Name: 고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: 학습하세요 Lewis 쥐에서 항원 특이적 TEM 세포를 활성화하여 지연형 과민반응(DTH)을 유도하고 5일간 염증 반응을 모니터링하는 방법을. 이 기법은 면역학 연구에 활용됩니다.

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우리는이 프로토콜에서 사용되는 GFP - 라벨, ovalbumin 특정 T 세포 라인으로 우리를 제공할 박사 알렉산더 Flugel을 (Martinsried, 독일) 감사합니다.

1. ovalbumin 특정 T의 lymphocytes의 자극 휴식 ovalbumin 특정 T 세포는 자극을 매체 항원 제시 세포 (APCs)로 조사 루이스 랫 thymocytes (30 쥐), (DMEM + 펜 / Strep / L - GLUT + NEAA + RPMI의 비타민 준비의 존재에 ovalbumin로 자극된 상태네 + 2ME + 랫 세럼 + Ovalbumin, 최종 농도에서는 자료 목록에 언급했다.) 쥐 혈청 준비 <ol><li> 우리는 thymus 기증자로 희생 쥐의 혈청을. </li><li> 쥐들이 할로탄 흡입에 의해 깊이 anesthetized하고 가능한 한 많은 혈액으로 10 ML 주사기와 쥐 즉시 죽음을 보장하기 위해 목이있는 후 23 G 1 &quot;바늘을 사용하여 심장 재관류 (쥐 당 50-10 ML)에 의해 그려진 것입니다. </li><li> 혈액은 37 10 분 응고 수 있습니다 ° C 얼음이 10 분 뒤에. </li><li> 응고를 제거하고 남은 액체 돌다가 있습니다. </li><li> 혈청은 -20 ° C.에서 수집된 살균 - 여과 및 저장 </li></ol> 항원 제시 세포의 준비 <ol><li> 멸균 악기를 사용하여 참수 암흑의 thymus를 타고 얼음 PBS가 들어 페니실린과 스트렙토 마이신 (PBS - PS)에 놓으십시오. </li><li> 조직 문화 후드에 thymus을 가지고, 혈전 및 기타 오염 조직에서 청소하고 10 ML 포함된 10cm 배양 접시에 놓인 셀 스트레이너 (피셔 # 08-771-2) PBS를로 작은 조각으로 잘라 PS. </li><li> 각 조각은 살균 한 ML 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 셀 스트레이너를 통해 누르면됩니다. 얼음에 50 ML 튜브에 단일 세포 현탁액를 수집합니다. </li><li> PBS - PS의 20-40보다 ML과 셀 스트레이너 린스. 1,250g에서 현탁액을 원심 얼음에 PBS - PS의 펠렛, 5 ML / thymus을 resuspend. </li><li> 감마 irradiator이 중지 (30 쥐)을 비추다 즉시 50 ML PBS - PS와 함께 두 번 씻는다. 참고 : 가장 좋은 thymus 기증자 나이 젊은 성인 쥐, 5-7주 있습니다. 최대 10 주 쥐를 사용하지만 세포의 숫자는 시간이 감소됩니다. 어떤 사람들은 남성보다 thymus 기증자는 것을 말하고 있지만 성별은 중요하지 않습니다. 모든 동물이 같은 방에 보관되어 있기 때문에 우리는 항상 여자를 사용하고 우리가 같은 방에있는 남성과 여성을 싶지 않아요. </li></ol> 자극 <ol><li> 일단 T lymphocytes 씻으십시오 그들을 계산합니다. </li><li> 항원 제시 세포를 계산합니다. </li><li> 믹스 3 X 10 6 ovalbumin 특정 자극을 매체 10 ML을 포함 10cm 배양 접시에있는 150 X 10 6 APCs와 T 세포. </li><li> 37 48 시간 동안 품어 ° C. </li></ol> 2. ovalbumin 특정 T의 lymphocytes의 입양 전송 <ol><li> 우리가 수신자로 사용 쥐들이 70-10주 오래된 암컷입니다. </li><li> T lymphocytes 세어, 그들은 크고 둥근해야합니다. 항원 제시 세포는 죽게 될 것입니다. </li><li> T lymphocytes을 원심 분리기 10 X 10 6 세포 / PBS에 ML에서 그들을 resuspend. </li><li> 3 ML 주사기 23 G 1 &quot;바늘을 사용하여 한 ML의 intraperitoneally을 주사. </li></ol> 3. 귀에 항원과 도전 <ol><li> 이틀 입양 전송 후, 다른 귀 한 귀로와 생리 (또는없는 항원)에 1 MG / ML ovalbumin 솔루션 (= 관련 항원) 20 μl를 주입. 당신이 염증 반응을 강화 합산을 잃을 수 있으므로 항원 솔루션을 필터링하지 마십시오. 참고 : 쥐나는 움직임을 피하기 위해 anesthetized해야합니다. 당신이 오른손잡이 경우, 왼쪽 엄지와 검지, 귀 안쪽되는 검지 손가락과 직면하고있는 쥐를 사이의 귀를 잡아. </li><li> 27G ½ &quot;바늘을 사용하여 귀의 날개에있는 솔루션을 주사. 같은 장소에서 정확하게 모든 쥐를 삽입하는보십시오. </li></ol> 4. DTH 측정 <ol><li> 귀는 빨간색과 염증의 징조로서 훌륭한 회전을 시작합니다. 용수철 마이크로 미터 (예 : 모델 Mitutoyo에서 PK - 0505)을 각 (内耳)의 두께를 측정합니다. </li><li> 각 시간 시점에서 각각의 귀에 대해 5-6 측정하고 평균을 계산합니다. </li><li> 최대 붓기 24 72 시간 사이에 발생한다. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

