Name: Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: 학습하세요 TaqMan 프로브를 이용한 일단계 RT-PCR으로 어린이 대변에서 Norovirus를 검출하고 유전자군을 분류하는 방법을. 이 기술은 소아 감염병 진단 및 역학 연구에 활용됩니다.

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저자는 월위한 표준 및 제어 반응의 종류 선물 질병 통제 예방을위한 국립 Calicivirus 연구실 센터 (CDC)에 감사 드리고, 그리고 시약을 제공 존스 홉킨스에​​서 공중 보건 학부의 실험실 것이다.

1. 대변​​ 샘플 <ol><li> 대변​​ 샘플은 RNA를 유지하기 위해 냉동 보관해야합니다. 10 % 배설물 현탁액을 하시려면 해동 대변 샘플의 약 0.1 g을 가지고 PBS 1 개 ML을 완료합니다. </li><li> 피할 200 μl의 나누어지는은 동결 융해 반복했다. -70 ° C.에 aliquots를 저장 </li><li> 영유권 및 추출에 사용하기 전에 10 분 동안 4천그램에서 aliquots을 원심 분리기. </li></ol> 2. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 실리카 입자의 작성 <ol><li> RT에서는 이산화 규소 30 G를 중지하고 최대 250 ML에 DH 2 O와 완료합니다. </li><li> 침전의 24 시간 후에 흡입에 의해 뜨는의 215 ML을 제거합니다. 최대 250 ML에 DH 2 O를 추가하고 흔들림으로 실리카 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 또 24 시간 후에 흡입에 의해 뜨는을 제거하고 pH를 2.0으로 실리카 현탁액의 산도를 조정, 염산 (HCL)을 사용합니다. 유리 봇에서 나누어지는 실리카 현탁액을tles 및 압력솥. </li></ol> 3. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 L6 버퍼의 작성 <ol><li> RT에서, 0.1 M 트리스 염산염, 산도 6.4, 그리고 0.2 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0 용액 중 11 ML의 50 ML에 X-100 guanidinium thiocyanate의 60 G (GuSCN)와 트라 이튼 1.3 g을 용해하여 L6 버퍼를 준비합니다. </li></ol> 4. 구아니딘 및 실리카로 추출을위한 L2 버퍼의 작성 <ol><li> RT에서, 0.1 M 트리스 염산염, 산도 6.4의 150 ML에 guanidinium thiocyanate 180 G (GuSCN)을 해소하여 L2 버퍼를 준비합니다. </li></ol> 5. 추출 절차 <ol><li> 각 추출에 월 긍정적인 대변 샘플은 긍정적인 제어 및 DEPC 처리 물로, 부정적인 컨트롤로 포함되어야합니다. </li><li> 마이크로 원심 튜브에 다음을 섞어, 버퍼 L6, 실리카 입자 20 μL 1 ML, 그리고 10 % 배설물 추출물 서스펜션 200 μL를 추가합니다. 와동의 간략 15 마일을 위해 RT에두고N. </li><li> 10 s에 대한 6천그램에서 현탁액을 원심 분리기와 70 %의 에탄올을 가진 두 세차장 및 아세톤으로 한 번에이어서, 두 버퍼의 L2의 1ml와 펠렛을 씻는다. 5 분 동안 56에서 건조 가열 블록 ° C로 펠렛을 건조합니다. </li><li> RNase가없는 DH 2 0 50 μL를 추가하여 실리카 펠렛의 하이드 RNA. 15 분 동안 RNasin 1 μL, 56에서 반전 튜브 및 부화에 의한 믹스 ° C를 추가합니다. </li><li> 탁상 원심 분리기에서 전속력으로 3 분 동안 원심 분리기와 RNA를 포함하는 표면에 뜨는 40 μL를 수집합니다. </li><li> Nanodrop 2000 분광 광도계 (써모 과학)을 사용하여 압축을 푼 RNA 샘플을 계량. 그렇다면 -70에서 보관 ° C를 이용 때까지 최대 6 개월까지. (참고 : 손상 총 RNA를 유지하기 위해 더 좋은 방법은 cDNA로 변환합니다.) </li></ol> 6. 상업 RNA QIAamp 바이러스성 RNA Kit를 사용하여 대체 추출 전체 지침은 책자 prov에서 발견되는QIAGEN 키트 ided. 다음과 같이 간단히 절차는 다음과 같습니다 <ol><li> 버퍼 AVL의 Pipet 560의 μL은 1.5 ML 튜브로 캐리어 RNA를 포함하고, 10 %의 대변 현탁액 140 μL를 추가합니다. 15 초위한 펄스 vortexing하여 섞는다. 10 분 동안 RT에서 품어. </li><li> 15 초 동안 펄스 vortexing에 의해 시료와 혼합으로 에탄올의 560 μL (96~100%)를 추가 후 간단히 원심 분리기. </li><li> 2 ML 회수 관에 배치 스핀 컬럼이 솔루션의 630 μL을 적용합니다. 6천g에서 1 분 동안 원심 분리기, 그리고 깨끗한 두 ML 관에 스핀 컬럼을 넣으십시오. </li><li> 1 분 용 6천그램에서 버퍼 AW1 및 원심 분리기 500 μL로 묶인 RNA를 포함하는 컬럼을 씻으십시오. 깨끗한 두 ML 수집 관에서 개최 칼럼. </li><li> 3 분은 최고 속도 (20,000 G 또는 14,000 RPM)에서 500 버퍼 AW2의 μL와 원심 분리기로 열을 씻으십시오. </li><li> 깨끗한 1.5 ML 마이크로 원심 분리기 튜브의 장소 스핀 컬럼은 40 μL DEPC-처리된 물을 추가하고 전속력으로 RNA를 elute. 에 반복eluted RNA의 최종 80 μL를위한 CE. </li><li> Nanodrop 2000 분광 광도계 (써모 과학)을 사용하여 압축을 푼 RNA 샘플을 계량. 그렇다면 -70에서 보관 ° C를 이용 때까지 최대 6 개월까지. (참고 : 손상 총 RNA를 유지하기 위해 더 좋은 방법은 cDNA로 변환합니다.) </li></ol> 7. 한 단계 실시간 특정 Taqman 프로브와 RT-PCR에 의해 추출된 RNA의 노로 바이러스의 검출 악기 StepOnePlus 리얼 타임 PCR 시스템 (응용 Biosystems). 