칩에 Lensless 형광 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 초광시야에서 형광 물체를 이미징하기 위한 렌즈가 없는 온칩 형광 현미경 검사 플랫폼을 시연하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 얇은 흡수 필터와 광섬유 페이스 플레이트를 광전기 센서 어레이 또는 CCDC 모스 위에 부드럽게 배치 한 다음 미세 유체 칩을 페이스 플레이트 상단에 배치합니다. 다음으로, 인덱스 매칭 오일을 사용하여 마이크로칩과 함께 프리즘을 조립합니다.

형광 인용은 마름모꼴 프리즘의 측면 면을 통해 이루어지며 홀로그램 조명은 동일한 프리즘의 상단 측면을 통해 이루어집니다. 궁극적으로, 디지털 알고리즘을 통해 원시 이미지를 디코딩하여 획득한 형광 이미지로부터 고해상도 현미경 이미지를 얻을 수 있습니다. 필요한 경우, 디코딩된 형광 물체는 맞춤형 개발 인터페이스를 사용하여 자동으로 계수할 수 있습니다.

온 칩 렌즈. 일반적으로 이미징은 부피가 큰 렌즈 기반 광학 현미경을 더 단순하고 컴팩트한 디자인으로 대체하는 것을 목표로 합니다. 이 새로운 기술 플랫폼은 새로운 이론과 디지털 재구성 알고리즘의 도움을 통해 부피가 크고 비용이 많이 드는 매력적인 구성 요소의 필요성을 제거할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

온칩 이미징 플랫폼의 렌즈 목록은 디지털 센서 어레이, 일관되지 않은 조명 소스, 프리즘, 흡수 필터, 광섬유 페이스 플레이트 또는 광섬유 테이퍼를 포함한 여러 광학 부품으로 구성됩니다. 이 플랫폼에서는 다양한 유형의 센서 어레이를 사용하여 대상 마이크로 물체의 형광 신호를 감지할 수 있습니다. 이 비디오의 목적을 위해 전하 결합 장치가 사용되며, 형광 여기에는 간단한 발광 다이오드와 같은 일관되지 않은 광원이 사용됩니다.

이 다이어그램과 같이 필요한 암시야 배경을 생성하기 위해 두 가지 다른 여기 필터링 방법이 병렬로 사용됩니다. 첫째, 유리 프리즘 또는 유리 반구를 사용하여 관심 샘플을 호스팅하는 미세유체 칩의 바닥 표면에 총 내부 반사 또는 TIR을 생성합니다. 이와 병행하여 저렴한 흡수 필터를 사용하여 TIR 프로세스를 따르지 않는 주간 산란 여기광을 제거합니다.

이 두 가지 메커니즘을 사용하여 여기(excitation)를 성공적으로 거부하면 샘플의 형광 방출만 검출기 평면에서 획득됩니다. 이러한 큰 검출 개구수에도 불구하고 센서 어레이의 원시 형광 스폿은 이 형광 신호의 공간적 확산을 엔지니어링하고 더 잘 제어하기 위해 상당히 넓어집니다. 광섬유 페이스 플레이트는 일반 페이스 플레이트의 대안으로 물체와 센서 평면 사이에 배치됩니다.

하단 면에 비해 상부 면의 광섬유 케이블 밀도가 훨씬 더 높은 테이퍼 광섬유 페이스 플레이트는 배율을 통한 고해상도 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 플랫폼에 사용되는 미세유체 칩은 유리 슬라이드에 배치된 폴리 디메틸 슬론 벽을 사용하여 제작되어 온칩 이미징이 무지상 온칩 이미징 플랫폼의 조립을 시작하는 데 필요한 마이크로 채널을 생성합니다. 먼저 진공 펜을 사용하여 광전자 센서 어레이의 커버 유리를 제거하고 검출기 활성 영역 상단에 얇은 흡수 필터를 부드럽게 놓습니다.

이 흡수 필터 위에 광섬유 페이스 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 제작된 미세유체 칩을 광섬유 어레이 위에 직접 놓습니다. 다음으로, 유리 프리즘은 계면의 굴절률이 유리의 굴절률과 일치하도록 지수와 일치하는 오일을 사용하여 미세유체 칩 위에 조립됩니다.

FC 커넥터를 사용하여 광원을 광섬유 케이블에 연결합니다. 이 절차에서 가장 어려운 측면 중 하나는 구성 요소를 정렬하는 것입니다. 구성 요소 사이의 거리, 조명의 위치 및 각도를 조심스럽게 정렬하십시오.

마지막으로, 측면 조명 광섬유를 프리즘에 더 가깝게 이동하고 각도를 조정하여 미세유체 칩에 해당하는 유리 공기 계면에서 전체 내부 반사가 발생하도록 합니다. 이 온칩 플랫폼을 사용하여 바닥 기질, 다양한 세포 또는 작은 동물 모델을 이미지화할 수 있지만 이 시연의 목적을 위해 백혈구를 이미지화할 것입니다. 백혈구를 형광 염료로 표지하려면 먼저 약 100마이크로리터의 전혈과 약 1밀리리터의 적혈구 상승 완충액을 혼합하고 실온에서 약 3분 동안 배양한 다음 거짓말 혈액 용액을 원심분리합니다.

마이크로 피펫을 사용하여 최상층을 제거한 후, 펠릿 층을 인산염 완충 식염수에 재현탁시켜 세포의 핵산을 형광 염료로 표지하고, SYTO 16을 resus 현탁액에 첨가한 다음 실온의 어둠 속에서 약 30분 동안 샘플을 배양합니다. 30분 후, 라벨이 붙은 샘플을 원심분리합니다. 결합되지 않은 염료의 형광 방출로 인한 배경 소음을 줄이기 위해 supinate를 제거합니다.

