Name: 포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 학습하세요 렌티바이러스 포장 프로토콜을 통해 포유류 세포에 효율적인 유전자 전달을 수행하는 방법을. 293TN 생산 세포를 이용한 고역가 바이러스 입자 제조 기술을 익혀 안정적인 유전자 발현을 실현하세요.

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우리는이 프로토콜의 개발과 테스트 그들의 지원을 위해 SBI에서 직원들과 과학자들이 인정하고 싶습니다.

1. 포장 Plasmids있는 293TN 세포의 Transfection과 표현이 건설 <ol><li> 종자 7.0-8.0 X 10 4 MM L-글루타민, 4.5 g / L 포도당과 항생제없이 태아 소 혈청 (10 %)로 보완 DMEM 매체를 포함하는 배지 20 ML에서 15cm이 문화 판 당 6 293TN 세포. 세포 밀도가 transfection시 confluency 60~80%에 도달되도록 2 5 %의 CO와 37 ° C에서 18~24시간 동안 성장. 어떤 경우에는 그것은 표적 세포의 형질 도입에 대한 높은만큼 titer를 얻기 위해 세포의 씨앗 몇 접시로 필요할 수 있습니다. </li><li> 세포의 각 플레이트의 경우 autoclaved이 ML Eppendorff 튜브 1.6 ML 혈청이없는 DMEM를 추가합니다. 당신의 lentivector 45 μl pPACKH1 또는 pPACKF1 및 4.5 μg 아래로 pipetting 및하여 DMEM과 믹스에 건설을 추가합니다. </li><li> 같은 튜브에 PureFection의 55 μl를 추가합니다. 10 초 동안 와동. 실내 온도 F에서 DMEM-플라스미드-PureFection 혼합물을 품어15 분. </li><li> 조직 배양 플레이트 골고루 접시에 걸쳐 분산하여 부드럽게 드롭 현명하고 소용돌이에 DMEM-플라스미드-PureFection 혼합물을 추가하십시오. 인큐베이터에 접시를 반환 5 % CO 2와 37 ° C에서 성장. </li><li> transfection 후 미디어를 변경할 필요는 없습니다. 당신의 lentivector 구조가 GFP와 같은 형광 단백질을 인코딩 유전자를 표현하는 경우 12-24시간 transfection 후 현미경으로 세포를 확인합니다. 당신은 transfection에 성공했다는 의미&gt; 90% GFP 양성 세포를 볼 수 있습니다. </li><li> 50 ML 멸균 원심 튜브에 세포 배양 48 후 뜨는 및 72 시간 수집합니다. 이것은 세포 배양 뜨는 지금 전염성 pseudoviral 입자를 포함하고 있습니다. 펠렛에 상온에서 15 분 세포 파편을위한 1,500 XG에서 (BSL-2 안전 클래스 작업에 대한 권장 지침을 따르십시오.) 원심 분리기. 펠렛을 방해하지 않도록 보장하는 새로운 튜브에 바이러스 표면에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 바이러스성 포장에 사용되었습니다 293TN 세포 생물 학적 용기에 폐기 및 바이러스 포장의 추가 라운드에 사용할 수 없습니다되어야합니다. </li></ol> 2. 바이러스성 뜨는의 농도 <ol><li> 한 감기 부피 (4 ℃) lentiviral 입자 함유 뜨는의 모든 4 권까지 PEG-그것 바이러스 강수량 솔루션입니다. 추가 큰 볼륨에서 lentiviral 입자의 강수는 코닝 250 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 구현할 수 있습니다. 반전 튜브를 여러 번하여 솔루션을 섞어지만, 혼합물 와동하지. </li><li> (최대 4 일 수용) 최소한 12 시간 동안 4 ° C에서 솔루션을 냉장. 