방법론 <ol><li> 닦아내기 및 기타 잠재적인 RNase 오염을 제거 행방불명 RNase와 함께 모든 작업 표면, pipettes, 그리고 원심 분리기를 청소합니다. </li><li> Pipet 월 GI과 GII 심사 마스터는 표 1에 따라 혼합. Primers 및 Taqman 프로브는 표 2에 나열되어 있습니다. </li><li> 각 반응 튜브에 맞는 마스터 믹스 나누어지는 10 μL. </li><li> undiluted 미지 시료의 5 μL를 추가하십시오해당 반응 우물에 각각 RNA, DEPC-처리된 대조군과 같은 물, 혹은 GI GII 긍정적인 제어 RNA. 모든 샘플은 중복으로 실행해야합니다. 각각 300 μg / μL와 500 μg / μL의 농도로 긍정적인 컨트롤과 기준은 질병 통제 예방을위한 국립 Calicivirus 연구실 센터 (CDC)에 의해 제공되었다. </li><li> 10 초 동안 6,000g에 반응 판을 원심 분리기. </li><li> 실험 등록 정보 화면에서, 실행을위한 실험의 종류를 정의하고 선택합니다. TaqMan의 시약은 시약의 종류 및 그 사전 PCR 증폭 읽기와 선택으로 표시하고 있는지 확인하십시오. </li><li> 표 3에서 열 프로파일을 사용하여 15 μL 반응을 실행합니다. </li><li> 결과를 분석. </li></ol> 8. 기존의 RT-PCR과 장면을 사용하여 월 GI과 GII의 Genotyping (이것은 일반적이고 널리 사용되는 방법 이니 그것은이 동영상에서 언급하지 않은 것.) 악기는. Biosystems StepOne 및 Quantitec 템플릿과 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템을 적용했습니다. 방법론 <ol><li> genotyping 전에 샘플 genogroup (GI 또는 GII)은 RT-PCR은 위에서 설명한 심사에 따라 결정됩니다. GI 월 RNA는 GII genotyping 마스터 믹스와 GI의 genotyping 마스터 믹스와 GII 월 RNA와 증폭되어야한다. </li><li> Pipet 월 GI과 GII genotyping 마스터는 표 4에 따라 혼합. Primers GI SKF / SKR 및 G2 SKF / SKR은 표 5에 나열되어 있습니다. </li><li> 0.2 ML 반응 튜브에 적합한 마스터 믹스 나누어지는 45 μL. </li><li> 각 부정적인 제어 튜브에 DEPC-처리된 물에서 5 μL, 그리고 사전 스크린, 월 (GI 및​​ / 또는 GII) 해당 반응 튜브에 긍정적인 RNA의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 표 6에 온도 프로파일을 사용하여 50 μL 반응을 실행합니다. </li><li> PCR 제품 contai 보내기적어도 100은 증폭 capsid 지역의 μL / NG 정화 및 시퀀싱을위한 회사 Macrogen하기 닝. (시퀀싱 당 9,700 위대한 세네카 Hwy. 락빌, 메릴랜드 20850 및 샘플 당 $ 10). </li></ol> 9. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1은 Taqman diarrheal 아이들의 대변 샘플에서 추출한 RNA 분석에 사용되는 원 - 스텝 RT-PCR에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 긍정적인 샘플에 대한 문턱주기 (CT)은 GII를위한 GI와 CT 39 이하 CT 37 같음에서 설정되었습니다. 긍정적인 컨트롤을위한 CT-값은 각각 27, GI과 GII위한 ORF1-ORF2 교차점 18 미만이어야하는 것으로 확인되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 <table border="1"><tbody><tr><td> 마스터 믹스 </td><td> 최종 Conc </td><td> 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2.875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR 마스터 믹스 </td><td> 1X </td><td> 6.250 </td></tr><tr><td> RT 믹스 </td><td> 1X </td><td> 0.125 </td></tr><tr><td> 50 μm의 예지 자의 R 프라이머 </td><td> 1 μm의 </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 50 μm의 예지 F 조의 입문서 </td><td> 일μm의 </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 10 μm의 링 프로브 </td><td> 1 μm의 </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10.00 </td></tr></tbody></table> 각 프로브의 0.125 μL가 GII 시험에 사용되는 동안 각 프로브의 * 0.250 μL은 GI 테스트에 사용되었다. 심사 GI과 GII위한 표 1. Qiagen Quantitect 마스터 믹스 (트루히요 외., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 제노 - 그룹 </td><td> 사용 </td><td> 시퀀스 (5 '3') </td></tr><tr><td> 코그 1R </td><td> 노병 </td><td> 뇌관 </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> 코그 1 층 </td><td> 노병 </td><td> 뇌관 </td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT 조지아 </td></tr><tr><td> 코그 2R </td><td> GII </td><td> 뇌관 </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> 코그 2 층 </td><td> GII </td><td> 뇌관 </td><td> 자동차 GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> 반지 1A </td><td> 노병 </td><td> 탐침 </td><td> 우리 식구들-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> 링 1B </td><td> 노병 </td><td> 탐침 </td><td> 우리 식구들-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> 탐침 </td><td> 우리 식구들-TGG 개그 GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> 표 2. 