Name: 의 드문 경우에 이가와 조직 Transglutaminase이 항체에 의해 표피 Transglutaminase의 인식 붉은 털원숭이 피부염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 학습하세요 피부염성 헤르페티포르미스에서 IgA와 표피 트랜스글루타미나제 자가항체 반응을 시각화하는 방법을. 붉은털원숭이 모델을 통해 면역학적 메커니즘과 조직병리학적 변화를 분석합니다.

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저자는 기술 지원 아만다 Tardo, 닥터 모스 타파 Bouljihad, 스테파니 지내요, 필리, 캐롤 Coyne 박사 에린 Ribka 박사 피터 디디와 도로시 Kuebler 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01 - DK076653 및 KS에 3R01 - DK076653 - 02S1과 TNPRC RR000164의 기본 운영 부여에 의해 지원되었다.

1. 피부 생검 샘플 모음 <ol><li> 이전 피부 생검 절차, 2.5 MG / tiletamine 하이드로 클로라이드와 zolazepam 염산염 telazol 혼합물 (포트 닷지 동물 건강, 포트 다지, IA)의 kg과 intramuscularly 동물을 마취. 드러누움까지 마취의 관리에서 동물을 모니터링하고 그들의 인클로저에서 제거합니다. </li><li> 크기 40 블레이드 (Oster 전문 제품, 맥민빌, TN)와 Oster 골든 A5 싱글 속도 수의학 클리퍼를 이용 흥미 피부 영역에서 머리를 제거하고 무균 betadine 스크럽과 알코올을 교대로 준비합니다. 선택한 생검 사이트를 통해 살균 fenestrated의 드레이프를 확보. </li><li> 악기 180도는 약간의 압력으로 시계 방향과 반대 방향으로 회전하면서 생검 펀치는 피하 TI에 피부 레이어를 통해 transects까지 살균 기술을 사용하여 피부에 대해 4.0 mm Miltex 펀치 피부 생검 악기 (Miltex, 요크, PA) 장소ssue. 생검 샘플을 제거하고 집게와 피하 조직에서 무료로 피부의 가로 부분을 파악. </li><li> 십자 모양의 팔분의 삼 원형 절단 바늘 (Ethilon, Ethicon, 존슨 앤 존슨 의료 제한, 버크셔, 영국)에 연결된 3-0 나일론 봉합사로 피부 결함을 닫습니다. 모든 동물에게 게시물 수술 진통제에 대한 intramuscularly 0.01 밀리그램 / kg buprenorphine 하이드로 클로라이드 (Hospira, 레이크 포레스트, IL)를 제공합니다. </li></ol> 2. 샘플 처리 <ol><li> 만성 피부염과 건강한 컨트롤에서 피부 생검 샘플 작업은 붉은 털원숭이 원숭이. 2-3 (직경 4mm)가 각 동물에서 샘플을 생검 구합니다. </li><li> 24 시간 동안 (Z - 수정, Anatech (주), 배틀 크릭, MI) 아연 포르말린의 첫 번째 예제를 수정, ASP300 Leica 조직 프로세서 (Leica 마이크로 시스템즈 주식 회사로, 30 분 물에 세척 70 % 에탄올에 잠시 씻고, 장소 , 조직의 70 %, 80 %, 95 % 100 % 에탄올 48 오름차순 성적 탈수있다 버팔로 그로브, KS)크실렌의 두 가지 변경 사항 (피셔) 다음 각 (피셔 과학, 피츠버그, PA)를 분. </li><li> 상온에서 장기 저장을위한 파라핀 미디어 (피셔)에 삽입할 수 있습니다. 장소 이전 sectioning 20 분에 - 20oC. 로터리 마이크로톰을 (HM325, Microm 국제, 월도프, 독일)를 사용하여 6 μm의 섹션을 준비합니다. 충전 슬라이드 (피셔)와 하룻밤 60oC에서 건조 공기의 장소 섹션. hematoxylin 및 eosin (H &amp; E) 표준 방법 (아래 설명)에 얼룩. </li><li> 상온에서 30 분 2 % paraformaldehyde (USB 사, 클리블랜드, OH)에 두 번째 예제를 수정, 인산의 세 번 씻어 염분은 (PBS, Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA)를 30 % 자당 (피셔)의 장소, 버퍼 4 시간 그리고 OCT 냉동 매체 (사쿠라 Finetek, Torrence, CA)에 포함. 이전 sectioning 20 분 - 80oC에서 보관. 