Name: 나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 학습하세요 나이프-에지 스캐닝 현미경(KESM)을 이용한 생물학적 표본의 고정, 염색, 포매 및 이미징 방법을 통해 마우스 뇌의 신경 및 혈관 네트워크를 아토미터급 해상도로 시각화하는 기술을.

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이 프로젝트는 NSF (# 0905041, # 0079874), 텍사스 고급 기술 프로그램 (# ATP - 000512-0146 - 2001, # ATP - 000512-0261 - 2001), 텍사스는 (# 1R01 - NS54252) NIH / NINDS에 의해 투자되었다 A &amp; M 학술 진흥 재단, 텍사스 A &amp; M 대학, 3Scan에서 컴퓨터 과학 및 공학과. 우리는 기술 상담 KESM 장비에 대한 지원 버나드 메사 (마이크로 스타 기술)을 감사드립니다. KESM의 설계 및 구현의 주요 부분이 2007 년 사망 브루스 H. 맥코믹에 의해 수행되었다.

1. 표본 준비 : 잠돌군 Zz - 콕스 <ol><li> 이 프로토콜은 밀접하게 Mayerich 외의 프로토콜. 7을 따릅니다. </li><li> C57BL/6J 마우스 isoflurane 흡입 마취를 사용하여 깊은 anesthetized하고 다음 참수. </li><li> 두뇌는 잠돌군 Zz - 콕스 고정 솔루션 (1 % 칼륨의 크롬, 1 % 칼륨 dichromate, 그리고 탈이온수에 1퍼센트 mercuric 염화)로 제거하고 배치됩니다. </li><li> 두뇌는 10~16주 동안 상온에서, 어둠 속에서 잠돌군 Zz - 콕스 솔루션에 남아있다. </li><li> 두뇌는 어둠 속에서 밤새 탈이온수에 씻어서 있습니다. </li><li> 씻어서 두뇌는 상온에서 어둠 속에 7-10일 위해 탈이온수에 5 % 수산화 암모늄 용액에 포장되어 있습니다. 이 긴 준비 시간은 검은 침전물이 완전히 조직 형태에 대한 기회가되도록, 전체 두뇌의 침투를 보장하는 것이었다. </li><li> 두뇌는 4 시간 t에 대한 실온에서 탈이온수 다시 씻어서입니다실온에서 50 % 70% 냉장고 (4 ° C)에서 85 %, 95 % (3 변경) 및 100 % (4-5 변경) : 등급 에틸 알콜의 시리즈를 통해 탈수 암탉. 두뇌는 24 시간 동안 각각의 용액에 남아 있습니다. </li><li> 탈수 두뇌는 다음 1시 2분의 araldite - 투 - 아세톤 비율 1시 1분, 2시 1분, 마지막에있는 araldite - 아세톤 혼합하여 다음 (3-4 변경, 하루마다) 아세톤에 들어가게된다 냉장고에 100 % araldite (3 변화, 하루 때마다), (4 ° C). </li><li> 마지막으로 치료 두뇌는 100 % araldite에 포함된 및 ° C 삼일 (애보트와 Sotelo 2를 참조하라의 내장 프로토콜)에 대한 60 가열합니다. 표본은 LR 화이트에 포함된 경우 다음 표본 전에 중합에 대한 표준 절차 각 하룻밤 냉장고에 보관 LR 화이트 솔루션의 세 변화를 통해 지난 100 % 에탄올 용액에서 전송됩니다. 세 가지 변경 사항은 전체 침입을 보장하기 위해 수행됩니다. 표본은 t이다60 닫힌 용기에 polymerized는 신선한 LR 화이트로 전송 암탉 ° 적절한 중합 시간 및 온도의 필요한 금액 24 시간 C,. </li><li> 그림. 1 Araldite에 포함된 잠돌군 Zz - 콕스 묻은 머리를 보여줍니다. </li><li> 완치 표본 블록은 다음 에폭시를 사용하여 금속 표본 링에 장착하고, 블록의 측면은 (그림을 참조하십시오. 2) 필요로 손질합니다. </li></ol> 2. 표본 준비 : Nissl <ol><li> 마우스 케타민을 및 xylazine (1.7 MG 케타민을 / 20g의 체중 당 0.26 MG의 xylazine) 주입 intraperitoneally를 사용하여 깊은 anaesthetized하고 다음 transcardially 실온 50 ML을 사용 perfused 인산 버퍼 객실 250 ML 다음 염분을 (산도 7.4) 온도 중립 10 % (산도 7.4) 포르말린을 버퍼. 그리고 마지막으로 undiluted 인도 잉크의 3.0 CC와 함께. </li><li> 염분과 정착액과 함께 온몸 재관류는 심장 혈관 시스템에서 혈액을 취소하고 TI를 해결하는 데 필요한 ssues. 인도 잉크와 재관류 완전히 심장 혈관 시스템의 vasculature을 채우기 위해 필요합니다. </li><li> 그 결과 뇌는 등급 에틸 알콜 (25 % -100 %)의 시리즈를 통해 다음 탈수하고 다음 위의 1.8-1.9에서 다음과 같은 프로토콜 araldite 플라스틱에 포함된. LR 화이트 포함 매체있다면 위의 1.10의 프로토콜은 다음입니다. </li></ol> 4. 