흔들거나 냉각 단계에서 튜브를 회전하지 마십시오. </li><li> 4에서 30 분 1,500 XG에 뜨는 / PEG-그 혼합물을 원심 ° C. 원심 분리 후, lentiviral 입자 튜브 하단의 베이지색이나 흰색 펠렛으로 표시됩니다. supernata을 붓고NT. </li><li> 펠렛의 시켰던 lentiviral 입자를 방해하지 않도록 돌보는 열망에 의해 유체의 모든 흔적을 제거합니다. 성분이 잔류 PEG-그것이 바이러스를 희석합니다 (따라서 titer를 줄여)하지만 PEG-그것이 불활성과 독성이되지 않기 때문에 대상 세포의 무결성에 영향을주지 않습니다. </li><li> Resuspend (4 ℃) 추위를 사용하여 원래 볼륨의 1 / 100 lentiviral 입자를 결합, 멸균 인산은 식염수 버퍼 혹은 DMEM이 25 밀리미터 HEPES 버퍼를 포함. </li><li> 사용할 준비까지 살균 극저온 튜브와 -70에서 매장 ° C로 나누어지는. </li></ol> 3. 대상 세포의 바이러스성 Titering 및 형질 도입 <ol><li> 우리는 표적 세포 -의 - 관심을 transducing과 실험 사이의 일관성을위한 대상 세포에 대한 감염의 적절한 다수를 (방어) 계산 전에 lentiviral 입자를 titering 좋습니다. 바이러스성 titering 위해서는 쉬운 감염 긍정적인 제어 라인으로 HT1080 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 경기수titering 프로토콜 당신이 포장했습니다 lentiviral 입자의 작은 나누어지는로 HT1080 세포를 transducing 포함합니다을 쉽게. titer가 알려져되면, 대상 세포 -의 - 관심은 또한 생산 lentiviral 입자로 transduced 수 있습니다. : 권장 titering 프로토콜에서 찾을 수 <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> 세포 배양 매체에서 24 잘 판에 잘마다 플레이트 50,000 표적 세포 -의 - 관심. 세포가 정상적으로 자신의 특정 문화 상황에서 인치 배양해 세포가 하룻밤 사이에 성장하고있는 미디어를 사용하십시오. 세포는 형질 도입 당일 합류 % 70-50 사이 여야합니다. </li><li> 형질 도입의 날에는 세포에서 미디어를 기음. 1 X 최종 농도 (예를 들어, 2.5 μl TransDux 500 문화 매체 μl)로 TransDux와 문화 매체를 결합. 그런 다음 TransDux-CE를 전송각도에 표시됩니다 배지 혼합. </li><li> 각도에 목표 세포에 대한 방어 최적에 해당하는 바이러스의 적절한 볼륨을 피펫. 최적 입니다만 알 수있다면, 우리는 다른 MOIs의 범위 (예 : 방어 1, 2, 5의 조직 배양 세포를 손쉽게 감염을위한, 그리고 입니다만 더 어렵습 대 1, 10, 20 등 노력하는 것이 좋습니다 ) 기본 세포를 감염. lentiviral 입자의 농도는 (같은 바이러스 titering 프로토콜을 통해 결정) 알려져 있지 않은 경우, 바이러스의 서로 다른 볼륨이 같은 바이러스의 1, 2, 5 μl로 재판을받을 수 있습니다. 바이러스가 72시​​간에 대한 타겟 세포와 접촉에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 과 추가 실험 대상 세포를 중 - 관심 transduced 바이러스 구조가 숙주 세포의 게놈에 통합되면, 도입 후 72 시간 시작됩니다. 그들의 특정 요구에 따라 세포 -의 - 관심 매체와 통과 목표를 변경합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <p293tn transfection> 293TN 세포의 시작 밀도는 성공적인 바이러스성 포장에 중요합니다. 293TN 세포는 transfection의 날 (그림 2) % -80 60 사이에 합류해야합니다. 