나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

본 절차의 전반적인 목적은 나이프 엣지 스캐닝 현미경(knife edge scanning microscope, KESM) 하에서 절편 제작 및 이미징을 위한 생물학적 시료의 준비 과정과 그 결과로 얻어진 이미지 스택 데이터의 시각화 방법을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 조직을 고정, 염색 및 포매하여 KESM 이미징이 가능한 상태로 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 KESM을 설정하고 자동 제어 소프트웨어를 사용하여 절편 제작 및 이미징을 수행하는 것입니다.

그 다음으로 생성된 이미지의 노이즈를 제거하고 등록 및 크롭 작업을 수행합니다. 마지막 단계는 웹 기반 아틀라스와 3D 시각화 소프트웨어에서 데이터 세트를 불러와 탐색하는 것입니다. 결과적으로, 서브 마이크로미터 해상도에서 뇌 전체 수준의 뉴런 및 혈관 구조를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

직렬 블록 기반 스캔 전자현미경과 같은 기존의 메조스코픽(Mesos) 기법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 해상도는 더 낮지만 훨씬 더 큰 부피를 이미지화할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 커넥토믹스와 일반적인 신경과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 뇌의 구조적 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 폐나 신장과 같은 다른 장기 시스템에도 적용 가능합니다.

본 절차를 시작하려면, 해부한 마우스 뇌를 Golgi Cox 용액이 담긴 유리병에 넣습니다. 이 유리병을 실온의 차광 상자에 넣고 10~16주 동안 보관하십시오. Golgi Cox 용액이 고정액 역할을 하므로 별도의 고정 단계는 필요하지 않습니다.

10~16주 후, 다음 날 암실에서 탈이온수로 뇌를 밤새 세척하고, 세척된 뇌를 탈이온수로 희석한 5% 수산화암모늄 용액에 담가 실온의 암실에서 7~10일 동안 유지합니다. 7~10일 후, 실온의 탈이온수로 뇌를 4시간 동안 다시 세척합니다. 그 다음, 단계별 에틸알코올 시리즈를 통해 뇌를 탈수시키며, 4°C에서 50% 에탄올과 70% 에탄올, 그리고 85% 에탄올 용액에 각각 24시간씩 둡니다.

실온에서 95% ethanol로 3회, 100% ethanol로 4~5회 교체합니다. 다음으로, 탈수된 뇌를 acetone에 넣고 하루에 한 번씩 3~4회 교체합니다. 이후, aite와 acetone의 비율이 1:2, 1:1, 2:1인 각각의 aite acetone 혼합액에 뇌를 넣고 냉장고에서 하룻밤 동안 보관합니다.

마지막으로 뇌를 100% aite에 넣어 냉장 보관하며, 하룻밤마다 세 번 교체합니다. 처리된 뇌를 100% aite에 매립하고 60 °C에서 3일 동안 가열합니다. 최종적으로, 경화된 시료 블록을 에폭시를 사용하여 금속 시료 링에 고정하고, 본 절차를 시작하기 위해 블록의 측면을 필요에 따라 다듬습니다.

마우스가 깊게 마취되어 발가락 꼬집기 자극에 반응하지 않는지 확인합니다. 그런 다음 실온의 phosphate buffered saline을 사용하여 마우스의 심장을 통해 관류하고, 이어서 차가운 4% phosphate buffered para formaldehyde로 관류합니다. 다음으로, 탈이온수에 0.1% thi and dye가 포함된 용액으로 마우스를 관류합니다.

그 후, 사체를 4 °C 냉장고에 24시간 동안 보관하십시오. 24시간 후에 송아지로부터 뇌를 꺼내어 0.1% Thionine 새 용액에 넣으십시오. 뇌를 4 °C에서 7일 동안 보관하십시오.

7일 후, 단계별 에틸 알코올 시리즈를 통해 뇌를 고정하고 탈수합니다. 6주에 걸쳐 50% ethanol에서 3~5일, 70% ethanol에서 7~10일, 85% 및 95% ethanol에서 각각 약 2주, 그리고 남은 기간 동안 100% ethanol에서 처리합니다. 상온에서 아세톤을 3회 교체한 후, 60 °C 오븐에서 뇌를 에폭시 수지에 매립합니다.

인디아 잉크(India ink)를 사용하여 혈관 네트워크를 염색하는 절차를 시작하려면, 발가락 회피 반사가 없는 것을 확인하여 마우스가 깊게 마취되었는지 확인하십시오. 그런 다음 상온의 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)를 사용하여 마우스의 심장 내 관류를 수행하고, 이어서 상온의 10% 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin)을 투여하십시오. 심혈관계에서 혈액을 제거하고 조직을 고정하기 위해서는 식염수와 고정액을 이용한 전신 관류가 필수적입니다.

