Name: 아버지의 응답의 신경 생물학을 맡은 이후로 비교 종의 접근법을 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 아버지 행동의 신경생물학을 비교종 접근법으로 연구하는 방법을 Peromyscus 속 설치류를 사용하여 행동 및 바소프레신 면역반응성을 분석하고 뇌 영역의 신경화학적 상관관계를 규명합니다.

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이 연구는 부여 노에 의해 투자되었다. 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 0,723,341 (KGL로). 우리는 또한 Schapiro 학부 연구 장학생 프로그램과 랜돌프 - 메이컨 대학에서 심리학과에서 제공하는 기부에 대해 감사하고 있습니다. 마지막으로, 우리는이 비디오 기사에 대한 R - MC 연구소를 준비하는이 연구와 아만다 Rzucidlo의 도움에 크랙 Kinsley의 공동 참여에 감사드립니다.

1. 동물 모델의 식별 <ol><li> 캘리포니아 사슴 마우스 (Peromyscus 포니)는 아버지의 반응을 탐험하는 이상적인 모델입니다. 당신이보다시피,이 마우스는 어머니와 마찬가지로 새끼를 grooms - 그들은 그럼에도 불구하고 새끼가 간호하는 것 같은데 그런 그들 위에 몸을 구부 리다. 캘리포니아 생쥐의 행동은 같은 속, 자주 탈출하거나 그들을 공격하려고, 새끼에 약간의 흥미를 전시하고 일반적인 사슴 마우스 (Peromyscus maniculatus)의 종 비교합니다. (새끼와 상호 작용이 수종의 사진을 그림 1을 참조하십시오.) </li><li> 종의 모델이 확인되면 다음의 여러 그룹이 설립해야합니다. 본 연구에서는 생물 학적 아버지, 아니 육아 경험 처녀, 그리고 두 종류의 제한 강아지 노출 (강아지 - 노출 또는 수양 아버지)와 처녀는 predisposed과 인수 모두 아버지의 특성 평가 수 있도록하는 데 사용됩니다. 이 특정 연구에서 우리는 또한 사회적 상호 작용은 새장에 배치하는 거 강아지가 아닌 대표적인 반응에 맞는다고 확신하는 강아지 장난감 마우스에 대한 모든 그룹을 노출 (그림 2 참조). </li><li> 신경 생물학 요인을 조사하기 전에, 그것은 선택된 종의 관심의 행동에 명확한 차이를 전시 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 본 연구에서는, 남성은 접촉 보낸 시간의 강아지와 금액을 접근하기 위해 지연과 같은 점수 행동하는 데 사용되는 5 분 아버지의 행동 ethogram (ethogram의 예를 들어, 표 1 참조) 강아지와 케이지에 넣습니다 강아지. 공격적인 반응을 관찰하는 경우 강아지는 즉시 제거됩니다. 주의 행동 분석 후 실시 수 있도록 이러한 세션은 주로 촬영하고 있습니다. </li></ol> 2. 뇌 조직을 준비 <ol><li> 각 마우스의 표준 재관류 (프로토콜 첨부) 다음, 두뇌들은 관심의 특정 영역 (표시 뇌)에서 sectioned 수 있도록 제거됩니다. </li><li> 바소 프레신 (AVP) - 표준 마우스 뇌 아틀라스 (아틀라스 쇼)는 시상 하부에있는 paraventricular 핵, 본 연구에 대한 관심의 neuropeptide를 생산 세포에 풍부한 것으로 알려진 지역을 찾습니다하는 데 사용됩니다. </li><li> 조직이 마이크로톰와 sectioned되기 전에 동결 수 있도록 두뇌는 다음 차단 및 냉동 척에 장착됩니다. 