293TN 세포가 60 % 합류 미만의 경우 그들 transfection을 시도하기 전에 몇 시간 동안 성장할 수 있습니다. 293TN 세포가&gt; 80 %의 합류있다면, 그들은 transfection하기 전에 replated해야합니다. lentivector 표현 GFP를 사용하는 경우 293TN 세포의 적어도 90 %는 성공적인 transfection (그림 3)을 나타내는 transfection 후 24 시간 안에 녹색 형광한다. 세포의 미만 90 %가 GFP 양성면이 transfection이 성공적이지 않았음을 나타냅니다, 그리고 바이러스 titers 낮게되므로, 다음 단계로 진행하지 않습니다. 대신 플레이트 새로운 293TN 세포 transfecting 전에 293TN 세포가 적절한 세포 밀도에서한지 만드는 시작. 293TN 세포 48~72시간 transfection 후 조직 배양 플레이트라고 결론 지었다 수 있습니다. 이것은 부정적인 lentiviral 입자의 생산에 영향을주지 않습니다. HT1080 세포와 Titering 바이러스성 titers는 제조 업체의 지침에 따라 SBI의 글로벌 UltraRapid Titering 키트를 사용하여 계산하실 수 있습니다. 이 시스템은 HT1080 세포로 lentiviral 벡터에서 WPRE 순서 바이러스 통합을 측정하는 qPCR을 활용하고 정확하게 ML 당 전염성 단위 (그림 4)을 측정할 수있는 게놈 참조 시퀀스를 기반으로, 표준 곡선에 이것을 비교합니다. 대상 세포의 형질 도입 constitutively 활성 GFP를 마커를 표현하는 lentiviral 입자를 사용하는 경우 형질 도입 반응이 작동하는 경우, GFP 양성 세포는 형질 도입의 12~24시간 이내에 나타나기 시작합니다. lentiviral 구조가 안정적으로 t으로 통합 후 GFP 발현은 계속한다그는 세포 게놈을 호스팅할. 다른 MOIs으로 transducing 경우, GFP 형광은 약 입니다만, 낮은 MOIs는 GFP 형광을 (그림 5) 증가 않음 이하 GFP의 형광과 높은 MOIs 표시 위치와 일치해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 바이러스 생산 프로토콜의 개요. lentivector 및 pPACK 포장 plasmids은 혼합 및 293TN 세포로 공동 transfected 있습니다. 48 -72 시간이 흐른 바이러스 뜨는가 수집되고, 바이러스 입자는 PEG-그것으로 시켰던 있습니다. lentiviral 입자 titering 후, 그들은 세포 -의 - 관심 대상을 transduce하는 데 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 293TN 세포의 그림 2. 위상 콘트라스트 이미지입니다. 세포 density는 60-80%의 합류 transfection 당일 사이 여야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 24시간 Purefection, pPACKH1 및 lentivector 구조 인코딩 GFP로 transfection 후 GFP 양성 293TN 세포의 형광 이미지입니다. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. WPRE의 qPCR 결과와 방어 및 포장 바이러스 입자의 대응 titer를 계산하는 SBI의 글로벌 UltraRapid Titering 키트를 이용하여 얻은 표준 곡선. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> HT1080 세포의 그림 5. 형광 이미지 lentivirus의 증가 금액으로 transduced. 이미지 72 시간 이후부터 도입입니다. </p293tn>

