포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

이 절차의 전반적인 목표는 렌티바이러스 포장에 대해 알아보는 것입니다. 5일 프로토콜. 첫째 날인 2 9 3에서 TN 생산자 셀은 계산된 밀도로 도금됩니다.

둘째 날에는 관심 유전자와 바이러스 패키징 플라스미드 혼합물을 포함하는 선택된 렌티 벡터 구조체로 세포를 transfection합니다. 4일차에는 PEG 바이러스 침전 용액을 첨가하여 바이러스 세이트를 수확하고 농축합니다. 절차의 마지막 단계는 PEG 농축 바이러스를 수확하고, 바이러스를 분취하고, 농축된 바이러스로 세포를 감염시켜 바이러스 적정을 하는 것입니다.

궁극적으로, 안정적으로 통합된 유전자의 정량적 PCR은 안정적인 통합 구조체의 수를 계산하는 데 사용됩니다. 혈장 형질주입 또는 레트로바이러스 형질주입과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 FBI의 최적화된 렌티바이러스 패키징 프로토콜이 고역가 기능 활성 바이러스를 생성하여 줄기세포 및 비분열 일차 세포와 같이 형질주입이 어려운 세포를 포함하여 거의 모든 포유류 세포로 효율적으로 전달할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 고역가 바이러스의 성공적인 생산에 필수적인 작은 프로토콜 세부 사항에 익숙하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 transfection 중 현미경을 통해 시각화된 세포 밀도가 최종 바이러스 역가를 결정하는 바이러스 패키징의 효율성을 결정하기 때문에 유용합니다. 적용 가능한 형광 리포터 발현이 transfection의 효율성을 결정하는 경우, 이는 최종 바이러스 titer에 상당한 영향을 미칩니다. 또한 이 방법을 시각적으로 시연하면 연구자가 전체 프로세스 동안 무균 상태를 유지하기 위한 모범 사례, 수확된 바이러스에 세포 파편이 포함되지 않도록 하는 방법 등 프로토콜의 미묘하지만 중요한 부분에 익숙해지는 데 도움이 됩니다.

효율적인 렌티바이러스 포장은 세 가지 구성 요소에 의존합니다. 첫째, 렌티바이러스 발현 벡터에는 바이러스 패키징 및 안정적인 통합에 필요한 일부 요소와 관심 유전자의 발현을 위한 요소가 포함되어야 합니다. 짧은 헤어핀, RNA, 마이크로 RNA 또는 리포터 카세트.

둘째, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 발현 구조체의 RNA 사본을 재조합 유사 바이러스 입자로 패키징하고 감염 시 후속 역전사 및 바이러스 통합에 필수적인 단백질을 제공해야 합니다. 셋째, 2 9 3 TN 생산자 세포는 발현 및 패키징 벡터와 함께 일시적으로 cot transection되어야 합니다. 이 세포는 배양 배지에서 수확할 고역가 유사 바이러스 입자를 생성합니다.

궁극적으로 표적 세포의 성공적인 형질도입은 대부분 주어진 세포 유형에 대한 세포당 바이러스 입자의 수에 달려 있습니다. 즉, 감염의 다양성은 2 9 3 TN 세포가 성장하면서 시작됩니다. 15cm 세포 배양 플레이트에서 18-24 시간 동안 60-80 % co의 유창성을 얻습니다.

transfection시 각 플레이트는 약 1,400 만 개의 세포를 생성하여 바이러스 수율을 증가시킵니다. 다음 날 2 9 3 TN 세포가 60-80% 융합되어 transfection이 준비되면 하나 이상의 플레이트를 사용할 수 있습니다. 각 세포 플레이트에 대해 15ml 팔콘 튜브에 1.6ml의 무혈청 DMEM을 추가합니다.

그런 다음 22.5마이크로그램의 ppac H one 또는 Ppac F1과 4.5마이크로그램의 렌티 벡터 Construct를 DMEM에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 55마이크로리터의 순수한 애정을 동일한 튜브에 넣고 10초 동안 소용돌이친 다음 15분 동안 실내 온도 배양합니다. 15분 후 각 배양 플레이트에 튜브 하나를 추가합니다.

그런 다음 플레이트를 부드럽게 소용돌이친 다음 48시간 후에 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 배양합니다. 렌티 벡터 구조체가 GFP와 같은 형광 유전자를 발현하는 경우, 현미경으로 세포를 확인하면 성공적인 transfection을 통해 50%에서 90% 이상의 녹색 형광 세포가 생성되며, 이제 세포 배양 상층액을 50ml 원추형 튜브에 수집합니다. 상등액에는 감염성 유사 바이러스 입자가 포함되어 있습니다.

플레이트에서 떼어낸 세포는 바이러스 생성에 부정적인 영향을 미치지 않습니다. 파편 원심 분리기를 제거하기 위해 바이러스 상등액을 1500G에서 실온에서 15 분 동안 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 약 500마이크로리터의 상층액 완충액을 남기도록 바이러스 상층액을 수집하고 형질주입 후 72시간 후에 바이러스 입자를 농축하는 다음 단계로 진행합니다.