구체적인 랜드마크가 다음 특정 뇌 두께,이 경우 30 마이크론은 분석에 사용되는 뇌 부분에 대한 설정, 확인되기 전까지는 두뇌 트림 모드에서 sectioned 있습니다. </li><li> 뇌 부분은 신중하게 인산 버퍼 식염수 (PBS)으로 가득 잘 접시에 배치됩니다, (첨부 PBS에 대한 프로토콜,이 표준 immunocytochemistry 프로토콜의 한 예입니다 것에주의하십시오.) </li></ol> 3. Immunocytochemistry <ol><li> 이 프로세스의 여러 단계에 걸쳐 (첨부 프로토콜을 참조), 그것은이 기법 (쇼 학생 pipetting)에 대한 화학 물질과 중요한 다른 재료의 정확한 측정을 보장하기 위해 정확한 pipetting 능력을 가지고하는 것이 중요합니다. </li><li> 이 과정의 첫 번째 단계는 잘 접시 3-5 번의 PBS를 교체 포함 두뇌를 세척되며 각 세척 사이에 잘​​ 플레이트는 10 분 로커에 표시됩니다 (학생 PBS를 교체하고 배기 락커에 잘 번호판을 배치 표시) . </li><li> 뇌 조각은 다음 주 항체 솔루션에 노출 4 로커 (쇼 프로세스)에서 ° C 하룻밤에 저장됩니다. </li><li> 다른 세척 다음, 뇌 조각은 다시 씻어, 상온에서 로커 한 시간 동안 차 항체에 노출됩니다. </li><li> 다음 두뇌는 neurochemical 양성 세포의 시각화를위한 준비 Avitin - 비오틴 복합 솔루션에 노출되어 있습니다. </li><li> 최종 시각화 단계에 대한, 두뇌는 DAB에 노출되어 있습니다. 이것은 위험한 제품으로 항상주의해서 취급해야합니다. 여기서 볼 수 있듯이, 뇌 조각이 (프로세스를 표시) 눈 앞에 어두운 얻을 시작합니다. </li><li> DAB 노출 다음, 두뇌는 세척의 마지막 시리즈 통과 후 조심스럽게 subbed 현미경 슬라이드에 배치하고 (슬라이드 뇌 슬라이스의 위치를​​ 보여, subbed 슬라이드 프로토콜에 대한 첨부 파일을 참조) 하룻밤 건조 사용할 수 있습니다. </li><li> 슬라이드는 다음 증류수와 알코올 세척 일련의 플랫폼에 착륙 마지막으로 안전하게 (이 과정의 다양한 측면을 보여, 삭제 과정에 대한 첨부 파일을 참조) slidebox에 coverslipped 및 저장되기 전에 Citrosolv에 빠져들되고. </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> 슬라이드 말린 후에, 그들은 전문 neuroquantification 소프트웨어 평가하실 수 있습니다. 여기 Bioquant 소프트웨어 (화면에 소프트웨어 ... 그리고 현미경을 표시)을 마우스 두뇌의 paraventricular 핵에있는 바소 프레신 양성 세포와 섬유를 계량하는 데 사용됩니다. </li><li> 관심의 특정 영역은 측정 옵션을 사용하여 식별됩니다소프트웨어의 neuroquantification에 대한 시각적인 필드를 설정합니다. 일관된 시각 필드 크기 (쇼 학생이 이런 일을) 각 동물 계량는 것이 중요합니다. </li><li> 여기 어둡게 스테인드 바소 프레신 - immunoreactive 세포 기관 및 섬유 분명 있습니다. 그것이 조직을 계산하거나 추적하기 어려운이기 때문에,이 소프트웨어의 특징은 관심의 지정된 영역 내에 적극적으로 스테인드 조직의 총 금액을 결정하는 조명 thresholding을 사용합니다. 이 thresholding는 바소 프레신 - 긍정적인 조직을 (컴퓨터 화면에 데이터 값을 표시) 포함된 얼마나 지정된 지역의 우리에게 알려줍니다. </li></ol> 5. 행동 분석 <ol><li> 하나 이상의 관찰자가 비디오 테이프를 채점되는 경우 그것은 관찰자가 일관성있는 방식으로 동작을 채점하는 보장에 간 제일 급의 신뢰성을 확립하는 것이 중요합니다. 실제 점수 세션에 대한, 행동 점수 시트 (스프레드 시트를 채점의 예를 들어, 표 2 참조) 관찰 세션 동안 행동을 쉽게 점수 있도록 준비되어야합니다. </li><li> 빠른 에피소드 응답되지 않은 동작을 위해, microsequencing 분석은 특정 반응의 진행에 대해 미묘을 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 문제를 정리하는 것은 매우 빠른 반응의 사슬로 구성되어 있습니다. 한 개의 옵션을 간단하게 정리의 존재와 시간을 기록하지만, 또 다른이 응답과 함께 사건의 사슬을 문서화하는 것입니다. 이 microsequencing 소프트웨어를 사용하여 관측은 소프트웨어 (쇼 소프트웨어와 비디오)하라는 메시지가 특정 행동을 매 순간의 존재를 점수. </li><li> 데이터 수집에 따라 관심의 매개 변수가 결정되고 적절한 행동 점수는 분석입니다. 