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</ol>

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이 바이러스성 포장 및 대상 세포 프로토콜의 도입은 SBI의 바이러스 포장 시약에서 사용하도록 최적화되었습니다. 다른 시약의 대체는 프로토콜의 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 lentiviral 생산을 위해 최적화되었으며, 바이러스 또는 pseudoviruses 다른 유형의 생산에 적합하지 않을 수 있습니다. 성공적인 바이러스성 포장은 몇 가지 주요 단계에 의존적일 수 밖에 없습니다. 293TN 세포는 세포 배양 뜨는로 lentiviral 입자의 분비 위해 절대적으로 필요한 SV40 큰 T 항원을 표현. 293TN 세포 transfection시 것인지를 밀도가 충분히 세포로 lentivector과 포장 plasmids를 전송 PureFection 시약 위해서 특히 중요합니다. 철저하게 접시를 소용돌이 치는 다음 드롭 현명한 방식으로 조직 배양 플레이트에 PureFection 혼합물을 추가하면 포장 plasmids의 분산을 위해 중요하다그리고 lentivector은 세포의 모든 전반에 걸쳐 구축. 적절하게 벡터를 배포하지 않으면 생산되고 부족한 lentiviral 입자가 발생할 수 있습니다. 바이러스성 포장 반응은 조직 배양 플레이트의 표면 면적을 기준으로, 높은 titer의 바이러스 생산을 위해 확장할 수 있습니다. 하나는 포장해야 구문 당 293TN 세포의 플레이트 여러 조직 문화 요리를 선택할 수 있습니다. 바이러스 supernatants의 농도가 높은 titer 바이러스를 만드는 데 특히 유용합니다. 세포의 여러 접시에서 바이러스성 뜨는가 결합하여 생체내 실험에서에 사용하기 위해 집중해야하거나 transduce하기 어려운 세포입니다. 생산 lentiviral 입자를 Titering하는 대상 세포의 형질 도입에 사용할 입니다만 정확한 계산을 위해 중요합니다. 특정 형질 도입에 사용되었다 그 전부다 아는 것은 형질 도입이 성공하지 못할 경우 문제 해결을 가능하게합니다. 예를 들어, 방어는 그것을 사용하는너무 낮은 구조 -의 - 관심 표현이 거의 표적 세포에서 발생할 수 있습니다. 입니다만 너무 높으 그 사용하지만, 스트레스의 징후를 보여 대상 세포에서 발생할 수 있습니다. 목표는 방어 세포의 건강을 유지하면서 구조 -의 - 관심의 표현을 극대화 그것을 사용하는 것입니다. 우리가 HT1080 세포에서 lentiviral 구조의 통합 사본을 측정 qPCR 기반 titering 프로토콜을 추천하는 동안, 다른 titering 접근 방식은 또한 p24 엘리사 또는 GFP 양성 세포 %의 추정으로 사용할 수 있습니다. 표적 세포의 성공적인 도입은 또한 몇 가지 주요 요인에 의존적일 수 밖에 없습니다. TransDux 높은 형질 도입 효율을 가능하게 독특한 감염 시약이지만, 그 세포에 독성이 없습니다. TransDux는 종종 대상 세포에 대한 독성 polybrene, 대신 사용할 수 있습니다. 대상 세포의 형질 도입에 TransDux의 포함은 바이러스 입자에 요금을 무력화하는 데 도움이되며 세포에 바이러스를 수의. TransDux는 세포에 독성이되지 않기 때문에, 하나는 따라서 확률을 증가 lentiviral 입자가 72시​​간 (바이러스 구조가 숙주 세포의 게놈에 통합했습니다되는 시간)에 대해 세포와 접촉에 남아있을 수 있습니다 바이러스성 입자는 세포를 입력. 어떤 어려운 - 투 - transduce 세포의 경우 transductions은 형질 도입 효율을 향상하기 위해 연속 날이 반복 수 있습니다. 예를 들어, 하루 1 세포를 transduce, 세포가 하루 2 쉴 수 있도록하고 일 3 일에 다시 세포를 transduce. 그것은 목표 세포의 초기 선택, 추가 실험하거나 특성화하기 전에 마지막으로 형질 도입 후 72 시간 기다려야하는 것이 중요합니다. 효율적인 바이러스성 포장은 5 &#39;와 3&#39;LTR 지역 사이에도 lentiviral 구조의 크기에 의존적일 수 밖에 없습니다. lentiviral 구조의이 섹션에서는 네이티브 에이즈 게놈의 크기에 해당하는 약 9킬로바이트 이하,이어야합니다. 9킬로바이트 5 월 드를 초과생산 pseudoviral 입자의 포복 절도 titer. 새로운 기술은 이러한 piggyBac transposon 벡터로, 최대 단일 transfection을 통해 1백킬로바이트에 transgenes의 안정적이고 안정적​​인 통합을 허용합니다. 이 접근법은 그것이 대상 세포를 transfect 수 있습니다 경우에 lentiviral 벡터의 크기 제한을 초과 구조에 사용, 그리고 바이러스성 포장 단계 9,10을 필요로하지의 추가 이점을 제공받을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 제작 pseudoviral 입자들은 대부분의 포유 동물 세포 유형을 감염시킬 수에 전염성이있다. 이 프로토콜에서 사용되는 제품은, 그러나 그들이 아닌 replicative 및 자체 운영을 중지시키지 pseudoviruses를 만들어 그에서 3 세대 biosafe입니다. 그러므로, 일단 표적 세포 또는 동물 전염성 또는 전염성이없는 표적 세포 또는 동물에 transduced. biosafety에서 권장하지 않지만 타사 세대 biosafe 아닌 다른 lentivector plasmids의 대체 가능관점. 바이러스 생산 프로토콜과 대상 세포의 후속 형질 도입은 NIH 가이드라인 11에 의하면, Biosafety 레벨 2 아래 진행되어야하고, 바이러스 입자를 다룰 때 연구자는 항상 실험 복과 장갑을 착용해야합니다. 사용 293TN 생산 세포는 바이러스성 입자, 그리고 일회용 pipettes의 튜브는 적절한 보호복 용기에 폐기되어야한다. 재사용 가능한 pipettes 및 유리 제품은 표백제로 소독하고 직원의 노출을 줄일 autoclaving해야합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM 높은 포도당 중간 </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN 셀 </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> HIV 기반 lentivectors위한 </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> FIV 기반 lentivectors위한 </td></tr><tr><td> 모든 Lentiviral 벡터 </td><td> SBI </td><td> 여러 </td><td> cDNA, shRNA, microRNA, 전사 기자 </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-그 </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> 글로벌 UltraRapid Titering 키트 </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> 이 프로토콜에 설명되어 있지만, 바이러스 입자를 titer가 필요하지 </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