antigenic의 도전도 다시 (2) 피부에 예를 들어, 다른 사이트에서 수행할 수 있습니다. 우리는 그러나 그 도전 찾으십시오. 본 동영상에 표시된 귀의 날개를 사용하면 DTH 반응의 가장 정확한 측정을 위해 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500ml</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>자극 배지 내 최종 농도 1 mM</td></tr><tr><td>페니실린 &amp;#8211; 스트렙토마이신 &amp;#8211; L-글루타민</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>자극 배지 내 최종 농도 각각 100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM</td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>자극 배지 내 최종 농도 1% NEAA</td></tr><tr><td>RPMI 비타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>자극 배지 내 최종 농도 1%</td></tr><tr><td>베타-머캅토&amp;#8211;에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>자극 배지 내 최종 농도 50 &amp;#x03BC;M 2ME</td></tr><tr><td>동종 쥐 혈청</td><td></td><td></td><td>최종 농도 1%. 프로토콜의 설명을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>오발부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>자극 배지 내 최종 농도 10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr></tbody></table>

고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

지연 유형 과민성 (DTH)은 면역 시스템이 준비하는되어있는 대한 항원의 주사의 사이트를 침투 CCR7 - 효과기 기억 T의 lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 염증 반응은 antigenic 도전의 사이트의 빨갛게과 팽창이 특징입니다. 그것은 면역 억제제의 생체내 효능에 결정하는 편리한 모델입니다. 피부 DTH는 항원에 특정한 T의 lymphocytes의 입양 전송 또는 항원, 그리고 주어진 피부 영역에서 염증 반응을 유발하는 항원과 이후의 intradermal 도전과 적극적인 예방 접종을 통해 유도된 수 있습니다. DTH 반응이 예제 ovalbumin, 투베르쿨린,​​ 파상풍 toxoid, 또​​는 열쇠의 림펫 hemocyanin에 대한 다양한 항원을 유도하실 수 있습니다. 이러한 반응도 MBP 여러 경화증 (1) 동물 모델 실험 면역 encephalomyelitis 유도와 쥐의 기본 단백질 (MBP)을 myelin 예를 들어, autoantigen에 대한 유발 수 있습니다. 여기 루이스 쥐에서 입양 DTH 반응을 유도하는 방법을 보여줍니다. 우리가 먼저 체외에서 ovalbumin 특정 T 세포를 자극하고 순진한 쥐 이러한 활성 셀 intraperitoneally를 삽입합니다. 다른 귀 윌은 생리 수신하는 동안 세포가 2 일간 생체내에서 평형 수있게되면, 우리는 귀 한쪽의 날개에 ovalbumin와 쥐에 도전합니다. 염증 반응이 3~72시간 나중에 표시되며, 귀 두께는 DTH 심각의 표시로 측정됩니다.