프라이머와 genogroups I, II (Kageyama 외.위한 실시간 정량 RT-PCR에 사용되는 프로브 oligonucleotides,2003) 8. <table border="1"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 온도 (° C) </td><td> 시간 (분) </td><td></td></tr><tr><td> 일 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA 합성 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15시 </td><td> HotStart DNA 형성 촉매 효소의 활성화 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 0시 15분 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 1시 </td><td> 45X주기 </td></tr></tbody></table> 테이블3.를위한 써멀 프로파일 한 단계 Taqman 실시간 RT-PCR (트루히요 외., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> 마스터 믹스 </td><td> 최종 Conc </td><td> 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29.50 </td></tr><tr><td> 5 배 Qiagen RT-PCR 버퍼 </td><td> 1X </td><td> 10.00 </td></tr><tr><td> 10 MM dNTP 믹스 </td><td> 0.4 MM </td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> 효소 믹스 </td><td></td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> 40 U / μL RNAsin </td><td> 20 U / μL </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10 μm의 SKF </td><td> 0.1 μm의 </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10 μm의 제품 SKR </td><td> 0.1 μm의 </td><td> 0.50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45.00 </td></tr></tbody></table> 표 4. Qiagen genotyping GI과 GII를위한 원 - 스텝 RT-PCR 마스터 믹스. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 제노 - 그룹 </td><td> 사용 </td><td> 시퀀스 (5 '3') </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> 노병 </td><td> 뇌관 </td><td> 5'-CTG C​​CC GAA TTY GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> 노병 </td><td> 뇌관 </td><td> 5'-CCA ACC 차 CCA TTR 전술 - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> 뇌관 </td><td> 5'-CNT GGG AGG GCG ATC GCA - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> 뇌관 </td><td> 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> 표 5. Primers는 Capsid 지역의 지역 C (코지마 외., 2002)의 증폭에 사용 5. <table border="1"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 온도 (° C) </td><td> 시간 (분) </td><td></td></tr><tr><td> 일 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA 합성 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15시 </td><td> HotStart DNA 형성 촉매 효소의 활성화 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 0시 3분0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 1시 </td><td> 40X주기 </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 0시 반 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10시 </td><td> 가열 냉각 </td></tr></tbody></table> 표 6. Taqman 원 - 스텝 RT-PCR을위한 열 프로필입니다.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