그라 이오 스탯을 (HM560, 열 과학, 칼라 마주, MI)를 사용하여 15 μm의 섹션을 준비합니다. </li></ol> 3. H &amp; E 염색법 <ol><li> 소스를 Deparaffinize백퍼센트 세 변경, 95 %의 두 가지 변경 사항 하나 80 % 변화와 증류수, 2 분 각각 세 xylenes (피셔)의 변화와 등급 ethanols 통해 rehydrate 통해 됐나요 섹션. </li><li> 한 분 hematoxylin (리차드 - 알란 과학, 칼라 마주, MI)와 얼룩과 수돗물을 실행에 간단한 세척으로하십시오. </li><li> 6 분 eosin (시그마)와 Counterstain. </li><li> 이 2 분 각각의 변화와 다음 xylenes 세 변화에 분명 3 분 각각 95 %와 절대 에탄올로 얼룩진 조직을 탈수. </li><li> H &amp; E - 스테인드 조직 섹션을 통해 Cytoseal 장착 매체를 사용하여 마운트 coverglass (리처드 - 앨런 과학). </li></ol> 4. Histopathological 평가 스팟 통계 디지털 카메라 (디지털 인스 트루먼 트의 주식, 미시간, 미국)와 40x 배율과 Leica 현미경 - H &amp; 4를 사용하여 가벼운 현미경 E - 스테인드 생검 피부 섹션을 검사합니다. 5. Immunofluorescent 안녕 -닝 <ol><li> immunofluorescent 얼룩에 대한 월 임베디드 스킨 섹션과 함께 작동합니다. 전에 얼룩에, PBS에서 20 분 트리톤 X - 100 (시그마)는 OCT를 제거하고 조직을 permeabilize하기 위해 0.1 %와 0.2 % 생선 껍질 젤라틴 (FSG, 시그마)이있는을위한 만끽해보세요. </li><li> 슬라이드를 세척 후 humidified 슬라이드 챔버에서 상온에서 1 시간 동안 PBS - FSG에 희석 10% 정상 염소 혈청 (NGS, 시그마)와 부화. </li><li> 이가와 tTG2 항체의 증착을 시각화하기 위해 1 시간 10 % NGS - PBS - FSG의 희석 방지 붉은 털원숭이 이가와 tTG2 차 항체와 슬라이드를 품어. </li><li> 10 분 PBS - FSG 다음 10 분, 위해 PBS - FSG - 트리톤 X - 100 (시그마)로 씻으십시오. </li><li> 1:1,000 희석에 알렉사 형석 fluorochrome 488 (녹색), 568 (빨간색) 또는 633 (파란색) (분자 프로브 - Invitrogen)로 태그가 보조, isotype 특정 항체와 함께 품어. 핵 DNA를 시각화하는 ToPro - 3 염료를 사용합니다. 항체 희석액으로 10 % NGS - PBS - FSG를 사용합니다. </li><li> 스테인드 조직 섹션을 탑재 방지 칭 솔루션 (시그마)를 사용합니다. </li></ol> 6. 공촛점 이미징 488 NM에서 아르곤 - 크립톤 레이저 (녹색), 568 nm의에서 크립톤 레이저 (세 가지 레이저 (해당 여기 6 라인)이 장착된 Leica TCS SP2 진정한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (Leica, Wetzlar, 독일)와 이미징을 수행 빨간색)과 스펙트럼의 멀리 붉은쪽으로 보이는부터 기간 633 NM (파란색)에서 헬륨 - 네온 레이저. 비 분류 조직 아키텍처 평가에 대한 기록 차등 간섭 대비 (DIC) 이미지. 7. 대표 결과 tTG2와 이가 항체 모두에 의해 eTG의 긍정적인 인식의 예제는 그림에 표시됩니다. 3A. 인간 환자의 상황과 붉은 털원숭이 원숭이에서도 글루텐 감도 CD와 같은보다 DH 같은 피부염의 훨씬 낮은 유행으로 인해과 일치, 피부 생검 샘플의 대부분은 우 것으로 예상된다w tTG2 항체가 아니라 tTG2 + 이가 + 이중 긍정 세포 (그림 4)의 존재없이 긍정적인 반응. 미생물 원산지 피부염 사례를 포함하여 이러한 DH - 무관한 경우, 상피 아래에 흩어져있는 몇 가지 단일 긍정적인 이가 +는 세포를 공개하지만 tTG2과 이가 표시된 마커 (Figs. 3B 4) 사이 없습니다 스펙트럼 중복됩니다. 것입니다 따라서 histopathological 평가 (그림 2)와 다른,보다 일반적인 피부염 유발 대리인이 식별 수 없습니다 경우에만, 공촛점 다음 임상 시험 (그림 1) 시작, 제안된 테스트 절차의 순서를 유지하는 것이 중요합니다 tTG2와 이가에 대한 얼룩진 피부 biopsies의 현미경 시험은 보증됩니다. 