Using Spectral Reflectometry to Determine Myelinated Axon Diameters in a Fixed Mouse Brain Slice

뇌 조직 수초초 나노 구조를 해독하기 위해 넓은 스펙트럼 범위에 맞게 구성된 안정화된 레이저 소스가 있는 초분광 공초점 현미경을 사용합니다.

기준 미러를 사용하여 기준선 반사율 스펙트럼을 캡처합니다. 미러를 제거하고 검출기 노이즈 보정을 위해 어두운 오프셋 스펙트럼을 획득합니다.

고정된 뇌 조직 절편이 있는 챔버를 현미경 스테이지로 옮깁니다.

초점면을 관심 있는 조직 영역에 정렬하여 유리-조직 인터페이스의 간섭을 최소화할 수 있는 충분한 깊이를 보장합니다.

레이저 광은 축삭의 다층 수초로 향합니다.

빛이 미엘린과 상호 작용할 때 층의 계면에서 부분 반사가 발생하여 다양한 층 두께와 굴절률로 인해 간섭 패턴이 생성됩니다.

이러한 간섭 패턴의 스펙트럼 이미지를 획득합니다.

기준선 보정 및 신호 분석 후 반사율 스펙트럼은 파수 주기성을 나타내어 수초 축삭 직경을 결정할 수 있습니다.

표면이 대물 렌즈를 향하도록 현미경 스테이지에 기준 거울을 장착합니다. 미러를 현미경 스테이지에 놓기가 쉽지 않은 경우 평판에 미러를 부착하십시오. 현미경 스테이지를 조정하여 초점면을 거울 표면에 맞춥니다. 그런 다음 검출기의 동적 범위를 고려하여 PMT 이득과 레이저 출력을 조정합니다.

의사 색상 아래에서 파장 범위 전체에 채도가 없는지 확인합니다. 포화가 관찰되면 레이저 출력을 낮추십시오. 그런 다음 람다 스캔 획득을 실행합니다. 스테이지에서 미러를 제거하고 샘플 없이 동일한 획득을 반복하여 어두운 기준을 얻습니다. 그런 다음 데이터를 다중 스택 TIFF 형식으로 저장합니다.

SpeRe 이미지 획득을 수행하려면 장착된 조직을 현미경 스테이지에 놓습니다. 접안렌즈를 통해 대물 렌즈의 초점면에 조직을 대략적으로 정렬하려면 광시야 형광 모드를 사용합니다. 라이브 스캔을 켠 상태에서 현미경 스테이지를 제어하여 초점면을 조직의 관심 영역에 맞춥니다. 커버슬립의 배경 소음을 방지하려면 유리 조직 인터페이스에서 최소 15마이크로미터 깊이의 대상 영역을 선택합니다.

이 비디오의 앞부분에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 대상 영역에 대한 스펙트럼 이미지 스택을 획득합니다. 그런 다음 조직 및 다크 오프셋에 대한 데이터를 다중 스택 TIFF 형식으로 저장합니다. ImageJ에서 이미지를 처리하려면 참조 거울과 뇌 조직에 대한 스펙트럼 데이터를 엽니다.

열린 이미지 스택의 ROI, 참조 미러의 중앙 영역 및 뇌 조직의 축삭 섬유 세그먼트를 선택합니다. 그런 다음 이미지, 스택, 플롯 z축 프로파일을 실행하여 선택한 ROI에 대한 원시 스펙트럼을 획득합니다.

축삭 섬유는 길이에 따라 구조적으로 이질적일 수 있으므로 부분 부피 아티팩트를 최소화하기 위해 일반적으로 5마이크로미터 미만의 작은 축삭 세그먼트에서 ROI를 선택하는 것이 좋습니다.

참조 거울에 대해 취한 데이터와 뇌 조직에 대해 취한 어두운 오프셋 데이터를 열고 방금 설명한 대로 z축 프로파일을 플로팅합니다. 그런 다음 복사 및 붙여넣기 옵션을 사용하여 획득한 모든 옵션을 저장합니다.