대변​​ 샘플로부터 핵산을 분리해위한 방법을 사내에 경제를 사용하여, 우리는 Qiagen의 상업 QIAmp 바이러스성 RNA 키트와 마찬가지로 동일한 결과를 얻을, 함께 TaqMan RT-PCR 저희 연구실에서 개발된들과 우리 월 광범를 감지할 수 있습니다 GI과 GII genogroup에 속하는 genotypes. 지역 C 프로토콜의 최근 출간은 78 % 6의 genotyping 속도를 보도했다. 현대 월의 종자의 다양성 이전 년 동안 증가되어 있기 때문에 성공률 테스트중인 표본에 대한 지역 C의 primers의 불일치에 따라 달라집니다. 그것 때문에 시간이 7 주위의 회전을 단축, 사후 증폭 제품 처리를 제거로서 분석은 일상적인 진단하는 데 유용합니다. 외에도 진단에서이 프로토콜은 또한 따라서이 질환의 공중 보건 관리에 유용되고, 월 감염의 역학을 명확히 사용할 수 있습니다. 검사를 실행하면 RT-PCR, 프라이머 / 프로브 집합에 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 구아니딘의 isothiocyanate </td><td> 시그마 - Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 HCL </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 규토 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X 100 </td><td> BDH 화학 </td><td> 14,530 </td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> 바이러스성 RNA 미니 키트 (250) QIAamp </td><td> QIAGEN </td><td> 52,906 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTEC 프로브 RT-PCR 키트 (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204,443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen 한 단계 RT-PCR 키트 (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210,212 </td><td></td></tr><tr><td> Rnase 억제제 2,000 단위 </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / 유리병 </td></tr><tr><td> 비 스틱 Rnae 프리 Microfuge 튜브 </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure 아가로 오스 1,000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