혼자 임상 및 / 또는 histopathological 평가이 조건의 긍정적인 진단에 충분하지 않습니다. 이러한 경우에는 때 두 번 긍정적인 (tTG2 + 이가 +) 세포가 피부 용의자의 주변 지역 식별, DH 같은 피부염 진단이 발행하실 수 있습니다. 식이 글루텐 이러한 경우에는 탈퇴그리고 글루텐없는 다이어트의 관리는 피부염의 증상을 완화하기 위해 권장합니다. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 전에 EM96 짧은 꼬리 원숭이의 사타구니 지역 (A)과 후 (B) 5 주 동안식이 글루텐의 취소. 식이 글루텐의 Reintroduction는 피부염의 재현 (C)가 동시에. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 그가 전에 수집 EM96 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 얼룩 (A)과 후 (B) 9 주 동안식이 글루텐의 취소. A :의 상피는 hyperkeratotic 세포의 두꺼운 표면 지각 degenerating의 neutrophils과 침투와 (과 상피 세포의 7-15 층) 두꺼워입니다. Neutrophils는 상피 내부에도 나타납니다 lymphocytes, 플라즈마 세포, 그리고 상부 진피에있는 adnexa 주변 histiocytes의 적당한 번호를 혼합하고 있습니다. B : 어떤 hyperkeratosis가 여전히 존재하는, 상피 두께는 상부 진피에 최소한 lymphoplasmacytic 침투와 함께 (4-7 층) 표준입니다. C : 아니요 lymphoplasmacytic 침투와 FR56 짧은 꼬리 원숭이에서 일반 복부 피부, 비교 포함되어 있습니다. 확대 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 이전에 수집된 EM96 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 공촛점 현미경 이미지 (A)과 후 (B) 9 주 동안식이 글루텐의 취소. A : 이가의 얼룩 (녹색), tTG2 (적색) 및 ToPro - 3 핵 DNA 마커 (파란색). 이가와 tTG2의 공동 지방화는 피부 papilae의 주위 노란색으로 나타납니다. B : 스킨 샘플이 9 주 후에 촬영 글루텐이없는 일부 subepithelial 이가이, (녹색) 여전히 tTG2 (적색) 및 ToPro - 3 핵 DNA 마커 (파란색) 존재하는 동안 다이어트 상피 이내에 이가를 보여줍니다 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 강한&gt; 동물 만성 (DH - 무관) 피부염의 증상을 전시 동안 GI24 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 공촛점 현미경 이미지가 수집. 이가의 얼룩은 빨간색과 ToPro - 3 핵 DNA 마커은 파란색입니다.에서는 녹색, tTG2에 tTG2 + 세포가 존재하는 상피 안에 몇 이가 + 빨간색과 녹색 마커 사이에 광범위한 스펙트럼 중첩가 본 적이있는 동안 상피 세포 아래에. <table border="1"><tbody><tr><td> 동물 태그 </td><td> 섹스 [M / F] </td><td> 나이 [년] </td><td> 임상 증상 </td><td> 플라즈마 tTG2 항체 </td><td> 다이어트 [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td> 건강한 </td><td> - </td><td> 일 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td> 건강하고, 가끔 설사 </td><td> + </td><td> 일 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td> 만성 특발성의 설사 </td><td> - </td><td> 일 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5.0 </td><td> 만성 피부염 </td><td> + / - (경계선) </td><td> 1, 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td> 만성 피부염 </td><td> - </td><td> 일 </td></tr></tbody></table> 표 1. TNPRC는 붉은 털원숭이 피부 biopsies를 수집 이용 원숭이 * 다이어트 1 - 일반 원숭이 차우 (글루텐 함유) 다이어트 2 - 글루텐 무료 다이어트