표본 준비 : 일반 종, 일반 기관 <ol><li> 일반적인 경우를, 고정가 중 10% 중성 포르말린 버퍼 또는 4 % paraformaldehyde로 할 수 있습니다. </li><li> 작은 조직 볼륨 대신 재관류의 보급은 고정 및 얼룩을 권장합니다. 작은 생물이나 기관의 경우도 얼룩은 탈수 과정에서 할 수 있습니다. </li><li> 솔루션 침투를위한 시간이 기관 또는 전체 마우스 뇌보다 훨씬 작은 생물에 대한 줄일 수 있지만 내장 프로토콜은 상기와 동일합니다. </li></ol>jove_title "&gt; 5. KESM 설정 및 이미징 <ol><li> 펌프를 끄고, 무대 설정 카메라 설정, 조명기 켭니다. </li><li> 나이프와 목적을 올립니다. </li><li> 표본 반지를 설치합니다. </li><li> 측정 표본의 크기와 KESM 스테이지 Controller2 응용 프로그램 구성 파일을 만듭니다. </li><li> KESM 단계 Controller2를 시작하고 무대를 초기화합니다. </li><li> 낮은 칼 / 목표, 펌프를 켜십시오. </li><li> 광학 기차에 초점 노브를 돌려 칼날에 상대적인보기의 카메라의 필드를 조정하여, 객관적이고 카메라를 중점을두고 있습니다. </li><li> 이미징을 시작 [이동]을 누르십시오. </li><li> 참조은 무화과. 3-8. 기술적인 세부 9, 7을 참조하십시오. </li></ol> 6. 영상 처리 및 데이터 준비 <ol><li> 설정 파일 폴더 (00000, 00001 등)에서 데이터 폴더로 KESM 스택 프로세서 실행 파일을 복사합니다. </li><li> 조명 유물을 제거하고 모든 배경 강도를 정상화하기 위해 KESM 스택 프로세서를 실행이미지를 표시합니다. 모든 데이터 하위 폴더에 대한 반복합니다. </li><li> 데이터 multiscale 타일을 준비 설정하고 업로드하고 KESM 두뇌 아틀라스 웹 서버에있는 파일을 설정합니다. </li><li> 그림을 참조하십시오. 9. </li></ol> 7. 데이터 시각화 및 분석 <ol><li> KESM 뇌 아틀라스를 사용하여 시각화. 이동 <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> 하고 해당 아틀라스를 선택합니다. <ol><li> Google지도에서와 같이 이동합니다. </li><li> Google Maps에로와 축소. </li><li> [-] Z 깊이를 증가 또는 감소에 다른 깊이로 이동하려면, 중 [+] 또는 누른 다음 풀다운 메뉴에서 각각의 단계에서 이동하는 방법에 깊이를 선택합니다. </li><li> 풀다운 메뉴를 사용하여 오버레이 번호를 조정합니다. </li><li> 풀다운 메뉴를 사용하여 오버레이 간격을 조정합니다. </li><li> 그림을 참조하십시오. 11. </li></ol></li><li> MeVisLab를 사용하여 시각화. <ol><li> MeVisLab를 시작합니다. </li><li> 새 프로젝트를 만듭니다. </li><li> 다음에, 새로운 모듈을 타이로 만들 수 있습니다명령 상자에서 모듈 이름으로 Ping을 실행합니다. </li><li> 생성 모듈 [Compose3Dfrom2DFiles], 그리고 원하는 폴더로 이동합니다. 파일 문자열을 입력하고 [GetFileList]을 클릭합니다. 선택된 이미지가 메모리에 들어갈 수 있는지 확인하십시오. 클릭하여 [Create3D]는 볼륨을 만들 수 있습니다. </li><li> 생성 모듈 [SetWorldMatrix] 아래에 "크기 조정"을 설정 해당 voxel 크기 (0.6, 0.7, 10X 0.45NA 목적을 위해 1.0)로 X, Y, Z "를 초등학교가 변환". 링크 [Compose3Dfrom2DFiles]을 [SetWorldMatrix]. </li><li> 매트릭스를 설정하고 "앞으로", "무시", "무시"를 "매트릭스 구성"아래 변환. </li><li> 생성 모듈 [Arithmetic1]와 "(맥스 IMG) 반전"에 "기능"을 설정합니다. 링크 [SetWorldMatrix]을 [Arithmetic1]. </li><li> 생성 모듈 [View3D] 및 [Arithmetic1]를 연결합니다. </li><li> View3D에서 마우스 오른쪽 버튼을 누를 동안 임계값을 조정 주위 마우스를 이동합니다. 당신은 지역 변경 방향 (왼쪽 마우스 버튼을 누를있는 동안 마우스 이동), 변경 조명을 (볼륨 renderin 작물 수 있습니다G 또는 MIP) 등에 / 배경 해제 </li><li> 그림을 참조하십시오. 