taqman함으로써 어린이 stools에서 noroviruses의 감지 및 genogrouping 한 단계 rt-pcr

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs)는 모든 연령층의 사람에있어서 세계적으로 산발적 급성 위장염의 발생의 주요 원인입니다. 그들은 Rotavirus의 그것과 유사한 공중 보건에 미치는 영향과 아동 입원의 중요한 원인입니다. NoVs 좋은 유전자 다양성의 RNA 바이러스이며 새로운 변종의 지속적인 모습이 있습니다. 다섯 genogroups 인식되며, GI과 GII들의 많은 genotypes과 인간의 감염에 대한 가장 중요한되고 subtypes와 함께. 그러나,이 두 genotypes의 진단은 진단과 치료를 지연, 문제가 남아 있습니다. 1, 2, 3 대변​​ 표본에서 RNA 추출에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 Qiagen에서 QIAmp 바이러스성 RNA 상용 키트입니다. 이 메서드는 버퍼, 실리카 겔 막의 바인딩 속성을 결합하여 그 제어 RNases 및 microspin의 속도와 함께 컬럼으로 RNA의 최적의 바인딩을 제공합니다. 이 방법은 간단하고 빠르고 신뢰성이 있으며 카입니다제조 업체에서 제공한 설명에 자세히되는 몇 가지 단계에 뻔했어. 노로 바이러스는 설사의 가장 흔한 원인으로서 rotavirus에게만 초입니다. 노로 바이러스 진단은 설사의 pathogenesis에 대한 모든 연구에서뿐 아니라 발병이나 개별 설사 케이스에서 사용할 수 있어야합니다. 현재는 그러나 노로 바이러스 진단은 진단 간단한 방법의 부족으로 인해 단 몇 센터로 제한됩니다. 이 지연 진단 및 치료 1, 2, 3. 또한, 국가 사이와 사이의 비용과 부식성 버퍼의 규제로 인해 교통이 병참 문제를 포즈 이러한 제조 키트를 사용하십시오. 따라서이 프로토콜에 우리는 원래 붐을 기반으로 대안, 경제, 사내 방법을 설명 외 guanidinium thiocyanate의 안티 nuclease 특성과 함께 실리카 입자의 핵산 바인딩 속성을 사용합니다. 방법 4 . <p class=대변​​ 표본, 다른 목표를 활용하여 여러 RT-PCR 프로토콜에서 NoVs의 분리의 탐지 및 genogrouping (GI과 GII)은 &quot;jove_content&quot;&gt;이 개발되었습니다. 합의는 높은 감도, 특이성과 높은 처리량과 편리한 사용과 재현성을 결합하므로 TaqMan 화학을 사용하여 RT-PCR이 진단에 가장 적합한 분자 기법 될 것입니다. 여기 열린 독서 프레임 1 (ORF1) ORF2 접합 영역을 대상으로 분석을 설명, 진단 따라서 가장 보존 월의 게놈의 지역과 가장 적합합니다. 추가로 유전자 분석 capsid (지역 C) 원래 코지마 외 의해 설명되어 primers를 사용 5.의 주요 단백질에서 높은 변수 N-터미널 - 껍질을 대상으로 기존의 RT-PCR의 경우 상세하게됩니다. 종래의 PCR에서 PCR 제품의 시퀀싱하면 GI과 GII의 genogroups에 속하는 genotypes의 차별을 가능하게합니다.

primers와 열린 독서 프레임 1 (ORF1) ORF2 접합 영역입니다 노로 바이러스의 게놈 중 가장 보존 지역에 대한 구체적인 TaqMan 프로브를 이용하여 아이들의 stools에서 탐지 및 노로 바이러스의 분리의 genogroup 식별을위한 원 - 스텝 RT-PCR 분석 설명했다. 비상업적인 비용 효율적인 RNA 추출 방법을 자세히 설명하고 있습니다.

Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

노로바이러스(Noroviruses, NoVs)는 전 세계 모든 연령대의 인간에게서 발생하는 산발적 급성 위장관염 유행의 주요 원인입니다. 이들은 ...의 중요한 원인이 됩니다.