포장 hiv 또는 fiv 기반 lentivector 식 구조 및 vsv-g pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

표준 플라스미드 벡터와 마찬가지로 그것은 effectors의 일시적인 표현을 얻기 위해 로우 - 투 - 매체 효율과 세포에 플라스미드 형태 lentivectors을 transfect 수 있습니다. pseudoviral 입자로 포장 lentiviral 표현 구조 그러나, 심지어는 같은 주, 줄기, 그리고 차별화된 세포와 같은 어려운 - 투 - transfect 세포로, 1​​00 %의 형질 도입까지 가능합니다. 또한, lentiviral 배달 일반적으로 transfection 시약 1, 2의 독성으로 인한 세포 사망과 같은 화학 transfections와 관련된 특정 세포 반응을 생산하지 않습니다. 대상 세포에 transduced 때, lentiviral 구조는 게놈 DNA에 통합하고 작은 머리핀 RNA (shRNA), cDNA, microRNA 또는 리포터 유전자 3, 4의 안정적인 표현을 제공합니다. 안정적으로 이펙터 분자를 표현 대상 세포 발현 벡터 등 puromycin 또는 GFP로서 구성에 포함된 선택 가능한 마커를 사용하여 격리 수 있습니다. 이후 PS바이러스 구조 유전자 부재이며 긴 터미널 반복합니다 (LTRs) 도입 5, 6에 따라 자체 운영을 중지시키지되도록 설계되기 때문에 eudoviral 입자가 대상 세포를 감염, 그들은 표적 세포 내에서 복제할 수 없습니다. 효율적인 lentiviral 포장 1, 5, 6, 7을 위해 필요한 세 가지 주요 구성 요소가 있습니다. <ol><li> 포장에 필요한 유전 요소의 일부를 포함 lentiviral 발현 벡터는 바이러스 표현의 안정적인 통합 게놈의 DNA로 구성하고, 효과기 또는 기자의 표현. </li><li> 표현의 RNA 사본의 해독과 포장을 위해 필수적인 단백질을 제공 lentiviral 포장 plasmids은 재조합 pseudoviral 입자로 구성. 이 프로토콜은 바이러스 코트 단백질에 대한 HIV 또는 FIV 게놈과 기공을 갖는 구염 바이러스 g 단백질 (VSV-G)에서 pPACK 개그를 위해 인코딩 plasmids (SBI), POL, 그리고 레브를 사용합니다. </li><li> 293TN은 생산<html> 높은 titer lentiviral 제작 및 유지 보수를위한 세포를 reselecting에 유용 네오 마이신 저항 유전자, 필요 SV40 큰 T 항원을 표현하는 R 세포 (HEK293 세포에서 파생). </li></ol> 바이러스 생산 프로토콜의 개요는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 바이러스성 생산 lentiviral 발현 벡터 및 포장 plasmids와 공동 transfecting 293TN 생산 세포에 의해 시작됩니다. 바이러스성 입자가 미디어로 분비됩니다. 48-72시간 후 세포 배양 매체가 수확됩니다. 세포 파편은 세포 배양 매체에서 삭제되고, 바이러스 입자 농도를위한 PEG-그걸로 원심 분리에 의해 시켰던 있습니다. 제작 lentiviral 입자 그런 다음 titered되고 대상 세포를 transduce하는 데 사용할 수 있습니다. 바이러스 titering의 세부 사항은이 규정에 포함되지 않지만에서 찾을 수 있습니다 : ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. 이 프로토콜은 표시된 특정 제품을 사용하여 최적화되었습니다. 기타 시약은 대체 수 있지만 동일한 결과를 보장할 수 없습니다.

Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

표준 플라스미드 벡터와 마찬가지로, 플라스미드 형태의 렌티벡터를 세포에 도입하면 낮거나 중간 정도의 효율로 일시적인...을 얻을 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 렌티바이러스 패키징에 대해 배우는 것입니다. 이는 5일 과정의 프로토콜입니다. 첫째 날에는 293TN 생산 세포를 계산된 밀도로 플레이팅합니다.둘째 날에, 관심 유전자가 포함된 선택한 렌티 벡터 컨스트럭트와 바이러스 패키징 플라스미드 믹스를 세포에 트랜스펙션합니다. 넷째 날에, PEG 바이러스 침전 용액을 첨가하여 바이러스 상청액을 수확하고 농축합니다. 이 절차의 마지막 단계는 PEG로 농축된 바이러스를 수확하고, 바이러스를 분주하며, 농축된 바이러스로 세포를 감염시켜 바이러스 타이터를 측정하는 것입니다.최종적으로, 안정적으로 삽입된 유전자의 정량적 PCR을 통해 안정적으로 삽입된 컨스트럭트의 수를 계산합니다. 플라스미드 형질전환이나 레트로바이러스 도입과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, FBI의 최적화된 렌티바이러스 패키징 프로토콜이 고역가의 기능적 활성 바이러스를 생성한다는 점이며, 이를 통해 줄기세포나 비분열 일차 세포와 같이 형질전환이 어려운 세포를 포함하여 거의 모든 포유류 세포에 효율적인 전달이 가능합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 고역가 바이러스의 성공적인 생산에 필수적인 세부 프로토콜 사항들에 익숙하지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다.형질전환 중에 현미경으로 관찰되는 세포 밀도는 바이러스 패키징 효율을 결정하며, 이는 최종 바이러스 역가(titer)를 결정하므로 이 방법의 시각적 시연이 유용합니다. 해당되는 경우, 형광 리포터 발현을 통해 형질전환 효율을 결정할 수 있으며, 이는 최종 바이러스 역가에 상당한 영향을 미칩니다. 또한, 이 방법의 시각적 시연은 연구자가 전 과정 동안 무균 상태를 유지하기 위한 최선의 방법이나 수확한 바이러스에 세포 파편이 포함되지 않도록 하는 방법과 같이, 미묘하지만 중요한 프로토콜 단계를 익히는 데 도움이 됩니다.효율적인 렌티바이러스 패키징은 세 가지 구성 요소에 의존합니다. 첫째, 렌티바이러스 발현 벡터는 관심 유전자의 발현을 위한 요소뿐만 아니라 바이러스 패키징과 안정적인 통합에 필요한 일부 요소를 포함해야 합니다. 여기에는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 마이크로 RNA 또는 리포터 카세트가 포함됩니다.둘째, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 발현 컨스트럭트의 RNA 복제본을 재조합 유사 바이러스 입자로 패키징하고, 감염 후 역전사 및 바이러스 통합에 필수적인 단백질을 제공해야 합니다. 셋째, 2 9 3 TN 생산 세포에 발현 벡터와 패키징 벡터를 일시적으로 공동 형질전환시켜야 합니다. 이 세포들은 배양 배지에서 수확 가능한 고역가의 유사 바이러스 입자를 생성합니다.결국, 표적 세포의 성공적인 형질전환은 주로 주어진 세포 유형당 바이러스 입자 수에 의해 결정됩니다. 즉, 감염다중도(multiplicity of infection)가 중요합니다. 먼저 293 TN 세포를 15 centimeter 세포 배양 플레이트에서 18~24시간 동안 배양하여 60~80%의 합쳐짐(confluency)을 얻습니다.형질전환 시점에 각 플레이트는 바이러스 수율을 높이기 위해 약 14 million cells를 생성하게 됩니다. 다음 날 293 TN 세포가 60에서 80% 정도로 합쳐졌을(confluent) 때 형질전환 준비가 완료되며, 이때 하나 이상의 플레이트를 사용할 수 있습니다. 세포가 담긴 각 플레이트당 1.6 milliliters의 무혈청 DMEM을 15 milliliter falcon tube에 넣으십시오.