예 정리 순서 중단 (각 동물에 대한 입력 데이터를 스프레드 시트와 컴퓨터를 표시)의 강아지, 또는 번호와 접촉 보낸 시간의 총 기간 수 있습니다. </li><li> 문제가 채점되면 그것은 두 종의 연구에 대한 관심의 행동에 대해 서로 다른 응답 전략을 전시를 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우에는 캘리포니아 사슴 마우스는 일반적인 사슴 마우스보다 아버지의 행동을 전시한다. 또한, 다양한 행동 조치와 관련된 영향에 더 정보를 볼 수를 얻을 두뇌 조치와 상관하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : <ol><li> 모델을 확인하려면 데이터가 명확하게 두 종류가 관심의 행동에 관해서는 다르게 수행되었음을 나타냅니다한다. 여기 표시되는 P. 포니의 수컷은 새끼, 아버지의 반응 두 가지 특징 (그림 4 참조)를 통해 정리하고 웅크리고 더 많은 시간을 보냈다. </li><li> 볼 수 있듯이, 아버지의 P.; 관심 neurobiologial 변수는, 아버지의 반응에 중요 바소 프레신의 양은 (AVP) - 긍정적인 조직이 여러 관련 뇌 영역에 대한 계량되었습니다 있는지 확인하기 위해 포니 동물이 뇌 영역의 여러 더 많은 면역 - 긍정적인 조직을했다. (그림 5 참조). </li><li> microsequencing 분석을 사용하여 관련 연구에서, 그것은 아버지의 캘리포니아 마우스가 처녀의 대응보다 적은 불안감을 전시 것이 가상했다, 따라서, 육식 동물의 냄새에 노출 때, 아버지는 (그림 참조 처녀 동물보다 정리 순서에 따라 적게 방해 전시 6). </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : (A) conspecific 외국인 강아지 향한 아버지의 답변을 전시 남 캘리포니아 마우스. (B) 남자 사슴 마우스는 신중한 접근 (스트레치 참석)와 강아지 conspecific 외계인의 존재에 회피 응답을 전시. 참고 : 남자가 강아지 향해 적극적인 답변을 전시하는 경우 이러한 사회적 상호 작용 평가에서, 경험이 바로 남성주의를 분산하기 위해 케이지의 상단을 누르십시오. 이때 세션이 종료되고 강아지가 제거됩니다, 모든 상처에 대한 검사 및 어머니로 돌아왔습니다. 저희 연구실에서는, 이것은 거의 P. 함께 관찰되지 않습니다 포니의 남성이지만은 종종 P.과 관찰 maniculatus, 가까이 관찰과 즉각적인 개입을하지만, 동물 발생 피해를 방지. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 장난감 마우스 상호 작용 캘리포니아 마우스, 대부분의 이러한 자극에 씹어 했어요. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 연구의 실험 설계, 각 그룹에 약 6 동물은 각 종족에 대한있었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : immunocytochemistry 프로세스의 그래픽. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 무화과ure 5 캘리포니아과 사슴 마우스의 아버지의 반응;. 자세한 아버지의 반응은 (신랑, 몸을 구부 리다, 빠른 접근) 캘리포니아 마우스에서 관찰되었다. 더 신축성 참석 (스트레스 응답)은 사슴 마우스에서 관찰되었다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 두 종류의 다양한 뇌 영역에서 바소 프레신의 immunoreactivity. 캘리포니아 마우스는 PVN 세포와 섬유에 더 많은 얼룩을했다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7 : 아버지의 캘리포니아 마우스는 강아지 노출과 처녀 그룹보다 육식 동물 냄새의 존재에서 정리 시퀀스에서 적은 혼란을 전시.

