 분자를 보존하고 신경 네트워크를 유지합니다.

지지를 위해 아가로스 링이 포함된 이미징 챔버로 뇌를 옮깁니다.

접착제로 조직을 고정하고 굴절률 일치 용액으로 챔버를 채워 빛 산란을 최소화하고 안정적인 이미징 환경을 만듭니다.

챔버를 공초점 현미경 스테이지에 놓고 대물렌즈를 용액 속으로 부드럽게 내려 연속 접촉 열을 설정합니다.

epifluorescence를 사용하여 관심 영역을 찾습니다. 그런 다음 레이저 및 이미징 매개변수를 조정하여 이미지 품질을 최적화합니다.

일련의 z-스택을 캡처하여 조직의 3차원 표현을 만듭니다.

적절한 소프트웨어를 사용하여 수지상 아버, 가시, 뉴런의 분포 및 밀도를 포함한 세포 형태를 분석합니다.

두께가 5mm 이상인 조직을 위한 대형 조직 이미징 챔버를 구성하려면 벽이 높은 10cm 유리 접시를 사용하십시오. 중앙에 50밀리리터 원추형 튜브를 놓고 튜브의 직경이 사용된 대물 렌즈의 배럴을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인합니다. 3% 아가로스를 물에 담그고 유리 접시와 원추형 튜브 사이의 공간에 붓습니다.

그런 다음 1시간 동안 식히십시오. 이것은 고체 아가로스의 고리를 형성할 것입니다. 초강력 접착제를 사용하여 조직을 챔버 바닥에 단단히 부착하고 공기로부터 보존하고 섭씨 4도에서 보관하지 않으면 중합되기 시작할 수 있는 굴절률 일치 용액으로 챔버를 채웁니다. 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.

모든 관련 이미징 장비를 켭니다. 샘플을 스테이지에 놓습니다. 대물렌즈를 가지고 침지 매체에 조심스럽게 접근하고 연속적인 매체 기둥을 형성하십시오. epifluorescence를 사용하여 적절한 이미징 필드를 찾습니다. 해상도 및 스캔 속도 설정을 설정하여 시작하십시오.

공초점 현미경을 사용하여 이미징하는 경우 핀홀을 완전히 닫아 가장 작은 광학 단면을 얻어 최상의 Z 해상도를 얻으십시오. 높은 신호 대 잡음비로 적절한 이미지를 얻을 때까지 레이저 출력 또는 센서 이득을 점진적으로 증가시킵니다. 표준 EGFP 또는 tdTomato 2색 이미징을 사용하는 경우 빛 수집 설정을 지정합니다.

관찰된 조직의 시작과 끝점을 기반으로 Z 스택 매개변수를 설정합니다. 원하는 Z 해상도에 따라 단계 크기를 설정합니다. 스텝 크기가 작을수록 Z 분해능이 높아지지만 샘플 표백이 발생할 수 있습니다.

이미지 획득 설정에 만족하면 이미지를 획득합니다. 이미지의 신호 대 잡음비가 높고 구조의 경계가 뚜렷한지 확인합니다.