특이적 TECHMAN 프로브를 이용한 1단계 실시간 R-T-P-C-R을 통한 추출된 RNA 내 Neurovirus 검출입니다. 오늘은 Neurovirus에 대해 알아보겠습니다. 이곳은 페루 리마에 위치한 대학 연구팀과 존스 홉킨스 대학교의 협력 연구 그룹입니다.노로바이러스는 아마도 가장 간과된 설사 유발 원인 중 하나인 것으로 밝혀졌습니다. 저희 연구팀은 노로바이러스가 어린이 설사로 인한 입원 건수와 인구 기반 설사 발생 건수 모두에서 코로나바이러스 다음으로 높은 비중을 차지한다는 것을 발견했습니다. 그렇다면 왜 노로바이러스는 이전에 진단되지 않았던 것일까요?그 이유는 이것이 RNA 바이러스이며 배양이 불가능하기 때문에 진단을 위해 특수한 분자생물학적 방법이 필요하기 때문입니다. 우리가 사용하는 방법은 RT-PCR이며, 본 영상에서는 노로바이러스 진단을 위해 RT-PCR을 어떻게 사용하고 진단하는지를 보여줄 것입니다. 내부 Ciag GUINE 방법(boom et al. 1989)에 따라, 대변 샘플에서 바이러스 RNA를 추출하기 위해 내부 G guine ATE 방법을 사용하였습니다.본 방법은 상용 ca amp 바이러스 RNA 키트를 대체할 수 있는 방법입니다. 두 방법 모두 실리카 입자의 핵산 결합 특성을 기반으로 합니다. G Guad Dium Bio NA의 항핵산분해효소 특성과 결합하여 RNA 추출을 위한 실리카 현탁액을 준비합니다.실리카 입자를 제조하려면, 이산화규소 30 g을 취하고 탈이온수 250 mL를 가한 후 흔들어 실리콘을 현탁시킵니다. 24시간 동안 침전시킨 후, 상층액 215 mL를 제거하고 탈이온수 250 mL를 흡입하여 분주한 다음, 다시 흔들어 실리콘을 현탁시킵니다. 다시 24시간이 지난 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 염산을 사용하여 실리카 현탁액의 pH를 pH 2.0으로 조정합니다. 실리카 현탁액을 유리병에 담고 g guin 및 실리카와 함께 오토클레이브로 추출합니다.이제 이전 단계에서 준비한 실리카 입자를 이용하여 바이러스 RNA를 추출해 보겠습니다. 사용 전까지 -70°C에서 보관하십시오. 10% 분변 현탁액을 만들려면, 추출 전 약 0.1g의 대변을 취해 1mL의 PBS로 희석하십시오.하단 부하 샘플을 5초 동안 볼텍싱한 후 4,000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 각 반응에는 양성 대조군으로서 neurovirus 양성 대변 샘플과 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 DEPC 처리수를 사용합니다. L6 버퍼 1 mL, 준비된 실리카 입자 20 µL 및 분변 추출물 200 µL를 혼합합니다.잠시 동안 Vortexing하고 샘플을 실온에서 15분 동안 방치합니다. 15초 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠렛을 buffer L two로 두 번 세척하고, 70%ethanol로 두 번 세척한 뒤, acid on으로 한 번 세척합니다.건조 가열 블록에서 펠렛을 56°C로 5분간 건조합니다. RNA-free 증류수 50 µL를 첨가하여 실리카 펠렛 내의 RNA를 수화합니다. RNA sin 1 µL를 첨가하고 vortexing한 후 56°C에서 15분간 둡니다.최대 속도로 3분 동안 원심 분리한 후 RNA가 포함된 상층액을 수집합니다. non drop 기법을 사용하여 샘플을 정량하고, 추출된 RNA는 -70 °C에서 보관하십시오. 상용 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하십시오.이제 시판되는 kay amp viral RNA 키트를 사용하여 분변에서 RNA를 추출하는 방법을 시연하겠습니다. 이 키트는 실리카 겔 MinPin 컬럼 버퍼, A-V-L-A-W 1, W2, A VE 및 leafly carrier RNA를 포함하고 있습니다. 간략한 절차는 다음과 같습니다.버퍼 A VL의 일부를 운반체 RNA와 혼합하고 볼텍싱합니다. 1.5밀리리터 튜브에 분변 현탁액 114µL와 해당 용액을 넣고 볼텍싱하여 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다. 샘플을 짧게 원심분리합니다.샘플에 에탄올을 첨가하고 15초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 그 후 짧게 원심분리하고, 용액을 2mL 컬렉션 튜브에 장착된 스핀 컬럼에 넣습니다. 원심분리합니다.그런 다음 스핀 컬럼을 새로운 수집 튜브에 넣습니다. 캐리어 RNA가 없는 버퍼 AW1을 사용하여 결합된 RNA와 함께 컬럼을 세척하고 원심 분리합니다. 