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
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<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서는 세 필수 요소 행동 신경 과학 조사의 성공적 실행을 위해 중요한 것으로 생각 설​​명 : (2) 정확하고 민감한 immunocytochemistry 프로토콜, (1) 대표적인 유효 동물 모델과 (3) 대부분의 분석 (관측 및 통계 ) 행동 및 두뇌 데이터를 모두. 하나의 카테고리에서 실수 가장 확실하게 전체 연구의 결과를 손상됩니다. 따라서 신중하게 적절한 동물 모델을 선택한 후, 상당한 노력을 조종사가 두뇌의 성공적인 처리하여 다음 동작이 안정적으로 연구 관찰된다는 보장하기 위해 행동 및 histological 절차, 테스트 방향으로 이동해야합니다. 앞서 언급했듯이이 기법은 유전 공학이나 고통 외과 조작을 필요로하지 않기 때문에, 특정 응답의 신경 생물학 메커니즘을 식별하는 비교 종의 사용은 귀중한 방법론 접근이다. 따라서,이 방법 론적 접근은 덜 위협, 손상 동물을 활용합니다. 동물 실험실에 보관되어 경우에도 동물의 자연적인 변형의 사용은, 그러나, 자연과 같은 환경의 결합에 의해 강화됩니다. 실험실 연구가 더욱 관심의 동작 종의 차이의 진위를 확인하기 위해 필드로 확장될 수있다면 더 나아가,이 다음 단계를 권장합니다. 비교 방식은 많은 장점을 제공하지만, 제한은 데이터의 상호 성격이며 따라서 이러한 약리 조작과 같은 추가적인 기술은 더욱 관심의 동작에서 신경 생물학 타겟 시스템의 역할을 확인하는 데 사용해야합니다. 경험은, 행동 histological 및 통계 절차에 대한 확신하면, 치료가 동물의 생활 조건은 실험 조작에 대한, 물론 제외한 모든 그룹에 대해 지속적으로 유지되도록 주의해야한다. 이러한 빛의 일정, 소음 수준, 관리 인, 습도 수준 및 실험실에서 냄새로 변수의 변화는 동물들의 신경 생물학 반응에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문서에 나와있는 기본 항체는 바소 프레신 있지만 다른 차 항체가 관심의 다양한 neurochemicals의 과다 사용할 수의 검출을 위해 사용되었습니다. 실험자은 새로운 항체와 함께 일하고있다면, 그것은 새로운 항체의 최적의 희석을 결정하는 적정 연구를 수행하는 것이 중요합니다. 또한, 항체의 과다 사용은 매우 고가이며 대부분의 경우 너무 많은 항체는 신호를 차별화하는 데 너무 어두울 조직의 결과 (로 공급 업체에서 제안)이 사용됩니다. 한 통계 분석 이상이 대체 전망과 데이터의 해석을 제공하는 데 사용할 수있다면 마지막으로, 그들은 활용해야합니다. 이 특정 연구에서는 일반 선형 모델, correlational, 그리고 다차원 스케일링 분석은 데이터의 가장 유익한 전망을 제공하기 위해 사용되었습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 쌍안경 복합 현미경 </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> BIOQUANT 생명 과학 소프트웨어 </td><td> BioQuant 이미지 분석 주식 회사 </td><td> 버전 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex 콘솔 드라이브 쉬운로드 L / S (재관류 펌프) </td><td> 콜 - Parmer 악기 회사 </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 자 세포 배양 클러스터 (조직 문화 처리, 비 pyrogenic 폴리스티렌, 무균) </td><td> 코닝 Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> 25x75x1mm 현미경 슬라이드 </td><td> 글로브 과학 주식 회사 </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> 22x50mm 호 커버 슬립 </td><td> 글로브 과학 주식 회사 </td><td> 1414년부터 1410년까지 </td><td></td></tr><tr><td> 비 멸균 3mL 대형 벌브 전송 Pipettes를 졸업 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconox 세제 파우더 </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S9888 - 1kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> 일염기의의 인산 나트륨 </td><td> 스펙트럼 </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> 인산 