지연 유형 과민성 (DTH)는 CCR7 - 효과기 기억 T (TEM) lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 여기서 우리는, 항원 특정 TEM 세포를 활성화 루이스 쥐에서 입양 DTH를 유발하고 염증 반응을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

지연형 과민반응(DTH)은 ...의 주사 부위로 침투하는 CCR7- 작동 기억 T 림프구에 의해 매개되는 염증 반응입니다.

안녕하세요, Christine Beaton입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과의 George Chen 교수님 연구실에서 보조 연구원으로 근무하고 있습니다. 앞으로 며칠 동안 Louis 랫에서 적응성 DTH를 유도하고 측정하는 절차를 보여드리겠습니다.이 절차는 5일 동안 진행되며, 제가 보여드릴 내용은 항원 특이적 T 세포를 활성화하는 방법과 이틀 후 이를 미접종 쥐에게 초기 주입하는 방법입니다. 그 후 이틀 뒤에, 해당 T 세포가 특이성을 갖는 항원을 쥐의 귀에 투여하여 자극을 줍니다. 그리고 하루 뒤에 이 쥐들의 염증 정도를 측정할 것입니다.조직 배양에 사용할 혈청을 얻기 위해 먼저 혈액을 채취해야 합니다. 이를 위해 심장 천자를 수행합니다. 왼쪽 검지 손가락을 태양 신경총에 대고, 바늘을 갈비뼈 사이로 넣어 심장에 도달시킨 다음 가능한 한 많은 양의 혈액을 흡인합니다.그리고 하루의 상태와 효율에 따라, 한 번의 채혈로 해당 쥐로부터 2~10 mL의 혈액을 얻을 수 있습니다. 배양액에 혈청이 필요한 이유는 Louis rat 세포를 혈청 내에서 성장시키고자 하며, 이는 동종성(syngeneic)을 유지하기 위함입니다. 따라서 Louis rat 혈청을 사용하게 됩니다.그런 다음 혈액을 튜브로 옮기는데, 나중에 조직 배양에 혈청을 사용해야 하므로 용혈이 일어나지 않도록 주사기에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 이제 심장 박동이 멈추고 쥐가 사망했으므로 흉선을 적출하겠습니다.먼저 70% ethanol을 뿌려 털이 날려 조직으로 들어가는 것을 방지합니다. 조직 배양에 사용할 예정이기 때문입니다. 해부에는 멸균된 도구를 사용합니다. 우선 피부를 절개하여 제거합니다.피부를 제거한 후, 심장 바로 위에 위치한 흉선을 손상시키지 않도록 흉곽의 양측을 조심스럽게 절개합니다. 흉선은 여기서 심장 바로 위에 위치한 창백하고 거의 흰색에 가까운 기관으로 확인할 수 있습니다. 이제 흉선을 제거하는데, 기관 전체를 모두 제거하도록 하되, 나중에 클린벤치(hood)에서 다듬을 예정이므로 너무 깔끔하게 떼어내려고 무리하게 주의를 기울일 필요는 없습니다.그리고 이를 penicillin과 streptomycin을 첨가한 PBS가 들어있는 튜브에 넣습니다. 박테리아 성장을 방지하기 위해, 이제 세포의 단일 세포 현탁액을 만들겠습니다. 이를 위해 70 micron 세포 스트레이너를 사용하겠습니다.물론 모든 장비는

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유도 및 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 Encephalomyelitis 임상 채점

지연 유형 과민성 (DTH)는 CCR7 - 효과기 기억 T의 lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 여기 루이스 쥐에 적극적으로 DTH를 유발하고 염증 반응을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

쥐에서 Active 지연 유형 과민성 (DTH)의 유도 및 모니터링

여기서 우리는 쥐의 귀에 지연 유형 과민성 (DTH) 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 이것은 이펙터 / 메모리 T 세포 응답의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다.

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