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

글루텐 민감도 우리의 새로 설립이 아닌 인간의 영장류 모델은 최근에식이 글루텐 5,6에 의해 트리거 장의 투자율 변화를 연구하는 데 사용되었다. 플라즈마 tTG2 항체뿐만 아니라 창자 tTG2 + 이가 + 보증금 일부 글루텐에 민감한 짧은 꼬리 원숭이에서 발견되었습니다. 우리가 최근 붉은 털원숭이 식민지에 일반 (신진 대사 / 전염성) 병인가 설립되지 수 원숭이를 특발성 피부염의 희귀한 사건을 확인 때문에, 본 연구의 목적은 평가에 있었다면 tTG2 + 이가 + 항체 예금은 이러한 드문 경우에서 피부 샘플에 포착할 수 피부염의 (표 1). 1:70와 1:200 7 일 사이 CD 범위 나타내는 아르 tTG2 autoantibodies의 유행. 글루텐에 민감한 원숭이와 함께 우리의 연구는 포로에서 tTG2 항체의 유행을 나타내는 것은 붉은 털원숭이 인간의 인구에서보고되는 유사한을 원숭이. 범위 O에 영향을있을 차 환경 및 유전적 요인인간과 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약이나 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 / 제품 코드 </td><td> 주의 </td></tr><tr><td> 반 (反) 인간 이가 FITC * </td><td> 시그마, 세인트 루이스, 미주리 </td><td> F - 5259 </td><td> 1:100 희석 작업 </td></tr><tr><td> 안티 - 인간 tTG2 </td><td> 써모 과학, 칼라 마주, MI </td><td> MS - 300 - P1ABX </td><td> 1:100 희석 작업 </td></tr><tr><td> 안티 마우스 IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> A - 21124 </td><td> 1:1,000 희석 작업 </td></tr><tr><td> ToPro - 3 DNA 프로브 *** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> T - 3605 </td><td> 1:1,000 희석 작업 </td></tr><tr><td> 포르말린 아연 (Z - 수정) </td><td> Anatech (주), 배틀 크릭, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> OCT 냉동 중 </td><td> 사쿠라 Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 장착 중 </td><td> 리차드 - 알란 과학, 칼라 마주, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 담금질 용액 </td><td> 시그마, 세인트 루이스, 미주리 </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (나일론 봉합사) </td><td> Ethicon, 존슨 앤 존슨, 버크셔, 영국 </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex 펀치 피부 생검 악기 </td><td> Miltex, 요크, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> 크기 40 블레이드와 Oster 골든 A5 단일 속도 수의사 클리퍼 </td><td> Oster 제품, 맥민빌, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Leica 조직 프로세서 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 Inc의., 버팔로 그로브, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> 로터리 마이크로톰 </td><td> Microm 국제 월도프, 독일 </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> 써모 과학, 칼라 마주, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> Leica, Wetzlar, 독일 </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * 플루오레신 isothiocyanate tTG2 일차 항체 후 사용 ** 차 (알렉사 형석 568 - 복합) 항체 ** 염료

