마우스 망막 원뿔 광수용체의 칼슘 역학을 모니터링하기 위한 이광자 현미경 검사

멤브레인 장착 마우스 망막 조직이 포함된 커버슬립을 2광자 현미경 아래에 놓습니다.

조직은 원뿔 광수용체에서 FRET 기반 칼슘 바이오센서를 발현합니다.

침수 대물렌즈를 사용하여 조직에 초점을 맞춥니다.

배경 조명 아래에서 원뿔 축삭 말단은 탈분극된 상태로 유지되어 칼슘 유입을 허용합니다.

세포내 칼슘 결합은 바이오센서의 형태를 변경하여 기증자와 수용체 형광단을 더 가깝게 만듭니다.

2광자 이미징을 시작합니다.

현미경의 레이저는 저에너지 근적외선을 조직에 집중시킵니다.

레이저의 초점에서 두 개의 광자가 동시에 바이오센서를 여기시켜 기증자에서 수용체로의 에너지 전달을 촉발합니다.

이것은 수용체 형광을 증가시키는 동시에 기증자 형광을 감소시킵니다.

형광 비율을 계산합니다.

다음으로, 빛 자극을 전달하여 원뿔을 과분극시켜 세포내 칼슘 수치를 감소시킵니다.

이는 바이오센서의 형태를 되돌려 기증자에서 수용체로의 에너지 전달을 억제하고 형광 비율을 낮춥니다.

원뿔 축삭 말단에서 빛 유발 칼슘 역학을 분석하기 위한 반응을 기록합니다.

홀딩 챔버에서 기록 챔버로 슬라이스를 옮기고 즉시 탄산소화 세포외 용액으로 관류를 시작합니다. 기록 챔버에서 분당 2밀리리터의 관류 유량과 섭씨 37도의 온도를 유지하십시오. 20x, 0.95 NA 수침 대물렌즈와 CCD 카메라를 기록 챔버 아래의 적외선 LED와 함께 사용하여 망막 슬라이스를 찾습니다.

제조업체에서 지시한 대로 2광자 이미징 시스템을 시작합니다. 그런 다음 레이저를 켜고 860나노미터로 설정합니다. ECFP와 황수정의 형광 이미징을 위해 두 개의 검출 채널을 켭니다. 그런 다음 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 2광자 현미경을 제어하여 기록할 원뿔 단자 행을 스캔하고 선택합니다. 이미지 획득을 128 x 16 픽셀 이미지 또는 유사한 구성으로 설정합니다.

외부 세그먼트의 광색소 표백을 방지하기 위해 스캔 영역을 콘 단자로 제한하십시오. 레이저를 켭니다. 원뿔이 스캐닝 레이저와 자극 배경광에 적응하도록 20-30초 동안 허용한 후 빛 자극을 제시하거나 약리학적 제제를 적용합니다. 이제 임의의 자극 프레젠테이션을 시작하십시오. 자극은 맞춤형 소프트웨어로 제어되는 마이크로프로세서 보드를 사용하여 시간이 지남에 따라 두 LED의 강도를 변조하여 생성됩니다. 그런 다음 각 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 두 개의 형광 채널을 동시에 기록하기 시작합니다.