나트륨 이염 이수화물 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 30,412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> 트리톤 X </td><td> 스펙트럼 </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> 어부 </td><td> SP15 - 500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> 크롬 칼륨 황산 </td><td> 시그마 </td><td> C - 5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올, 높은 Den.Poly 병, 200 증명, 24 × 1 파인트 </td><td> Pharmco - AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 </td><td> 벡터 </td><td> S - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 반대의 바소 프레신의 Analyte 특정 시약 </td><td> Immunostar 주식 회사 </td><td> 20,069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated 안티 - 토끼 IgG (H + L) - 친화력 정화 </td><td> 벡터 </td><td> BA - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 엘리트 표준 Vectastain ABC 키트 </td><td> 벡터 </td><td> PK - 6100 </td><td></td></tr><tr><td> DAB 퍼옥시데이즈 기판 키트 </td><td> 벡터 </td><td> SK - 4100 </td><td></td></tr><tr><td> 원본 Unflavored 다행 (4 - 카운트 봉투) 1 온스 상자 </td><td> 녹스 </td><td></td><td> 지역 식료품 가게에서 구입 </td></tr><tr><td> 3 % 과산화수소 </td><td> CareOne </td><td></td><td> 지역 약국에서 구입 </td></tr><tr><td> 표백제 </td><td> Clorox </td><td></td><td> 지역 식료품 가게에서 구입 </td></tr></tbody></table>

아버지의 응답의 신경 생물학을 맡은 이후로 비교 종의 접근법을 사용

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

행동 신경 과학의 목표는 구체적인 행동을 규제 기본 신경 생물학 요소를 식별하는 것입니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 동물 모델을 사용하여 많은 방법 론적 전략 침입 기술이 관심의 동작의 강도를 (예, 병변 방법, 약리 조작, microdialysis 기법, 유전 공학 - 동물 모델) 조작이 필요합니다. 비교 종의 방식의 활용이 연구팀은 자연적으로 밀접하게 관련 수종의 기존 대응 전략의 차이를 발생 활용할 수 있습니다. 우리가 실험실에서, 우리는 아버지의 반응에 차이가 Peromyscus의 속 두 종의을 사용합니다. 남성 캘리포니아 사슴 마우스 (Peromyscus 포니)가 자사의 사촌 반면, 여성과 같은 부모의 반응을 전시하고, 일반적인 사슴 마우스 (Peromyscus maniculatus) 새끼의 면전에서 거의 아무런 육성 / 부모의 응답을 전시하지 않습니다. 이 문서에있는 특정 관심의 아버지의 캘리포니아 사슴 마우스로 전시 affiliative 사회적 반응과 관련된 신경 생물학 요인 탐험입니다. 행동 신경 과학 접근 다각이기 때문에 연구의 다음과 같은 주요 구성 요소가 간단히 해결됩니다 : 연구의 유형에 적합한 수종을 식별, 행동 분석을위한 데이터 수집, 준비 및 두뇌의 sectioning, 대한 immunocytochemistry에 관련된 기본 단계를 바소 프레신 - immunoreactivity의 부량, 뇌 조직을 계량하는 소프트웨어를 neuroimaging의 사용, 행동을 점수를하고, 마지막으로, 적절한 통계 분석은 연구 결과의 가장 정보 해석을 제공하기 위해 microsequencing 비디오 분석의 사용.

비교 수종 접근 행동 neuroscientists가 특정 동물 모델의 특성으로 볼 구체적인 행동과 관련된 다양한 신경 생물학 요소를 탐험하실 수 있습니다. 자연 밀접하게 관련 종 사이의 행동의 차이를 발생의 활용이 기술은 침입 기법은 행동의 표현을 조작할 필요가 없습니다.

행동 신경과학의 목표는 특정 행동을 조절하는 근본적인 신경생물학적 요인을 규명하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 동물 모델을 사용함으로써...