의 드문 경우에 이가와 조직 transglutaminase이 항체에 의해 표피 transglutaminase의 인식 붉은 털원숭이 피부염

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

조직 transglutaminase 2 (tTG2)는 이미 부분적으로 소화식이 글루텐 예 : 글리아딘의 펩티드를 deamidates 장내 소화 효소이다. 유전자 predisposed 개인에 tTG2는 tTG2 항체와 작은 창자 벽 1,2에 자신의 직접 증착의 생산에 의해 특징 면역 응답을 트리거합니다. 이러한 항체의 존재는 복강 질환 (CD)의 주요 특징 중 하나를 구성합니다. 표피 transglutaminase (eTG)도 CD 환자의 소수에서 autoantigen로서 기능을 할 수 transglutaminase 가족의 다른 구성원입니다. 이러한 비교적 드문 경우에는, eTG는 임상적으로 피부염의 herpetiformis (DH)로 알려진 면역 반응 (피부 발진) 트리거합니다. CD 및 DH pathogenesis의 정확한 메커니즘이 잘 이해되지 않지만, 그것은 알려진 것이 tTG2와 CD와 DH 환자 3,4 모두에서 혈청 항체에 의해 인식된다 공유할 antigenic의 epitopes을 eTG. (Macaca mulatta) (표 1, 그림. 1, 2)의 피부 병변의 생검 샘플의 공촛점 현미경 시험은 영향을받는 조직을 연구하는 데 사용되었다. 한 동물 (EM96)에서 이가와 tTG2 항체 (그림 3)의 스펙트럼 중첩을 보여주되었습니다. 이중 긍정적인 tTG2의 존재가 + 이가 + 세포는 피부 용의자 주변의 깊은 표피에 집중되었다. 이것은 DH 환자 3에서 설명한 병변과 일치합니다. EM96은 글루텐 - 무료 다이어트, 피부염뿐만 아니라에 배치되었을 때 tTG2 + 이가 + 예치금가 사라진과 (Figs. 1-3) 더 이상 감지되지 않았다. 피부염은 EM96의 식단 글루텐 (표시되지 않음)의 재 도입에 따라, 그러나 등장. 관련이없는 피부염과 동물 등 다른 원숭이에서 tTG2 + 이가 + 예금은 발견되지 않았습니다. tTG2의 존재와 함께 EM96에 피부염의 글루텐 무료 다이어트에 의존 죄사함 + 이가 +의 피부에 세포가 제안자가 면역 질환, DH 같은이 조건의 개발을위한 메커니즘. 이것은 모든 비 인간 영장류에서 DH 같은 피부염의 첫 번째 보고서입니다.

피부염의 herpetiformis (DH)는 이가와 표피 transglutaminase (eTG) 사이의 면역 반응을 특징으로 만성 염증성 조건입니다. DH는 글루텐에 민감한 및 / 또는 복강 환자의 아주 작은 부분에 개발하고 있습니다. 본 연구의 결과는 DH도 idiopatic 피부염의 증상으로 붉은 털원숭이 원숭이 호스트에서 개발할 수 있음을 나타냅니다.

의 드문 경우에 이가와 조직 Transglutaminase이 항체에 의해 표피 Transglutaminase의 인식 붉은 털원숭이 피부염

조직 트랜스글루타미나제 2(tTG2)는 이미 부분적으로 소화된 식이 글루텐(예: 글리아딘 펩타이드)을 탈아미드화하는 장 내 소화 효소입니다. ...

본 비디오 논문은 포진성 피부염을 앓고 있는 글루텐 민감성 Reeses Maccas의 피부 내 자가면역 반응을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이는 먼저 특발성 사례 및 연령대가 일치하는 건강한 대조군 중에서, 더 흔하게 진단되는 다른 피부염 원인과 연결될 수 없는 피부염 증상을 보이는 동물을 식별함으로써 이루어집니다. 조직 구조, 염증 및 표피 트랜스글루타미나제의 존재 여부를 평가하기 위해 환부에서 피부 샘플을 채취합니다.수집된 자가항체 샘플은 아연 포르말린과 2% 파라알데히드 헤마틴을 사용하여 고정하며, EOSIN 또는 H&amp;E로 염색합니다. 