GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

본 절차의 목적은 살아있는 혈관 내피 세포의 액틴 세포골격에서 나타나는 동적인 변화를 관찰하는 것입니다. 먼저 인간 제대 정맥 내피 세포에 A GFP beta actin 플라스미드를 형질전환하고, 커버슬립 위에서 세포가 합쳐질 때까지 배양합니다. 그다음 가열 스테이지와 알부민 생리 식염수 주입 장치가 갖춰진 살아있는 세포 이미징 챔버에 커버슬립을 배치합니다.

마지막 단계는 약물 처리 전후의 타임랩스 이미지 캡처를 통해 선택한 세포 영역의 데이터를 획득하는 것입니다. Image J와 같은 이미징 소프트웨어를 이용한 Chime 그래프 분석을 통해 돌출부의 거리, 시간, 속도와 같은 국소적인 lamely podia 돌출 및 시간에 따른 액틴 섬유의 움직임에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 면역형광 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 살아있는 세포 이미징을 통해 내피 투과성을 결정하는 메커니즘 연구에 액틴 및 세포골격의 역동적인 특성을 통합할 수 있다는 점입니다.

고정 염색된 세포는 특정 시점의 스냅샷만을 나타내므로, 생물학적 안전 작업대 내에서 염증 매개체 처리 전후의 세포 및 세포골격 역동성에 대한 정보 제공 능력이 낮습니다. 70% ethanol로 2분간 멸균한 커버슬립을 공기 중에서 건조시킵니다. 각 커버슬립을 10 centimeter 배양 플레이트에 배치하고, 커버슬립의 가장자리에 닿지 않도록 중앙에 300 microliters의 따뜻한 젤라틴 용액을 첨가합니다. 5분 후, 액체를 흡입하여 제거합니다.

이제 0.25% trypsin EDTA를 사용하여 합쳐진(confluent) 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells) 또는 VE 배양물을 수확합니다. 세포 수를 측정하고 원심분리를 통해 농축합니다. VE nuclear effector kit를 이용한 형질전환 반응을 위해 상층액 배지를 가능한 한 많이 흡입하여 제거하십시오.

세포 펠렛을 기본 핵 효과기 용액(basic nuclear effector solution)에 다시 현탁하고 0.2~2 µg의 GFP beta actin 벡터 플라스미드를 첨가합니다. 세포 현탁액 100 µL를 핵 효과기 Q-vete로 옮깁니다. 덮개가 닫힌 vete를 몇 번 가볍게 두드려 Q-vete 바닥과 형질전환 시료 사이에 기포가 없는지 확인합니다.

Q VET를 nuclear effector two 장치에 넣고 program A 0 3 4를 실행하며, nuclear effector 키트의 transfer pipette를 사용하여 500 µL의 가온된 EGM two MV 배지를 qve에 옮깁니다. 그다음 혼합물을 micro fuge tube로 다시 옮기고 15분 동안 배양합니다. 형질전환된 VE 현탁액을 부드럽게 한 번 섞은 후, 가장자리에 닿지 않게 주의하며 300 µL의 현탁액을 gelatin 코팅된 cover slip 위에 분주합니다.

그런 다음 1~4시간 동안 배양합니다. 형질전환된 세포가 커버슬립에 부착되었는지 확인하십시오. 그 후 플레이트에 E GM two MV 배지 10 milliliters를 첨가하고, GFP 발현이 일어날 때까지 계속 배양합니다.

먼저, 알부민 생리식염수 용액 또는 PSS를 중력 흐름 시스템에 넣고 인라인 히터에 연결합니다. 이제 유량 조절기를 조정하여 약 40 milliliters per hour의 유량을 맞춥니다. 그다음 면봉을 사용하여 스톱콕을 닫아 흐름을 중단시킵니다.

다이아몬드 배스(diamond bath) 하단의 바깥쪽 가장자리에 진공 그리스를 도포합니다. 이제 인큐베이터에서 형질전환된 배양물을 꺼냅니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 들어 올립니다.

그런 다음 Kim wipe를 사용하여 바닥 슬라이드에 남은 과잉의 EGM two MV 배지를 흡수시키며, 이때 세포 면이 위를 향하도록 배치합니다. 커버슬립 위에 다이아몬드 배스(diamond bath)를 덮어 챔버를 형성합니다. 형성된 챔버를 신속하게 스테이지 히터에 넣습니다.