그 다음 22.5 µg의 ppac H one 또는 Ppac F1과 4.5 µg의 lenti vector Construct를 DMEM에 첨가하고 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 동일한 튜브에 55 µL의 pure affection을 넣고 10초 동안 볼텍싱한 후, 상온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 각 배양 플레이트에 한 튜브씩 첨가합니다.용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후 플레이트를 가볍게 흔들어 섞고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 세포를 배양합니다. 48시간 후, 렌티벡터 컨스트럭트가 GFP와 같은 형광 유전자를 발현하는 경우 현미경으로 세포를 확인하십시오. 형질전환이 성공적이라면 50%에서 90% 이상의 세포가 녹색 형광을 띱니다. 이제 세포 배양 상층액을 50 mL 원심 분리관에 수집하십시오. 이 상층액에는 감염성 유사 바이러스 입자가 포함되어 있습니다.플레이트에서 떨어져 나온 세포는 바이러스 생산에 부정적인 영향을 미치지 않습니다. 부유물을 제거하기 위해 바이러스 상층액을 상온에서 1500 G로 15분 동안 원심분리합니다. 그 다음 펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 바이러스 상층액을 수집하되, 상층액 약 500 µL 정도의 여유분을 남겨두고, 트랜스펙션 72시간 후에 바이러스 입자를 농축하는 다음 단계로 진행합니다.바이러스 상태(viral sate)를 수집한 후, 동일한 기술을 사용하여 바이러스 상층액을 선택적으로 2차 수집할 수 있습니다. 50 milliliter 폴리프로필렌 원심분리관에 상층액 4부피당 얼음처럼 차가운 peg 바이러스 침전 용액 1부피를 첨가하여 농축합니다. 용액을 뒤집어 섞어줍니다.절대로 볼텍스(vortex)를 사용하지 말고, 용액을 흔들지 않은 상태로 4 °C에서 최대 96시간 동안 보관하십시오. 최소 12시간 동안 냉장 보관한 후, 혼합물을 4 °C에서 1500 G로 30분 동안 원심분리하십시오. 원심분리가 끝나면, peggo로 침전된 렌티바이러스 입자가 튜브 바닥에 베이지색 또는 흰색 펠렛(pellet) 형태로 나타납니다.이제 펠렛에 침전된 렌티바이러스 입자가 흐트러지지 않도록 주의하여 흡입함으로써 모든 액체 흔적을 제거합니다. 또는 상층액의 대부분을 제거하고 남은 상층액에 펠렛을 재부유시킵니다. 그 다음, 현탁액을 멸균된 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고 저온 원심분리기를 사용하여 2분 동안 원심분리합니다.14,000 RPM에서 원심분리한 후 남은 상층액을 피펫으로 제거하고, 렌티바이러스 입자 펠렛을 원래 부피의 1/10에서 1/100 수준의 얼음처럼 차가운 멸균 버퍼에 재현탁합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 피펫으로 펠렛을 용액에 옮기고, 항상 차갑게 유지하십시오. 펠렛이 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오.마지막으로, 멸균된 냉동 보관 튜브에 15 내지 25 µL씩 분주하여 얼음 위에 두고, 튜브를 -70 °C에서 보관하십시오. 패키징 과정이 성공적이면 밀리리터당 10 million 내지 1000 million IFU가 생성되며, 이를 24-well 배양 플레이트에 well당 50,000 cells의 밀도로 분주하고 지정된 배양 조건에서 하룻밤 동안 배양하여 바이러스 형질전환을 수행합니다. 역가 측정 목적의 형질전환을 위해서는 세포의 합쳐짐 정도(confluency)가 50 내지 70% 사이여야 합니다.HT 10 80 세포는 형질전환이 쉬운 대조군 세포주로 사용할 수 있습니다. 다음 날 세포에서 배지를 흡입하여 제거하십시오. 그런 다음 배양액과 농축된 duck 용액을 혼합합니다. 이때 trans duck의 최종 농도가 1x가 되도록 합니다. 표적 세포의 밀도가 50~70% 합류율(confluency)인 각 웰에 형질전환된 액체 0.5 mL를 첨가하십시오. 