10. </li></ol></li></ol> 8. 대표 결과 : 여기, 우리는 전체 - 뇌 데이터와 정보를 제시한다. 무화과. 12-15보기 전체 - 뇌 인도 잉크, 잠돌군 Zz, 그리고 Nissl 데이터는 1, 4, 3을 설정합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1., 고정 스테인드 및 임베디드 마우스 뇌 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 임베디드 마우스 뇌 표본은 표본 링에 장착. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 나이프 에지 스캐닝 현미경 (KESM). KESM의 사진은 자사의 주요 구성 요소가 표시와 함께 표시됩니다 : (1) 고속 라인 스캔 카메라 (2) 현미경의 목적, (3) 다이아몬드 나이프 어셈블리 및 조명 콜리 메 이터를 (4) specimen 탱크 (물 침지 영상에 대한), (5) 세 축 정밀 에어 베어링 스테이지 (6) 흰색 가벼운 현미경 조명기, sectioned 조직의 제거 (7) 펌프 (뒤쪽), (8) 무대 제어 및 이미지 수집, (9) 화강암베이스, 그리고 (10) 화강암 다리를 PC 서버. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. KESM의 이미징의 원칙. KESM 운영의 주요한는 그림입니다. 객관적이고 나이프는 (폭 5mm 표본 20 NM 및 1-5의 여행 속도의 해상도에서 위치 단계 이동 (실선과 화살표)에 부착된 동안 장소에서 개최되며, 다이아몬드 나이프에 대한 스크랩한 도착 10X 목적을 위해), 칼 (실선과 화살표)를 통해 흐르는 얇은 섹션을 생성. 라인 스캔 영상은 칼로의 매우 끝 가까이에 이루어집니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. KESM 카메라와 목표를 중심으로 제어합니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. KESM 나이프 어셈블리 및 제어합니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 관측 포트를 통해 초점을 초기. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 8"> 그림 8. KESM 스테이지 컨트롤러 2 응용 프로그램 (스크린샷). <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 9"> 그림 9. KESM 스택 프로세서 응용 프로그램 (스크린샷). <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 10"> 그림 10. MeVisLab 응용 프로그램 (스크린샷). <img alt="그림 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 11"> 그림 11 KESM 뇌 아틀라스 :. 웹 인터페이스 (스크린샷). <img alt="그림 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 12"> 그림 12. KESM 전체 - 뇌 인도 잉크 데이터입니다. KESM 데이터 스택의 볼륨 시각화는 혈관 데이터 집합에 대한 표시됩니다. (A) 클로즈업 혈관 데이터. 폭 ~ 100 음. 전체 마우스 뇌 vasculature의 (BD) 3 표준보기 (고해상도 데이터 subsampled). 너비는 10mm ~. <img alt="그림 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 13"> 그림 13. KESM 전체 - 뇌 마우스 잠돌군 Zz 데이터입니다. <img alt="그림 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 14"> 그림 14. KESM 잠돌군 Zz 데이터 세부 사항. <img alt="그림 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 15"> 그림 15. KESM 전체 - 뇌 Nissl 데이터입니다. (A) 클로즈업 N의issl 데이터가 없습니다. ~ 300 음 3. 전체 마우스 뇌 Nissl 데이터 (BD) 3 표준보기 (고해상도 데이터 subsampled). 크로스 섹션은 내부 구조의 명확한 보려면 표시됩니다.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

토드 호프만은 3Scan, KESM 기술 (미국 특허 # 6,744,572)를 제조하고 시장에 상업적인 회사입니다.