다음으로, 3.0 ccs의 희석되지 않은 인도 잉크 관류액으로 마우스를 관류합니다. 심혈관계의 혈관을 완전히 채우기 위해서는 인도 잉크가 필요합니다. 마우스에서 적출한 후, 얻어진 뇌를 일련의 단계별 에틸 알코올로 탈수시킨 다음 에루다이트 플라스틱(erudite plastic)에 포매합니다.

이미징을 위해 KESM을 설정하는 앞서 설명한 프로토콜에 따라, 카메라, 조명 및 스테이지의 전원을 켜고 나이프와 대물렌즈를 올립니다. 다음으로 시료 링을 설치합니다. 그런 다음 대물렌즈와 나이프를 내립니다.

시료의 크기를 측정합니다. 그런 다음 KESM 스테이지 컨트롤러를 위한 구성 파일을 생성합니다. 스테이지를 초기화하기 전에 KESM의 나이프와 대물렌즈를 들어 올리십시오.

KESM 스테이지 컨트롤러 2를 시작하고 스테이지를 초기화합니다. 그런 다음 나이프와 대물렌즈를 내리고 펌프를 켭니다. 광학 경로의 초점 조절 노브를 돌리고 나이프 엣지에 대해 카메라의 시야를 조정하여 대물렌즈와 카메라의 초점을 맞춥니다.

이미징 및 섹셔닝의 처음 몇 단계를 확인하려면 단계별(step-by-step)로 클릭하십시오. 그런 다음 go를 클릭하여 이미지 프로세싱을 위한 이미징 및 섹셔닝을 시작하십시오.

KESM 스택 프로세서를 실행하여 모든 이미지에서 조명 아티팩트를 제거하고 배경 강도를 정규화하십시오. 모든 데이터 하위 폴더에 대해 이 과정을 반복하십시오. KESM 뇌 아틀라스를 사용하여 데이터를 시각화하려면, 해당 웹사이트로 이동하여 적절한 아틀라스를 선택해 다른 깊이로 이동하십시오.

드롭다운 메뉴에서 각 단계별 이동 깊이를 선택한 다음, 플러스(+)를 클릭하여 Z 깊이를 늘리거나 마이너스(-)를 클릭하여 줄이십시오. 다른 옵션으로는 확대 또는 KESM 뇌 아틀라스를 이용한 탐색이 있습니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 오버레이 번호와 오버레이 간격을 조정함으로써 VIS lab을 통한 데이터 시각화가 가능합니다.

애플리케이션을 실행하고 새 프로젝트를 생성합니다. 프로젝트에는 2D 파일로부터 3D 구성, 월드 매트릭스 연산 설정 1 및 3D 뷰 연결이 포함되어야 합니다. 해당 순서대로, 마우스 오른쪽 버튼을 누른 상태에서 3D 뷰에 표시된 것과 같이 적절한 파라미터를 설정해야 합니다.

마우스를 움직여 임계값 영역을 조정하여 크롭할 수 있습니다. 방향이 변경되었거나, 조명이 변경되었거나, 배경이 켜지거나 꺼졌을 수 있습니다. 대표적인 KESM 결과가 다음과 같이 예시되어 있습니다. 먼저 표시되는 비디오 클립은 KESM의 볼륨 시각화로, 혈관 데이터 세트에 대한 뇌 전체 India ink 데이터 스택이며, 너비가 약 100 microns인 혈관 데이터의 확대 샷부터 시작됩니다.

KESM의 두 번째 클립인 생쥐 전체 뇌 India ink 데이터에서는 너비 약 10 millimeters의 고해상도 데이터에서 하위 샘플링한 생쥐 전체 뇌 혈관의 세 가지 표준 뷰를 보여줍니다. 시상면 뷰, 관상면 뷰, 수평면 뷰와 더불어 관상면 단면의 플라이스루 영상을 확인할 수 있습니다. 이 비디오 클립에서는 KESM 생쥐 전체 뇌 Golgi 데이터를 보여주며, 블록 뷰를 시작으로 시상면 뷰, 관상면 뷰, 수평면 뷰의 세 가지 서로 다른 절단면을 따라 이동하는 플라이스루 영상이 제시됩니다.

다음은 KESM 마우스 전뇌 GoGy 데이터의 상세 내용입니다. 첫 번째 비디오 클립은 소뇌와 푸르키니에 세포를 보여줍니다. 두 번째 클립은 피질과 파라메탈 세포를 보여줍니다.

마지막으로 KESM입니다. 전체 뇌 nle 데이터가 이 두 개의 비디오 클립에 예시되어 있습니다. 먼저 NLE 데이터의 확대 모습이 표시됩니다.

이 두 번째 클립은 고해상도 데이터에서 하위 샘플링한 전체 생쥐 뇌 Nle 데이터의 세 가지 표준 뷰를 보여줍니다. 내부 구조를 명확하게 확인하기 위해 단면도 또한 제시되었습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 생쥐 뇌의 신경 및 혈관 네트워크를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청하고 나면 나이프 엣지 주사 현미경(knife edge scanning microscope)을 이용한 시료 준비, 이미징 및 데이터 분석에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.