이후 염증의 정도와 조직병리학적 상태를 평가하기 위해 염색을 수행하며, 진피 하부로의 표피 트랜스글루타미나제 자가항체 침착을 평가하기 위해 면역형광 염색을 수행합니다. 포진성 피부염은 IgA와 표피 트랜글루타미나제 사이의 자가면역 반응을 특징으로 하는 만성 염증성 질환으로, 글루텐 민감성 셀리악 환자의 매우 적은 일부에서 발생합니다. 본 연구 결과는 DH가 글루텐 민감성 레서스 원숭이의 일부 개체에서도 발생할 수 있음을 나타냅니다.본 연구 결과는 제시된 바와 같이 최근 개발된 글루텐 민감성의 Resus Meac 모델의 타당성을 입증합니다. 연구 결과, 이 질환의 임상적 징후가 소장에만 국한되지 않음이 밝혀졌습니다. 전형적인 프로토콜에는 특발성 피부염이 있는 동물 한 마리와 연령이 일치하는 건강한 대조군 한 마리가 포함됩니다.멸균법을 이용해 적절한 마취와 부위 준비를 마친 후, 4.0 millimeter miltex punch 피부 생검 기구를 동물 피부에 대고 가볍게 압력을 가합니다. 생검 펀치가 진피층을 지나 피하 조직까지 절개할 때까지 기구를 시계 방향과 반시계 방향으로 180도 회전시킵니다. 핀셋을 사용하여 두 번째 생검을 위해 이 과정을 반복합니다.절단된 피부 부분을 잡고 피하 조직으로부터 분리합니다. H&amp;E 염색을 위해 처리할 첫 번째 샘플을 zinc formalin에 넣습니다. 그런 다음 3/8 원형 절개 바늘과 3-0 나일론 봉합사를 사용하여 면역형광 현미경으로 평가할 두 번째 샘플을 2% Paraform aldehyde에 넣습니다.피부 결손 부위를 십자 형태로 봉합합니다. 이 과정을 반복하여 동물당 2~3개의 생검 샘플을 채취합니다. IGA 및 TTG 2의 존재와 국소화를 조사하기 위해 서면 프로토콜에 상세히 기술된 대로 수술 후 진통제를 투여합니다.먼저 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 넣은 샘플을 상온에서 4시간 동안 배양하여 고정합니다. 고정 후 파라포름알데히드를 제거하고 로커 플랫폼(rocker platform) 위에서 30분에서 60분 동안 PBS로 세척합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척한 다음, PBS를 제거하고 30% sucrose로 교체하여 최소 4시간에서 최대 2주 동안 둡니다.다음으로, 샘플을 OCT 동결 매질에 넣고 2-메틸부탄과 드라이아이스 혼합조에 담가 투명한 OCT가 완전히 얼어 흰색 고체가 될 때까지 둡니다. 그 후 블록을 -80 °C에서 최소 20분 동안 보관합니다. 이렇게 하면 조직이 완전히 고정되어 블록이 으깨지지 않고 칼날로 정교하게 절단할 수 있습니다.조직은 -80 °C의 OCT에서 장기간 보관할 수 있습니다. 섹셔닝 후 슬라이드에 섹션을 마운팅한 다음, OCT를 제거하고 조직을 투과시킵니다. 0.2% 어피 젤라틴과 0.1% triton X 100이 포함된 PBS가 담긴 Copeland jar에 슬라이드를 담급니다.그 다음 병을 로커(rocker) 위에 올려 20분 동안 둡니다. 20분 후, 0.2% fish skin gelatin이 포함된 PBS로 슬라이드를 10분 동안 세척한 다음, 0.2% fish skin gelatin이 포함된 PBS에 희석한 10% normal goat serum과 함께 습윤 슬라이드 챔버 내 실온에서 40분 동안 배양합니다. anti resus IGA 및 TTG 1차 항체를 각각 개별적으로 사용하여 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드의 가장자리를 잡고 전이 피펫을 사용하여 P-B-S-F-S-G Triton X 100을 부드럽게 분사합니다.그런 다음 동일한 완충액이 들어 있는 Copeland jar에 넣습니다. 이어서 jar를 로커(rocker) 위에 올려두고 10분 동안 흔들어 줍니다. 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.그런 다음 P-B-S-F-S-G로 10분 동안 세척합니다. 배양 후, 아이소타입 특이적 Alexa fluor 표지 2차 항체와 함께 40분 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 슬라이드를 세척합니다.그런 다음 1:2000 비율로 희석한 핵 DNA 염색 시약을 Pro 3 anti-quenching 마운팅 매질에 첨가합니다. 