이 절차의 전반적인 목표는 비교 종 접근법을 사용하는 것입니다. 부성 행동과 관련된 뇌 영역 및 신경 화학 물질에 대해 더 자세히 알아보기 위해, 우선 관심 행동의 발현 정도가 현저히 차이나는 밀접하게 연관된 두 종을 식별하는 것이 첫 번째 단계입니다. 그다음, 두 종 모두 새끼와 상호작용하도록 하여 부모 반응 내의 행동을 관찰합니다.에토그램(Ethogram). 이러한 행동들은 추후 분석을 위해 비디오로 녹화합니다. 절차의 다음 단계는 뇌 샘플을 수집하여 표적 영역에 바소프레신 면역반응성 조직이 존재하는지 분석하는 것입니다.그 다음으로 신경영상 소프트웨어를 사용하여 표적 뇌 영역의 종별 차이를 결정합니다. 최종적으로 특정 뇌 영역에서 부성 반응 및 바소프레신 면역반응성의 종 관련 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 약리학적으로 조작되었거나 유전적으로 변형된 종을 사용하는 등의 다른 기존 방법과 비교하여 비교 종 접근법을 사용하는 주된 장점은, 인위적으로 유도된 행동을 이용하는 대신 밀접하게 연관된 종 사이에 자연적으로 발생하는 차이를 활용할 수 있다는 점입니다.이 방법이 부성 행동에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 것으로 생각됩니다. 또한 테스트 전에 공격성, 성행동 또는 그루밍과 같은 다른 행동에도 적용될 수 있습니다. 밀접하게 관련된 두 종의 마우스들을 부모 경험이 없는 생물학적 아버지 처녀군과 새끼에 제한적으로 노출된 처녀군의 테스트 그룹으로 분리합니다.먼저 케이지와 비디오 녹화 시스템을 준비합니다. 다음으로 새끼 쥐를 케이지 중앙에 둡니다. 모든 준비가 완료되면 테스트용 수컷 쥐를 새끼 쥐가 있는 케이지에 넣고 5분 동안 행동을 기록합니다.공격적인 반응이 관찰되면 즉시 새끼를 제거하십시오. 캘리포니아 사슴쥐는 어미와 마찬가지로 새끼 위로 몸을 웅크려 마치 새끼가 젖을 먹고 있는 것처럼 보이게 하며 새끼를 그루밍합니다. 반면, 일반 사슴쥐는 새끼에게 거의 관심을 보이지 않으며 종종 새끼로부터 도망치거나 공격하려는 경향을 보입니다.모든 그룹은 관찰된 사회적 상호작용이 새끼 쥐에 특이적인 것이며 일반적인 반응이 아님을 확인하기 위해 장난감 쥐에도 노출됩니다. 관찰 기간이 끝난 후, 행동 점수 기록지를 준비하십시오. 두 명 이상의 관찰자가 비디오 테이프를 채점할 경우에 해당합니다.평가자 간 신뢰도를 확보하는 것이 중요합니다. 여기서는 행동 점수를 매기기 위해 부성 행동 프로그램을 사용합니다. 예시로는 새끼 위에서 웅크리기, 새끼 그루밍하기, 또는 스트레치 어텐드 반응(stretch attend responses)과 같은 불안 행동을 보이는 것이 포함됩니다.마이크로 시퀀싱 소프트웨어를 사용하여 특정 행동 간의 미세한 차이를 밝혀낼 수 있습니다. 여기서는 포식자 냄새에 노출된 C57BL/6 마우스의 데이터를 예로 들어 설명합니다. 먼저, 행동을 그루밍과 비그루밍(non-G grooming)의 이진 상태로 결합한 다음, 시계열 데이터를 생성합니다.마지막으로, 변동 정도를 계산합니다. 미리 정해진 공식을 사용하면, 많은 중요한 행동들을 놓칠 수 있습니다. 일반적인 관찰 기법을 사용할 때는 행동을 비디오로 녹화하여 반응을 슬로우 모션으로 확인하는 것이 가장 좋습니다.더욱 정확한 관찰을 위해, 연구자들은 전문 소프트웨어를 사용하여 행동의 미세 시퀀스를 분석함으로써 사람이 실시간으로 확인했을 때 놓칠 수 있는 데이터를 제공받을 수 있습니다. 이 방법은 새끼에게 노출된 후 동물에서 관찰되는 특정 행동을 어떤 신경화학적 시스템이 매개하는지와 같이 행동 신경과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표준 관류 프로토콜을 사용하여 뇌를 분리하고, 절편 제작 전 냉동시킨 후 특정 지표가 확인될 때까지 트리밍 모드(trim mode)로 뇌를 절단하십시오.