KESM은 생물 학적 표본 (~ 1cm 3) 대량의 submicrometer 수준의 조사를 허용합니다. 볼륨의이 종류가 같은 뇌, 폐, 심장, 신장 등 모든 작은 동물 장기를 가질 정도이며, 등 이러한 기관의 구조 조직에 대한 전례없는 양적 정보를 제공하고, 다양한 기능의 전산 모델링을 활성화할 수 같은 기관에서 이미지를 검색 회로 및 네트워크 역학, 전기적 특성, 유체 및 공기 흐름 역학, 그리고 근육의 역학을 포함하여 이들 기관의 측면. 이 문서에서 자세한 표본 준비 프로토콜 및 사후 분석 프로토콜 KESM에 쉽게 액세스하여 결과 데이터를 가지고 외부 연구 그룹을 도울 것으로 예상된다. KESM 작업 프로토콜이 독특한 이미징 양상의 장점과 제한 사항을 감사하기 위해 이러한 외부 연구자 도움이 될 것입니다.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

높은 처리량, 높은 해상도, 3D 현미경 기술의 주요 발전 submicrometer 해상도 neuroanatomical 큰 데이터 볼륨의 인수를 사용할 수있다. 전체 - 뇌 규모의 데이터를 생산 최초의 악기 중 하나는 나이프 - 에지 스캐닝 현미경 (KESM) 7, 5, 9, 개발 및 저자의 실험실에서 호스팅됩니다. KESM는 복잡한의 연결 네트워크의 세부 사항 (잠돌군 Zz) 1, 4, 8, 혈관 네트워크 (인도 잉크) 1, 4, 및 세포 본문 배포 (Nissl) 3 공개, 섹션 및 submicrometer 해상도에서 이미지 전체를 마우스 뇌에 사용되고 있습니다 . KESM의 사용은 마우스이나 두뇌에 제한되지 않습니다. 우리는 성공적으로 문어의 두뇌 6, 마우스 폐, 및 쥐 두뇌를 몇 군데있다. 현재 전체 제브라 다 니오의 배아에 노력하고 있습니다. microcirculation 및 hemodynamic 연구,, 이런 데이터는 크게 connectomics 연구 10 기여할 수 있으며, provi에 의해 stereology 연구에땡 지상 진실을 정확하게. 이 문서에서는, 우리는 표본 준비 (고정, 얼룩 및 포함)를 포함 파이프라인, KESM 구성 및 설정, sectioning 및 이미징 KESM와 함께, 이미지 처리, 데이터 준비, 데이터 시각화 및 분석에 대해 설명합니다. 강조 표본 준비와 얻은 KESM 데이터의 시각화 / 분석됩니다. 우리는이 문서에서 제시한 자세한 프로토콜 KESM하고 활용도를 높이기 위해 접근을 확대 데 도움을 기대합니다.

뇌 표본 준비에서 데이터 시각화 및 분석에, 나이프 - 에지 스캐닝 현미경을 사용하여 시리얼 sectioning 이미징의 전체 과정을 설명합니다. 이 기술은 현재 마우스 뇌 데이터를 취득하는 데 사용하지만, 다른 기관, 다른 수종에 적용됩니다.

고처리량, 고해상도 3D 현미경 기술의 주요 발전으로 인해 ...에서 대량의 신경해부학적 데이터를 획득하는 것이 가능해졌습니다.

