소설을 사용하여 척수 상해 후에 마우스 뒷다리 뼈 손실의 세로 평가, 생체내에 방법론

본 절차는 척수 손상 후 마우스의 뒷다리 골밀도가 시간에 따라 감소하는 것을 검출하고 정량화하는 새로운 방법을 보여줍니다. 이는 먼저 멸균 및 ALAC 승인 조건 하에 마취된 마우스에게 척수 절단 손상을 유발함으로써 수행됩니다. 이후 회복 기간을 거쳐 동물을 다시 마취하고, 좌우 양쪽 뒷다리의 경골과 비골의 X선 영상을 획득합니다.

이 과정은 부상 후 40일까지 매주 수행됩니다. 다음으로, X선 스캔 이미지 분석을 실시합니다. 마지막 단계는 적출한 뒷다리 뼈의 골밀도에 대해 사후 평가를 수행하는 것입니다.

최종적으로, 결과는 척수 손상이 마우스의 뒷다리에서 골밀도의 급격하고 점진적인 손실을 어떻게 유도하는지 보여줍니다. 이 새로운 방법은 다른 영상 기법보다 낮은 선량의 x-ray를 사용하여 강력한 공간 및 시간 분해능을 제공합니다. 골다공증은 척수 손상을 겪는 이들에게 나타나는 생명을 위협하는 질환입니다.

본 연구에서 제안하는 것은 척수 손상 동물 모델 연구에 적용될 수 있는 새로운 방법으로, 연구자가 장기간에 걸쳐 골다공증과 관련된 골 손실 과정을 종단적으로 추적할 수 있게 합니다. 이는 두 가지 이유로 중요합니다. 첫째, 이를 통해 골다공증의 발생 기전을 연구할 수 있는 기회를 제공하기 때문입니다.

두 번째로, 이 방법은 척수 손상을 입은 환자에게서 골다공증의 발생을 예방하거나 혹은 되돌리기 위해 설계된 새로운 중재법을 테스트할 수 있는 수단을 제공합니다. 이 방법은 척수 손상 유발 골다공증에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 폐경 후 여성에게 발생하는 연령 관련 골손실이나 기타 외상성 골밀도 감소, 고립으로 인한 사지 불사용 등과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있으며, 골절이나 기타 손상 이후 회복 과정에서 상당한 골손실이 발생할 수 있습니다. 전신 동물 종단 저선량 X-선 영상을 적용함으로써 이러한 문제들을 최소화하거나 예방하기 위해 설계된 치료법 개발의 새로운 경로를 제시할 수 있습니다.

Sander 절차에 따라 척수 손상 수술을 수행하며, 해당 기관의 동물 실험 윤리 위원회 가이드라인을 준수하십시오. 그 후 척수 수술 후 10일째부터 시작하여 40일까지 10일 간격으로 계속 진행합니다. 마취된 척수 절단 손상 동물과 연령이 일치하는 비손상 대조군의 좌우 대퇴골 및 경골을 ivus Lumina XR 시스템으로 스캔하여 평가하십시오. 스캔 전에는 Lumina XR 장치를 초기화하여 내부 카메라가 작동 온도인 -90 °C에 도달하도록 하십시오.

마취된 동물을 Lumina xr 내부의 플랫폼 위에 놓습니다. 그런 다음 고배율 렌즈를 삽입하여 대퇴골과 경골 영역 모두에 초점을 맞춥니다. 피험체가 시야 내에 적절하게 위치해 있는지 확인합니다.

필요한 경우, 도어를 열고 동물의 위치를 다시 조정하십시오. 동물의 적절한 배치 방법이 여기에 표시되어 있습니다. 적절하게 배치되면 X-선 기능을 실행할 수 있습니다.

에너지 드롭다운 목록에서 동물에 적합한 항목을 선택하십시오. 그 다음 제어 패널을 엽니다. x-ray 항목에 체크하여 x-ray 기능을 활성화하고, x-ray 이미지를 획득하십시오.

여기서 보는 것과 같이 대퇴골과 경골 전체가 보여야 합니다. 생체 이미징 소프트웨어는 기본적으로 보정된 X선 이미지를 표시하므로, 보정 필터링 도구 메뉴에 들어가 X선 흡수(x-ray absorption) 옆의 체크 표시를 해제하여 원본 X선 이미지가 표시되도록 하십시오. 원본 이미지 데이터는 하드 드라이브에 자동으로 저장됩니다.

대표 TIFF 파일 또한 저장합니다. 이미징 후, 마우스를 원래의 케이지로 옮기고 연구자의 관찰 하에 회복하도록 합니다. 이후 다음 마우스를 대상으로 동일한 과정을 반복합니다.

먼저, 나타나는 대화 상자에서 living image 아이콘을 더블 클릭하여 소프트웨어를 엽니다. 원하는 폴더를 선택하고 확인을 클릭하십시오. 찾기(browse) 버튼을 클릭하여 x-ray 이미지를 불러옵니다.

라이브 이미지 브라우저에는 사용자 ID와 함께 선택된 데이터가 표시됩니다. 레이블 정보 및 카메라 설정 정보가 포함됩니다. 데이터를 열려면 데이터 행을 더블 클릭하십시오. 이미지와 도구 팔레트가 표시됩니다.