표준 마우스 뇌 지도를 사용하여 시상하부의 파라벤트리큘라 핵(paraventricular nucleus) 위치를 확인합니다. 이 영역은 신경펩타이드 바소프레신(vasopressin, VP)을 생성하는 세포가 풍부한 것으로 알려져 있습니다. 파라벤트리큘라 핵에 도달하면, 추가 분석을 위해 30 micron 두께로 절편을 제작합니다. 뇌 절편을 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)가 충분히 채워진 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 신선한 PBS를 추가한 후 플레이트를 로커(rocker) 위에 올려 10분간 반응시키는 과정을 통해 뇌 절편을 PBS로 3~5회 세척합니다.다음으로, 1차 항체 용액이 포함된 용액을 플레이트에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어주며 보관합니다. 2차 항체를 넣기 전에 슬라이스를 세척합니다. 시료를 실온에서 한 시간 동안 흔들어 줍니다. 마지막 세척 후, 신경화학 양성 세포의 시각화를 돕는 ABC(Avidin-Biotin Complex) 용액에 뇌 슬라이스를 노출시킵니다.시각화 절차의 마지막 단계는 DAB 노출 후 DAB를 조심스럽게 첨가하는 것입니다. 뇌 절편을 마지막 세척 과정에 통과시킵니다. 이를 코팅된 현미경 슬라이드 위에 조심스럽게 배치하고 하룻밤 동안 건조시킵니다.건조가 완료되면, 일련의 증류수 및 알코올 세척 과정을 통해 슬라이드를 투명하게 만든 후, 세척된 절편을 citrus solve에 담급니다. 마지막으로 커버글라스를 덮고 슬라이드를 보관함에 넣어 안전하게 보관합니다. 면역화학 공정에는 다양한 방법이 있습니다.성공의 핵심은 명확한 프로토콜을 작성하고 이를 준수하는 것입니다. 이제 전문 신경 정량 분석 소프트웨어를 사용하여 슬라이드를 분석할 준비가 되었습니다. 여기서는 Bio quant 소프트웨어를 사용하여 마우스 뇌의 시상하부 뇌실 주변핵 내 바소프레신 양성 세포와 섬유를 정량화합니다.측정 옵션을 사용하여 관심 영역을 특정하고 신경 정량화를 위한 시야를 설정하십시오. 여기에서 어둡게 염색된 VA 억제제, 면역 반응성 세포체와 섬유가 뚜렷하게 나타납니다. 소프트웨어의 광도 임계값(light thresholding) 기능을 사용하여 특정 영역 내에 양성으로 염색된 조직의 총량을 결정하십시오.이 임계값 설정은 바소프레신 양성 조직이 얼마나 존재하는지를 알려줍니다. 여기에서 볼 수 있듯이, Californicus 수컷은 유사 종과 비교하여 부성 반응의 두 가지 주요 특징인 새끼를 그루밍하고 웅크리고 있는 시간에 더 많은 시간을 보냈습니다. 마이크로 시퀀싱 분석 결과, 부성 캘리포니아 생쥐는 미경험 동물에 비해 그루밍 시퀀스 중 중단 횟수가 더 적은 것으로 나타났습니다.부성 반응에 있어 신경생물학적 변수가 중요한지 판단하기 위해 포식자 냄새에 노출시킨 후, 여러 관련 뇌 영역에서 바소프레신(vasopressin) 양성 조직의 양을 정량화하였습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 부성 californicus 개체들은 이러한 뇌 영역 중 여러 곳에서 더 많은 면역 양성 조직을 가지고 있습니다. 결론적으로, 비교 종 접근법을 통해 관심 있는 특정 행동과 관련된 핵심 신경생물학적 체계를 식별할 수 있습니다.하지만 데이터의 성격이 상관관계에 기반하므로, 신경생물학적 체계의 역할과 관심 대상인 행동을 추가로 확인하기 위해 추가적인 방법론적 기술을 도입하는 것이 중요합니다.

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