각 슬라이드에 마운팅 매질 한 방울을 직접 떨어뜨립니다. 이후 조직 위에 커버슬립을 덮고 매니큐어로 밀봉합니다.슬라이드를 어두운 곳에 두고 건조시킵니다. IGA 및 TTG 이중 염색을 시각화하려면, 비표지 조직 기록 평가에 사용된 2차 항체에 적합한 레이저가 장착된 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미징을 수행하십시오. 미분 간섭 대비, DIC 이미지를 기록합니다.DIC는 조직을 그레이스케일로 분해하는 현미경 내 채널입니다. 이를 통해 HNE 염색을 수행하기 위해 세포 구조를 더 정확하게 결정할 수 있습니다. 아연 포르말린에 넣었던 시료를 먼저 파라핀으로 블록화한 후 슬라이드 위에 절편으로 제작합니다.그 다음 슬라이드를 60 °C에서 하룻밤 동안 베이킹한 후 자동 염색기에 넣으며, 염색이 완료되면 슬라이드가 HNE로 염색됩니다. 디지털 카메라가 장착된 광학 현미경을 사용하여 Forex 및 40x 배율로 염색된 생검 절편을 관찰하십시오. 각 배율당 3~4장의 이미지를 기록하십시오. 여기서 식이 글루텐 제한이 피부염에 미치는 영향을 연구하기 위해 Reuss Maca의 피부 병변에서 생검 샘플을 채취하여 본 영상에 설명된 대로 염색하였습니다.식단에서 글루텐을 제거하기 전 한 마리의 마카크 서혜부 모습입니다. 이 동물을 글루텐 프리 식단으로 전환하자, 여기에서 볼 수 있듯이 피부염이 사라져 더 이상 검출되지 않았습니다. 조직 구조를 평가하기 위해 식단에 글루텐을 다시 도입하자 피부염이 재발했습니다.글루텐 섭취 중단 전에 H and e 염색을 수행하였습니다. 상피층은 7~15층의 상피 세포로 인해 두꺼워졌으며, 퇴행성 중성구(neutrophils)가 침윤된 과각화 세포의 두꺼운 표면 각질층이 관찰되었습니다. 식단에서 글루텐을 9주 동안 제거한 후, 상피 내부에서도 중성구가 나타났으며 상부 진피의 부속기관 주변에는 적당한 수의 림프구, 형질세포 및 조직구가 혼재되어 나타났습니다.일부 과각화증과 상피 증식이 여전히 관찰되었으나, 대조적으로 상부 진피에서는 최소한의 림프형질세포 침윤만이 나타났습니다. 여기에는 상피 증식과 상부 진피의 림프형질세포 침윤이 없는 정상 복부 피부가 표시되어 있습니다. 식단에서 글루텐을 제거하기 전에 수집한 동일한 마카카 피부 생검 조직의 공초점 현미경 이미지에서, 녹색으로 표시된 IGA와 적색으로 표시된 ttg two의 공국소화가 진피 유두 주변 영역에서 황색으로 나타나 표피 트랜스글루타미나제에 대한 자가항체의 존재를 나타냅니다.글루텐 프리 식단을 9주간 유지한 후, to pro three 핵 DNA 마커가 파란색으로 나타났습니다. 상피 내에서 IgA가 더 이상 관찰되지 않았으며, 이는 노란색으로 표시되었을 표피 트랜스글루타미나제에 대한 자가항체가 없음을 나타냅니다. 일부 상피하 IgA(초록색으로 표시)는 여전히 존재했으며, 관련 없는 특발성 피부염이 있는 동물을 포함한 다른 맥카(Maccas)에서도 to pro three 핵 DNA 마커가 파란색으로 나타났습니다.자가항체는 검출되지 않았습니다. IgA 염색은 녹색, ttg 2는 적색, TO-PRO-3 핵 DNA 마커는 청색으로 나타납니다. ttg 2 양성 세포들이 상피 내부에 존재합니다.상피 아래에 소수의 IgA 양성 세포가 관찰됩니다. 적색 및 녹색 마커 간의 광범위한 스펙트럼 중첩이 보이지 않으며, 이는 표피 트랜스글루타미나제에 대한 자가항체가 없음을 나타냅니다. 본 연구에서는 공초점 현미경을 사용하여 표피 트랜스글루타미나제에 대한 IgA 자가항체의 존재를 시각화합니다.이 절차를 수행할 때, 피부염 사례의 대부분은 글루텐 민감성에 의해 발생하지 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 혈청 내 anti-gliadin, anti-tissue transglutaminase 항체 검출을 포함한 다른 방법들과 세심한 임상 평가가 사전에 수행되어야 합니다. 그럼에도 불구하고 포진성 피부염의 유병률은 앞서 제시된 글루텐 민감성 장병증의 유병률보다 낮습니다.이러한 상태를 가진 추가 동물이 확인될 것이라는 가정하에, 본 결과는 향후 연구를 위한 기초를 제공합니다.

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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