컬럼을 깨끗한 2 mL 수집 튜브에 넣고 버퍼로 컬럼을 세척합니다.W2 원심분리기를 최고 속도로 가동하며, 핀 컬럼을 깨끗한 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 최고 속도로 원심분리합니다. Buffer AE를 사용하여 RNA를 용출시키고, 바이러스 RNA는 사용 전까지 minus 70 degrees Celsius에서 보관합니다. 추출된 RNA 내 노로바이러스의 검출은 특정 TaqMan 프로브를 이용한 one step real time PCR로 수행합니다. genotype I 및 genotype II를 위한 마스터 믹스를 제조하며, 분석하는 동안 RT enzyme 믹스는 얼음 위에 보관하십시오. 키트 구성품은 다음과 같습니다: PCR water, 마스터 믹스, 2x 프라이머 및 프로브.UniGroup 1을 위한 그룹 1 프라이머와 프로브, 그리고 UniGroup 2를 위한 그룹 2 프라이머와 프로브를 준비합니다. 마지막으로, 사용 전 RT mix 효소 시약을 볼텍스합니다. PCR 용수, 2X 마스터 믹스, UniGroup 1용 정방향 및 역방향 프라이머(coke G1 forward and reverse) 및 프로브(ring one A 및 one B)를 혼합합니다. 마스터 믹스와 UniGroup 2용 정방향 및 역방향 프라이머(COG G2 forward and reverse) 및 프로브를 혼합합니다.Theo 그룹 2 마스터 믹스를 위해 두 번째 튜브를 준비합니다. 마지막으로, 두 INO 그룹 마스터 믹스 모두에 enzyme artix를 첨가합니다. 볼텍싱한 후, 각각의 반응 웰에 적절한 마스터 믹스 10 µL를 분주합니다.다른 캐비닛의 해당 반응 휠에 희석하지 않은 RNA 5 µL, G1 및 G2 양성 대조군 RNA 5 µL, 그리고 음성 대조군 5 µL를 각각 추가합니다. 6,000 g에서 10초 동안 원심분리합니다. 1단계 소프트웨어에 고급 설정이 표시됩니다.실험 속성 화면에서, 해당 실험은 norovirus로 식별됩니다. 실험 유형은 타겟 화면의 존재 여부(presence or absence)입니다. PCR 반응 플레이트에서 검출하고자 하는 타겟의 이름을 입력하십시오.Gina, 그룹 1 및 2 리포터 fam과 퀀처 Tamara를 샘플 및 반복 실험 화면에 설정하십시오. 반응 플레이트에 포함된 샘플 수와 양성 및 음성 대조군 수를 입력한 다음, 런 방법(run method)에서 설정할 샘플 또는 표적 방향을 선택하십시오. 먼저, 상보적 DNA 합성을 위해 50 °C에서 역전사를 수행하십시오.그 다음, 핫 스타트 중합효소를 활성화하기 위해 온도를 95°C로 올립니다. 95°C에서 일정 시간 동안 사이클링을 시작하고, 이어서 60°C에서 변성과 증폭 단계를 결합하여 진행합니다. 이 사이클링을 4~5회 반복한 후 플레이트 설정 단계로 돌아갑니다.템플릿 저장(save a template)을 클릭하고 실험을 저장합니다. 실행 시작(start run)을 클릭합니다. 증폭 플롯 화면에서는 기기가 실행 중 고정된 데이터를 수집함에 따라 샘플의 증폭 양상과 플롯 대비를 확인할 수 있습니다.정규화된 다이브 형광 및 사이클 횟수. PCR의 초기 사이클에서는 형광 신호의 변화가 거의 없습니다. 이것이 베이스라인을 정의합니다.기선(baseline) 대비 형광 강도의 증가는 축적된 표적의 검출을 나타냅니다. 기선을 기준으로 고정된 형광 임계값을 설정해야 합니다. CT(임계 주기) 매개변수는 형광 신호가 설정된 임계값을 통과하는 시점의 소수점 단위 주기 횟수로 정의됩니다.증폭 곡선 화면은 음성 대조군 웰에서 형광 수치가 증가하거나 예상 사이클에서 검출 가능한 형광이 나타나지 않는 것과 같은 비정상적인 증폭을 식별하고 검토하는 데 유용합니다. 키트 방식은 신뢰할 수 있지만, 막대한 양의 시간과 자원이 소요됩니다. 본 연구에서는 비용 효율적이며 국내에서 쉽게 구할 수 있는 시약을 사용하여 해외 구매 재료에 대한 의존도를 낮춘, 동일하게 신뢰할 수 있는 방법을 제시하였습니다. 이는 궁극적으로 소아 위장관염의 가장 흔한 바이러스성 원인에 대해 더 접근성 높은 진단과 신속한 치료로 이어질 것입니다. 기존 방식과 유사한 결과를 얻은 경제적인 자체 핵산 분리법을 사용하여 이를 수행하였습니다.Kerogen의 상용 키트와 본 실험실에서 개발한 TAC MAN, R-T-P-C-R을 통해 얻었습니다. 이를 통해 광범위한 신경바이러스 감염을 검출할 수 있습니다. 이 분석법은 증폭 후 생성물 처리 과정을 없애 분석 시간을 단축하므로 루틴 진단에 유용한 것으로 입증되었습니다.진단 외에도, 이 프로토콜은 신경바이러스 감염의 역학을 규명하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 이 질병의 공중 보건 제어에 유용합니다.