브라우저에서 오픈 데이터가 파란색으로 강조 표시됩니다. 다음으로 ROI tools를 클릭하십시오. ROI tools의 도구 팔레트에서 type 드롭다운 목록을 열고 measurement ROI를 선택하십시오.

본 실험에 사용되는 세 개의 ROI를 불러오려면 사각형 아이콘을 클릭하고 사각형을 불러오십시오. 자를 사용하여 대퇴골의 길이를 측정한 후, 두 사각형의 길이를 전체 대퇴골 길이의 1/8이 되도록 조정하십시오. 사각형의 너비는 전체 대퇴골 길이의 1/24이 되도록 조정하십시오.

이제 자를 사용하여 근위 대퇴단(proximal femur end)에서 거리의 1/8 지점을 측정하고, 그 위치에 첫 번째 직사각형이 중심이 오도록 배치합니다. 두 번째 직사각형은 원위 대퇴단(distal femur end)으로 이동시켜 무릎의 소주 구역(trabecular region) 중앙에 위치하도록 배치합니다. 그런 다음 경골(tibia)의 길이를 측정합니다.

박스의 길이를 전체 경골 길이의 1/8로 조정하십시오. 너비는 전체 경골 길이의 1/30로 조정하십시오. 마지막으로, 여기 보이는 것처럼 박스가 중앙에 위치하고 근위 경골 끝에서 전체 경골 길이의 1/8 거리만큼 떨어지도록 배치하십시오.

다음으로 측정 아이콘을 클릭하면 X선 이미지에 ROI 강도 측정값이 표시되고 ROI 측정 표가 나타납니다. 이 표를 원하는 위치에 dot CSV 파일로 내보냅니다. 이렇게 하면 해당 표를 Excel에서 열 수 있습니다.

분석할 모든 저장된 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다. 마지막으로, 모든 데이터를 하나의 Excel 시트로 통합합니다. 통계적 유의성은 Microsoft Excel 또는 Sigma Plot 11.0 소프트웨어와 같은 소프트웨어를 사용한 Student's T-test로 결정하며, 원하는 경우 이 방법의 표준 프로토콜을 활용하여 이중 에너지 X선 흡수 계측법(dual energy x-ray absorb geometry)을 통한 골밀도의 사후 분석 결과와 비교할 수 있습니다.

위의 방법을 통해 척수 손상 후 생쥐의 경골 및 대퇴골에서 나타나는 상대적인 골밀도 감소를 정상 대조군 생쥐와 비교하여 검출할 수 있습니다. 이 그림은 척수 손상 후 10, 20, 30, 40일째의 근위 경골에서 나타나는 골밀도 감소를 보여줍니다. 연령이 일치하는 정상 대조군과 비교했을 때, 손상 후 단 10일 만에 경골 골밀도가 12% 유의하게 감소했으며, 40일째에는 골밀도 감소가 최대 15%까지 나타났습니다.

여기서는 척수 손상 후 10, 20, 30, 40일째의 근위 대퇴골 골밀도 감소를 확인할 수 있습니다. 연령이 일치하는 대조군(naives)과 비교했을 때, 손상 후 40일째에 근위 대퇴골의 골밀도가 7% 감소한 것이 관찰되었습니다. 이 그래프는 척수 손상 후 10, 20, 30, 40일째의 원위 대퇴골 골밀도 감소를 보여줍니다.

연령이 일치하는 일반 대조군과 비교했을 때, 대퇴골 원위부의 골밀도 감소는 부상 후 이르면 10일째부터 관찰되었으며 실험의 나머지 기간 동안 지속되었습니다. 이 이중 에너지 X선 흡수 계측법(DXA) 기하학적 데이터의 대표 이미지는 골미네랄 함량과 골미네랄 밀도 결과값을 보여줍니다. 적출된 대퇴골은 척수 손상 40일 후에 분석되었습니다.

본 프로토콜에서 제시한 방법의 효능을 현재 사용 가능한 다른 방법들과 비교하기 위해, 이 그림은 척수 손상 후 40일이 경과한 생쥐와 연령이 일치하는 대조군 생쥐의 대퇴골 내 골무기질 함량(g)에 대한 이중 에너지 X선 흡수 계측법 분석 결과를 보여줍니다. 대조군과 비교했을 때, 척수 손상 생쥐에서 골무기질 함량이 12% 유의미하게 감소한 것이 관찰되었습니다.

여기서는 척수 손상 후 40일이 지난 마우스와 연령 및 성별이 일치하는 대조군 마우스의 대퇴골 내 골밀도를 mg/cm² 단위로 분석한 이중 에너지 X선 흡수 계측법(DXA) 결과가 제시되어 있습니다. 골밀도 감소는 통계적으로 유의미한 변화를 보이지 않았으나, 골함량과 유사한 경향을 따랐습니다. 숙련된 경우 이 과정은 20~30분 내에 완료할 수 있으나, 뒷다리를 적절하게 배치하는 것이 중요하다는 점을 유의하시기 바랍니다.

이 영상을 시청한 후, Caliper Instruments Lumina XR 장비를 사용하여 척수 손상 후 골밀도에 대한 살아있는 동물의 종단적 평가를 수행하는 방법에 대해 파악하게 될 것입니다.