리스는 약 5밀리리터의 PBS에서 백혈구 펠릿 층을 구부렸습니다. 이제 샘플은 렌즈 프리 온 칩 형광 이미징을 위해 미세유체 칩에 로드할 준비가 되었습니다. 백혈구를 이미징하기 전에 형광 마이크로비즈를 사용하여 이미징 플랫폼을 보정해야 합니다.

탈이온수와 원시 비드 용액을 사용하여 희석된 마이크로비드 샘플을 준비합니다. 날카로운 바늘 주사기를 사용합니다. 이 초기 샘플을 PDMS 벽 측면에서 미세유체 칩에 주입합니다.

온칩 형광 이미징을 달성하기 위해 구성 요소를 조립한 후 컴퓨터를 통해 맞춤형으로 개발된 lab view 인터페이스를 사용하여 형광 비드의 원시 이미지를 획득합니다. 전체 시야에 걸쳐 최소 20개의 분리된 형광 비드 이미지가 있는지 확인하십시오. 교정 데이터를 저장하면 나중에 lens less fluorescent microscopy 플랫폼의 점 확산 기능을 보정하고 추출하는 데 사용됩니다.

형광 비드 샘플이 포함된 미세유체 칩을 제거하고 이 칩에서 프리즘을 분리합니다. 이전에 준비된 백혈구 샘플을 PDMS 벽 측면에서 사용하지 않은 다른 미세유체 칩에 주입합니다. A: 특히 거리와 여기 전력과 관련하여 동일한 실험 조건으로 구성 요소를 다시 한 번 조립합니다.

형광 마이크로비드에 사용되는 것과 동일한 소프트웨어 파라미터로 맞춤형 lab view를 사용하여 백혈구의 원시 이미지를 획득합니다. 그런 다음 보정 데이터와 원시 백혈구 이미지를 사용하여 디지털 처리를 통해 MATLAB에서 고해상도 이미지를 생성합니다. 4 미크론 및 10 미크론 녹색 형광 입자를 포함하는 혼합물의 광시야 형광 온칩 이미징의 대표적인 결과는 비교 목적으로 10 x 현미경을 위해 여기에 표시됩니다.

표시된 형광 이미지가 적은 렌즈와 잘 일치하는 객관적인 이미지도 제공됩니다. 다음으로, 광시야 렌즈의 결과, 10 미크론 녹색 및 10 미크론 적색 형광 입자를 포함하는 혼합물의 형광 이미징이 적습니다. 렌즈가 적은 형광 이미지는 동일한 샘플의 10 x 현미경 대물렌즈 이미지와 적절한 일치를 제공합니다.

이 그림은 다양한 10미크론 비드 쌍의 이미징을 위한 디코딩 알고리즘을 기반으로 Lucy Richardson Deconvolution 및 압축 샘플링의 성능 비교를 제공합니다. 맨 윗줄은 원시 형광 이미지가 없는 렌즈를 보여주며, 삽입 이미지는 10 x 대물 렌즈를 사용하여 필요한 동일한 입자의 현미경 비교를 보여줍니다. 중간 행은 압축 디코딩 결과를 보여주고, 아래 행은 Lucy Richardson Deconvolution 결과를 보여줍니다. DDCS 및 DLR은 각각 중심에서 중심까지의 거리 및 현미경 이미지, CS 디코딩 렌즈 이미지 및 LR de 컨볼루션 렌즈 리스 이미지를 나타냅니다.

다음으로, 렌즈의 디지털 처리, 형광 원시 이미지가 적은 것을 설명합니다. 압축 샘플링 기반 알고리즘은 밀접하게 패킹된 2미크론 직경의 비드 쌍을 분해하여 4미크론 미만의 공간 분해능을 달성하는 데 사용됩니다. 삽입물은 40 x microscope objective comparisons를 보여주며, 이는 디코딩된 형광 이미지와 매우 잘 일치합니다.

여기서 D는 현미경 이미지에서 중심에서 중심까지의 거리를 나타냅니다. DCS는 CS 디코딩 렌즈의 중심 간 거리를 나타내지만 형광 이미지는 적습니다. 이 그림은 형광 표지된 백혈구에 대한 렌즈를 사용하지 않은 이미징 결과를 보여줍니다.

렌즈가 없는 원시 이미지는 CS 기반 디코더를 사용하여 빠르게 디코딩되며, 이는 10 x 대물 렌즈로 획득한 동일한 샘플의 기존 현미경 이미지와 매우 잘 일치합니다. 필요한 경우 이미징 외에도 디코딩된 형광 물체는 온칩 세포 분석 응용 분야를 위한 맞춤형 개발 인터페이스를 사용하여 자동으로 계수할 수 있습니다. 다음은 matlab에서 맞춤형으로 설계된 자동화된 형광 물체 계수 인터페이스입니다. 우리는 방금 8cm 정사각형의 시야에서 표지된 세포와 마이크로 박동을 육상 없이 형광 현미경으로 검사하는 절차를 시연했습니다.

그런 비교된 배 화상 진찰 플랫폼은 뒤에 급속한 압축 암호해독기와 더불어. 고처리량 세포 분석, 마이크로 희귀 분석 및 실제 세포 연구 응용 분야에 대해 매우 가변적일 것입니다.