바이러스 상층(supernat)의 선택적인 두 번째 채취는 바이러스 사테(viral sate)가 채취된 후 동일한 기술을 사용하여 수행될 수 있습니다. 50 밀리리터 폴리프로필렌 원심분리기 튜브에 4부피의 상등액마다 1부피의 얼음 콜드 페그 바이러스 침전 용액을 첨가하여 농축합니다. 용액을 뒤집어 혼합합니다.

와류를 사용하지 말고 최대 96시간 동안 섭씨 4도에서 교반 없이 용액을 보관하십시오. 최소 12시간의 냉장 후 혼합물을 섭씨 4도에서 30분 동안 1500G에서 원심분리합니다. 원심분리 후, 페그고 침전된 렌티바이러스 입자는 튜브 바닥에 베이지색 또는 흰색 펠릿으로 나타납니다.

이제, 펠릿에 침전된 렌티바이러스 입자를 방해하지 않고 신중한 흡인으로 유체의 모든 흔적을 제거하십시오. 또는 대부분의 supra natin을 제거하고 펠릿을 남아 있는 supinate에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 현탁액을 멸균 2ml einor 튜브로 옮기고 차가운 마이크로 퓨지에서 튜브를 2분 동안 원심분리합니다.

14에서 000 RPM은 잔류 상층액을 피펫으로 제거하고 렌티바이러스 입자 펠릿을 10분의 1에서 100분의 1로 얼음, 차갑고 멸균된 완충액에 재현탁합니다. 원래 부피는 기포를 생성하지 않고 펠릿을 용액에 조심스럽게 피펫으로 넣어 항상 차갑게 유지합니다. 펠릿이 완전히 다시 부유되었는지 확인하십시오.

마지막으로, 15-25 마이크로 리터의 부분 표본 잉크를 만들고 얼음 위에 멸균 극저온 바이알을 만들고 바이알을 섭씨 영하 70도에서 보관합니다. 성공적인 패키징 실행은 24웰 배양 플레이트 플레이트에서 바이러스 전달을 위한 밀리리터당 1,000만에서 1,000,000개의 IFU를 산출하고, 웰당 50,000개의 세포를 산출하고 지정된 배양 조건에서 하룻밤 동안 성장시킬 수 있습니다. 세포는 적정 목적의 형질도입을 위해 50-70% 사이의 융합 사이여야 합니다.

HT 10 80 세포는 다음날 세포에서 배지를 흡인하여 형질도입이 용이한 대조 세포주로 사용할 수 있습니다. 그런 다음 배양 배지를 농축 된 오리 용액과 결합하십시오. 따라서 트랜스 덕의 최종 농도는 1 x이며, 50-70%의 정확한 밀도로 표적 세포가 있는 각 웰에 형질도입된 1/2 밀리리터를 첨가하고, 다음 희석액에서 각 웰에 바이러스를 첨가하고, 1에서 100, 1에서 10, 그리고 직선 일대일 희석입니다.

바이러스는 배지를 변경하지 않고 최대 72시간 동안 표적 세포와 접촉을 유지할 수 있습니다. 72시간이 지나면 프로바이러스는 숙주 게놈에 안정적으로 통합되어 관심 유전자를 발현합니다. 존재하는 형광 마커 발현을 사용하여 다양한 바이러스 희석에 따른 transduction efficiency를 추정할 수 있는 경우 QPCR로 감염 단위의 수를 정량화할 수 있습니다.

바이러스 역가가 알려지면 다른 표적 세포에 대한 원하는 감염 다중도를 달성하기 위해 적절한 바이러스 부피를 계산합니다. 역가를 측정하고 MOI를 제어하면 실험과 다양한 바이러스 전처리 간의 일관성이 보장됩니다. 이제 이 바이러스는 추가 실험에 사용할 준비가 되었습니다.

2 9 3 TN 세포의 시작 밀도는 transfection 당일에 성공적인 바이러스 패키징에 중요했습니다. 이 2 9 3 TN 세포는 60%에서 80% 사이의 융합도였습니다. GFP를 발현하는 렌티 벡터로 성공적으로 transfection한 후 2,9,3 TN 세포의 90% 이상이 녹색 형광을 보인 것으로 밝혀졌습니다.

형질도입 후 72시간 동안 GFP는 HT 10 80 숙주 세포에서 계속 발현되었습니다. 이것은 10배 희석에 동일한 숙주 세포를 transducing 숙주 게놈으로 안정적으로 통합된 lentiviral 구조물이 비례적으로 GFP의 발현을 감소시켰다는 것을 나타냅니다. 바이러스 역가와 렌티바이러스 매개 유전자 발현 사이의 관계는 정비례하기 때문입니다.

일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 하루에 약 1-2시간씩 5일 동안 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기능적으로 감염성 바이러스 입자를 효율적이고 안전하게 성공적으로 바이러스로 형질주입된 세포를 포장하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 렌티바이러스로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 BSL 2 조직 배양 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 장갑을 착용해야 합니다.