본 절차의 전반적인 목적은 나이프 엣지 스캐닝 현미경(knife edge scanning microscope, KESM) 하에서 절편 제작 및 이미징을 위한 생물학적 시료의 준비 과정과 그 결과로 얻어진 이미지 스택 데이터의 시각화 방법을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 조직을 고정, 염색 및 포매하여 KESM 이미징이 가능한 상태로 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 KESM을 설정하고 자동 제어 소프트웨어를 사용하여 절편 제작 및 이미징을 수행하는 것입니다.그 다음으로 생성된 이미지의 노이즈를 제거하고 등록 및 크롭 작업을 수행합니다. 마지막 단계는 웹 기반 아틀라스와 3D 시각화 소프트웨어에서 데이터 세트를 불러와 탐색하는 것입니다. 결과적으로, 서브 마이크로미터 해상도에서 뇌 전체 수준의 뉴런 및 혈관 구조를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.직렬 블록 기반 스캔 전자현미경과 같은 기존의 메조스코픽(Mesos) 기법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 해상도는 더 낮지만 훨씬 더 큰 부피를 이미지화할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 커넥토믹스와 일반적인 신경과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 뇌의 구조적 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 폐나 신장과 같은 다른 장기 시스템에도 적용 가능합니다.본 절차를 시작하려면, 해부한 마우스 뇌를 Golgi Cox 용액이 담긴 유리병에 넣습니다. 이 유리병을 실온의 차광 상자에 넣고 10~16주 동안 보관하십시오. Golgi Cox 용액이 고정액 역할을 하므로 별도의 고정 단계는 필요하지 않습니다.10~16주 후, 다음 날 암실에서 탈이온수로 뇌를 밤새 세척하고, 세척된 뇌를 탈이온수로 희석한 5% 수산화암모늄 용액에 담가 실온의 암실에서 7~10일 동안 유지합니다. 7~10일 후, 실온의 탈이온수로 뇌를 4시간 동안 다시 세척합니다. 그 다음, 단계별 에틸알코올 시리즈를 통해 뇌를 탈수시키며, 4°C에서 50% 에탄올과 70% 에탄올, 그리고 85% 에탄올 용액에 각각 24시간씩 둡니다.실온에서 95% ethanol로 3회, 100% ethanol로 4~5회 교체합니다. 다음으로, 탈수된 뇌를 acetone에 넣고 하루에 한 번씩 3~4회 교체합니다. 이후, aite와 acetone의 비율이 1:2, 1:1, 2:1인 각각의 aite acetone 혼합액에 뇌를 넣고 냉장고에서 하룻밤 동안 보관합니다.마지막으로 뇌를 100% aite에 넣어 냉장 보관하며, 하룻밤마다 세 번 교체합니다. 처리된 뇌를 100% aite에 매립하고 60 °C에서 3일 동안 가열합니다. 최종적으로, 경화된 시료 블록을 에폭시를 사용하여 금속 시료 링에 고정하고, 본 절차를 시작하기 위해 블록의 측면을 필요에 따라 다듬습니다.마우스가 깊게 마취되어 발가락 꼬집기 자극에 반응하지 않는지 확인합니다. 그런 다음 실온의 phosphate buffered saline을 사용하여 마우스의 심장을 통해 관류하고, 이어서 차가운 4% phosphate buffered para formaldehyde로 관류합니다. 다음으로, 탈이온수에 0.1% thi and dye가 포함된 용액으로 마우스를 관류합니다.그 후, 사체를 4 °C 냉장고에 24시간 동안 보관하십시오. 24시간 후에 송아지로부터 뇌를 꺼내어 0.1% Thionine 새 용액에 넣으십시오. 뇌를 4 °C에서 7일 동안 보관하십시오.7일 후, 단계별 에틸 알코올 시리즈를 통해 뇌를 고정하고 탈수합니다. 6주에 걸쳐 50% ethanol에서 3~5일, 70% ethanol에서 7~10일, 85% 및 95% ethanol에서 각각 약 2주, 그리고 남은 기간 동안 100% ethanol에서 처리합니다. 상온에서 아세톤을 3회 교체한 후, 60 °C 오븐에서 뇌를 에폭시 수지에 매립합니다.인디아 잉크(India ink)를 사용하여 혈관 네트워크를 염색하는 절차를 시작하려면, 발가락 회피 반사가 없는 것을 확인하여 마우스가 깊게 마취되었는지 확인하십시오. 그런 다음 상온의 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)를 사용하여 마우스의 심장 내 관류를 수행하고, 이어서 상온의 10% 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin)을 투여하십시오. 