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한천 패드가 있는 슬라이드에서 두 개의 개별 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주를 섭취하십시오. 패드에는 움직임을 최소화하는 마비제가 함유된 롤링 용액이 포함되어 있습니다.
벌레의 복부 신경 코드(VNC)에는 한 균주에서 세포질 칼슘 지표를 발현하고 다른 균주에서 미토콘드리아 칼슘 지표를 발현하는 흥분성 중간 뉴런이 포함되어 있습니다.
커버슬립을 놓아 웜을 굴리고 시각화를 위해 VNC의 방향을 지정한 다음 형광 현미경 아래에 배치합니다.
가시광선을 사용하여 벌레를 찾은 다음 형광 모드로 전환합니다.
휴식 뉴런에서 낮은 세포내 칼슘은 지표를 결합하지 않은 상태로 유지하여 약한 형광을 초래합니다.
자발적인 신경 활동은 전압 개폐 칼슘 채널을 열어 칼슘 유입을 허용합니다.
세포질 지표가 있는 균주에서 칼슘은 지표에 결합하여 세포질 형광을 향상시킵니다.
과도한 세포질 칼슘은 채널을 통해 미토콘드리아로 들어갑니다. 미토콘드리아 지표가 있는 균주에서 칼슘 결합은 미토콘드리아 형광을 증가시킵니다.
세포내 칼슘 역학을 모니터링하기 위해 두 균주의 뉴런을 이미지
화합니다.13 x 100mm 유리 배양 튜브에 분자 등급 한천을 M9에 녹여 10% 한천 3밀리리터를 준비하고 전자레인지에 몇 초 동안 돌립니다. 한천 패드를 만들려면 먼저 두 겹의 실험실 테이프를 추가하여 두 개의 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 두 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 1,000마이크로리터 피펫 팁의 끝을 자르고 이를 사용하여 커버슬립 중앙에 작은 한천 한 방울을 피펫팅합니다.
한천 위에 있는 또 다른 슬라이드를 눌러 한천을 평평하게 만듭니다. 냉각 후 10밀리리터 튜브의 개구부를 사용하여 한천을 작은 디스크로 자른 다음 주변 한천을 제거합니다. 다음으로, M9에 무시몰 분말을 녹여 웜 롤링 용액을 준비하여 30밀리몰 스톡을 만듭니다. 폴리스티렌 구슬로 스톡을 1:1 비율로 희석하여 롤링 용액을 만듭니다.
이미징을 위해 웜을 배치하려면 먼저 1.6마이크로리터의 롤링 용액을 한천 패드 중앙에 놓습니다. 그런 다음 선호하는 웜 픽을 사용하여 원하는 연령의 웜을 한천 패드의 롤링 용액으로 옮깁니다. 무시몰이 벌레의 움직임을 줄일 때까지 약 5분 동안 기다린 다음 한천 패드 위에 22 x 22mm 크기의 커버슬립을 떨어뜨립니다.
복부 신경줄의 신경돌기를 이미징하려면 커버슬립을 약간 밀어 웜을 굴립니다. 웜을 현미경에 장착하려면 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 밝은 필드에서 저배율 대물렌즈를 사용하여 웜을 찾으십시오. 그런 다음 100X 대물렌즈로 전환하고 488나노미터 이미징 레이저로 GCaMP 또는 mito-GCaMP의 조명을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾습니다.