각 웰에 바이러스를 1:100, 1:10, 그리고 1:1 원액 희석 비율로 첨가하십시오.배지를 교체하지 않고도 바이러스를 표적 세포와 최대 72시간 동안 접촉 상태로 유지할 수 있습니다. 72시간 후에는 프로바이러스가 숙주 게놈에 안정적으로 통합되어 목적 유전자를 발현하게 됩니다. 형광 마커 발현이 존재하는 경우 이를 통해 다양한 바이러스 희석 배율에 따른 형질도입 효율을 추정할 수 있으며, QPCR을 통해 감염성 단위 수를 정량화할 수 있습니다.바이러스 역가를 확인한 후, 다른 표적 세포에 대해 원하는 감염 다중도(multiplicity of infection)를 달성하기 위한 적절한 바이러스 부피를 계산하십시오. 역가를 측정하고 MOI를 조절함으로써 실험 간 및 서로 다른 바이러스 조제물 간의 일관성을 보장할 수 있습니다. 이제 바이러스를 추가 실험에 사용할 준비가 되었습니다.형질전환 당일 성공적인 바이러스 패키징을 위해서는 2 9 3 TN 세포의 초기 밀도가 매우 중요했습니다. 이 2 9 3 TN 세포의 합류도는 60에서 80% 사이였습니다. GFP를 발현하는 렌티 벡터로 형질전환을 성공적으로 수행한 지 24시간 후에, 2 9 3 TN 세포의 최소 90% 이상에서 녹색 형광이 나타남을 확인했습니다.형질도입 72시간 후에도 HT 10 80 숙주 세포에서 GFP가 계속 발현되었습니다. 이는 렌티바이러스 컨스트럭트가 숙주 게놈에 안정적으로 통합되었음을 나타냅니다. 동일한 숙주 세포를 10배 희석하여 형질도입했을 때 GFP 발현이 비례적으로 감소했습니다. 이는 바이러스 역가와 렌티바이러스 매개 유전자 발현 사이의 관계가 정비례하기 때문입니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 하루 약 1~2시간씩 5일에 걸쳐 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 기능적으로 감염성이 있는 바이러스 입자를 효율적이고 안전하게 패키징하고, 바이러스로 세포를 성공적으로 형질도입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 렌티바이러스를 다루는 것은 위험할 수 있으므로, BSL 2 등급의 조직 배양 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 잊지 마십시오.본 절차를 수행하는 동안에는 항상 실험복과 장갑을 착용해야 합니다.

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Lentivirus 제작

우리는 태트 - 응답성 LTR 이외에, 가지고 lentiviral 벡터를 개발, HIV - 1 태트 및 레브 종속적인 방식으로 기자의 유전자 발현을 조절 할 수 레브 - 반응 요소 (RRE). 벡터는 GFP의 표현을 통해 살아있는 세포에서 HIV 복제의 구체적인 검색을 허용합니다.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

Lentiviruses는 유전자 기능을 탐험을위한 가치있는 연구 도구되지만, 연구진은 알려진 pantropic lentivirus 인코딩이나 의심 oncogenes의 생산을 방지하실 수 있습니다. 대안으로, 우리는 ecotropic 수용체 mSlc7a1을 표현하는 수정된 인간의 세포에 ecotropic lentivirus의 사용을 위해 안전한 프로토콜을 제시한다.

향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될...

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

학습하세요 렌티바이러스 포장 프로토콜을 통해 포유류 세포에 효율적인 유전자 전달을 수행하는 방법을. 293TN 생산 세포를 이용한 고역가 바이러스 입자 제조 기술을 익혀 안정적인 유전자 발현을 실현하세요.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

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