detection-genogrouping-noroviruses-from-children-s-stools-taqman-one

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

여기에서는 Buffalo Green Monkey 신장 세포주를 사용하여 총 배양 가능한 바이러스를 측정하는 절차를 제시합니다. 이 절차는 환경 및 음용수에서 감염성 바이러스의 발생을 측정하기 위한 표준화된 도구를 제공합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

환경적으로 단단한 표면에서 노로바이러스를 검출하고 정량화하기 위해 매크로폼 기반 샘플링 방법론이 개발되고 평가되었습니다.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

반전 녹음 방송 (실시간 정량)와 함께 하는 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 분석은 RNA 바이러스 감염의 수준을 측정 하 널리 사용 되었습니다. 여기는 직접 실시간 정량 분석 결과, 뎅기열 바이러스를 포함 하 여 여러 RNA 바이러스의 정량화에 대 한 개발 하는 RNA 정화 단계를 필요 하지 않는 선물이.

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

이 프로토콜 tilapia 조직 RT PCR 방법론을 사용 하 여에 Tilapia 호수 바이러스 (TiLV)를 진단 한다. 전체 메서드 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 기존의 PCR 또는 양이 많은 PCR dsDNA 염료를 형광 바인딩 바인딩을 사용 하 여 TiLV의 탐지를 조직 해 부에서 설명 되어 있습니다.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

여기 두 개의 프로토콜 특정 성장 율 및 상 패 분석 결과 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여로 타 바이러스의 셀 바인딩 기능에 대 한 다른 측정 한 선물이. 이러한 프로토콜으로 타 바이러스 변종 고기에 차이 확인 수 있습니다.

특정 성장 속도로 타 바이러스의 세포 바인딩 기능에 대 한 분석

이 프로토콜은 정량적 중합효소 연쇄 반응과 결합된 비침습적 대변 샘플링을 사용하여 헬리코박터 파일로리 감염 및 클라리스로마이신 및 퀴놀론에 대한 내성에 대한 편리하고 신속한 진단 방법을 제공합니다.

대변 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 검출

양적 실시간 중합 효소 사슬 반응 (qPCR)는 종양 샘플에서 여러 microRNA의 표현 수준 (miRNA) 분자를 조사하기 위해 신속하고 민감한 방법입니다. 다른 miRNA 분자의 수백이 메서드 표현식을 사용하면, 증폭 계량, 같은 cDNA 템플릿에서 분석할 수 있습니다.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

학습하세요 TaqMan 프로브를 이용한 일단계 RT-PCR으로 어린이 대변에서 Norovirus를 검출하고 유전자군을 분류하는 방법을. 이 기술은 소아 감염병 진단 및 역학 연구에 활용됩니다.

Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

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