심혈관계에서 혈액을 제거하고 조직을 고정하기 위해서는 식염수와 고정액을 이용한 전신 관류가 필수적입니다.다음으로, 3.0 ccs의 희석되지 않은 인도 잉크 관류액으로 마우스를 관류합니다. 심혈관계의 혈관을 완전히 채우기 위해서는 인도 잉크가 필요합니다. 마우스에서 적출한 후, 얻어진 뇌를 일련의 단계별 에틸 알코올로 탈수시킨 다음 에루다이트 플라스틱(erudite plastic)에 포매합니다.이미징을 위해 KESM을 설정하는 앞서 설명한 프로토콜에 따라, 카메라, 조명 및 스테이지의 전원을 켜고 나이프와 대물렌즈를 올립니다. 다음으로 시료 링을 설치합니다. 그런 다음 대물렌즈와 나이프를 내립니다.시료의 크기를 측정합니다. 그런 다음 KESM 스테이지 컨트롤러를 위한 구성 파일을 생성합니다. 스테이지를 초기화하기 전에 KESM의 나이프와 대물렌즈를 들어 올리십시오.KESM 스테이지 컨트롤러 2를 시작하고 스테이지를 초기화합니다. 그런 다음 나이프와 대물렌즈를 내리고 펌프를 켭니다. 광학 경로의 초점 조절 노브를 돌리고 나이프 엣지에 대해 카메라의 시야를 조정하여 대물렌즈와 카메라의 초점을 맞춥니다.이미징 및 섹셔닝의 처음 몇 단계를 확인하려면 단계별(step-by-step)로 클릭하십시오. 그런 다음 go를 클릭하여 이미지 프로세싱을 위한 이미징 및 섹셔닝을 시작하십시오.KESM 스택 프로세서를 실행하여 모든 이미지에서 조명 아티팩트를 제거하고 배경 강도를 정규화하십시오. 모든 데이터 하위 폴더에 대해 이 과정을 반복하십시오. KESM 뇌 아틀라스를 사용하여 데이터를 시각화하려면, 해당 웹사이트로 이동하여 적절한 아틀라스를 선택해 다른 깊이로 이동하십시오.드롭다운 메뉴에서 각 단계별 이동 깊이를 선택한 다음, 플러스(+)를 클릭하여 Z 깊이를 늘리거나 마이너스(-)를 클릭하여 줄이십시오. 다른 옵션으로는 확대 또는 KESM 뇌 아틀라스를 이용한 탐색이 있습니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 오버레이 번호와 오버레이 간격을 조정함으로써 VIS lab을 통한 데이터 시각화가 가능합니다.애플리케이션을 실행하고 새 프로젝트를 생성합니다. 프로젝트에는 2D 파일로부터 3D 구성, 월드 매트릭스 연산 설정 1 및 3D 뷰 연결이 포함되어야 합니다. 해당 순서대로, 마우스 오른쪽 버튼을 누른 상태에서 3D 뷰에 표시된 것과 같이 적절한 파라미터를 설정해야 합니다.마우스를 움직여 임계값 영역을 조정하여 크롭할 수 있습니다. 방향이 변경되었거나, 조명이 변경되었거나, 배경이 켜지거나 꺼졌을 수 있습니다. 대표적인 KESM 결과가 다음과 같이 예시되어 있습니다. 먼저 표시되는 비디오 클립은 KESM의 볼륨 시각화로, 혈관 데이터 세트에 대한 뇌 전체 India ink 데이터 스택이며, 너비가 약 100 microns인 혈관 데이터의 확대 샷부터 시작됩니다.KESM의 두 번째 클립인 생쥐 전체 뇌 India ink 데이터에서는 너비 약 10 millimeters의 고해상도 데이터에서 하위 샘플링한 생쥐 전체 뇌 혈관의 세 가지 표준 뷰를 보여줍니다. 시상면 뷰, 관상면 뷰, 수평면 뷰와 더불어 관상면 단면의 플라이스루 영상을 확인할 수 있습니다. 이 비디오 클립에서는 KESM 생쥐 전체 뇌 Golgi 데이터를 보여주며, 블록 뷰를 시작으로 시상면 뷰, 관상면 뷰, 수평면 뷰의 세 가지 서로 다른 절단면을 따라 이동하는 플라이스루 영상이 제시됩니다.다음은 KESM 마우스 전뇌 GoGy 데이터의 상세 내용입니다. 첫 번째 비디오 클립은 소뇌와 푸르키니에 세포를 보여줍니다. 두 번째 클립은 피질과 파라메탈 세포를 보여줍니다.마지막으로 KESM입니다. 전체 뇌 nle 데이터가 이 두 개의 비디오 클립에 예시되어 있습니다. 먼저 NLE 데이터의 확대 모습이 표시됩니다.이 두 번째 클립은 고해상도 데이터에서 하위 샘플링한 전체 생쥐 뇌 Nle 데이터의 세 가지 표준 뷰를 보여줍니다. 내부 구조를 명확하게 확인하기 위해 단면도 또한 제시되었습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 생쥐 뇌의 신경 및 혈관 네트워크를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하고 나면 나이프 엣지 주사 현미경(knife edge scanning microscope)을 이용한 시료 준비, 이미징 및 데이터 분석에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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