챔버 위의 클램프를 조이고 플레이트에서 약 1 mL의 EGM two MV 배지를 챔버로 피펫팅합니다. 이제 진공 호스를 챔버 왼쪽의 홀더에 연결하고, 인라인 히터의 A PSS 라인을 챔버 오른쪽의 채널에 연결합니다. 그런 다음 진공을 켜고 A PSS 라인을 열어 형질전환된 세포 위로 배스가 관류되도록 합니다.

또한 인라인 히터를 37 °C로 켭니다. 다음으로 가열 스테이지용 서미스터 프로브를 배스 가장자리에 놓고 스테이지 히터를 37 °C로 켭니다. 남아있는 EGM two MV 배지와 염분 축적물을 제거하기 위해, 70% ethanol에 적신 Kim wipe로 커버슬립 하단을 조심스럽게 닦아낸 후 마른 Kim wipe로 닦습니다. 형질전환된 HU 세포를 30분 동안 평형화합니다.

코스를 고정하십시오. 연구를 위해 배양 세포의 선택된 영역에 초점을 맞춥니다. 세포 내 GFP Act in 신호 강도에 따라 카메라 노출 시간을 0.5에서 2초 사이로 설정하십시오.

또한 실험의 간격과 지속 시간을 설정하십시오. 이제 실내 조명을 끈 상태에서, 설정을 평가하기 위해 단일 이미지를 캡처합니다. 필요한 이미지들이 생성되는지 모니터링하면서 타임랩스 시리즈를 캡처하십시오.

일반적인 프로토콜에서는 테스트 약물을 처리하기 전 20~30분 동안 기저 상태의 이미지를 획득하고, 이후 0.5~4시간 동안 추가적으로 이미지를 획득합니다. 마지막으로, 동반 텍스트에 상세히 설명된 바와 같이, CH 그래프 분석을 통해 lamely podia 돌출 거리, 지속성 및 속도를 평가합니다. 일반적인 실험에서 GFP actin은 형질전환된 VE의 50% 이상에서 무작위 방식으로 발현됩니다.

1분마다 획득한 이 이미지들은 세포질 전체의 GFP actin뿐만 아니라 필라멘트 구조와 세포 가장자리를 따라 돌출된 국소적인 e meli podia를 포착하였습니다. 세포 돌출부의 거리 지속성과 속도는 타임랩스 이미지 세트로부터 정량화됩니다. chm 그래프 분석을 사용하여, 먼저 세포의 가장자리에 대략적으로 수직인 단일 픽셀 선을 그립니다.

이 영역은 타임랩스 세트의 각 이미지에서 추출되어 시간 경과에 따른 해당 영역의 몽타주 또는 카임(chime) 그래프를 생성합니다. 여기의 카임 그래프에서 왼쪽에서 오른쪽 방향으로 볼 때, 돌출부는 세포 가장자리의 상향 이동으로 나타납니다. 이러한 돌출부 중 하나의 가장자리에 선을 겹쳐 놓으면, 해당 선과 관련된 픽셀 데이터를 수집하여 돌출부 역학을 정량화할 수 있습니다. 카임 그래프에 나타난 돌출부의 총 개수를 통해 돌출 빈도를 추정할 수 있습니다.

본 분석은 세포 주변부에서 형성되어 세포 중심 방향으로 이동하다가 결국 분해되는 스트레스 섬유(stress fiber)의 움직임을 묘사합니다. 키모그래프(chio graph)에서 스트레스 섬유는 세포질 영역에 연속적인 선으로 나타나며, 대개 세포 중심을 향해 오른쪽 아래 방향으로 이동합니다. 원본 키모그래프에서 섬유를 식별하기 어려운 경우, 언샤프 마스크(unsharp mask) 필터를 사용하여 이미지의 선명도를 높입니다. 스트레스 섬유 위에 그려진 선은 측정(measure) 기능을 이용한 픽셀 데이터 수집을 용이하게 합니다. 또는, 식별된 스트레스 섬유의 시작점부터 끝점까지 선을 그려 섬유가 관찰된 기간 동안의 평균 픽셀 데이터를 산출할 수 있습니다.

본 프레젠테이션에서는 Image J와 같은 소프트웨어를 이용한 그래프 분석을 통해 타임랩스 이미지 세트의 데이터를 분석하는 방법을 시연하였습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 형질전환된 혈관 내피세포의 라이브 셀 이미징을 통해 염증 매개체에 반응하는 액틴 세포골격 역학을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.