고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링

안녕하세요, Christine Beaton입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과의 George Chen 교수님 연구실에서 보조 연구원으로 근무하고 있습니다. 앞으로 며칠 동안 Louis 랫에서 적응성 DTH를 유도하고 측정하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차는 5일 동안 진행되며, 제가 보여드릴 내용은 항원 특이적 T 세포를 활성화하는 방법과 이틀 후 이를 미접종 쥐에게 초기 주입하는 방법입니다. 그 후 이틀 뒤에, 해당 T 세포가 특이성을 갖는 항원을 쥐의 귀에 투여하여 자극을 줍니다. 그리고 하루 뒤에 이 쥐들의 염증 정도를 측정할 것입니다.

조직 배양에 사용할 혈청을 얻기 위해 먼저 혈액을 채취해야 합니다. 이를 위해 심장 천자를 수행합니다. 왼쪽 검지 손가락을 태양 신경총에 대고, 바늘을 갈비뼈 사이로 넣어 심장에 도달시킨 다음 가능한 한 많은 양의 혈액을 흡인합니다.

그리고 하루의 상태와 효율에 따라, 한 번의 채혈로 해당 쥐로부터 2~10 mL의 혈액을 얻을 수 있습니다. 배양액에 혈청이 필요한 이유는 Louis rat 세포를 혈청 내에서 성장시키고자 하며, 이는 동종성(syngeneic)을 유지하기 위함입니다. 따라서 Louis rat 혈청을 사용하게 됩니다.

그런 다음 혈액을 튜브로 옮기는데, 나중에 조직 배양에 혈청을 사용해야 하므로 용혈이 일어나지 않도록 주사기에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 이제 심장 박동이 멈추고 쥐가 사망했으므로 흉선을 적출하겠습니다.

먼저 70% ethanol을 뿌려 털이 날려 조직으로 들어가는 것을 방지합니다. 조직 배양에 사용할 예정이기 때문입니다. 해부에는 멸균된 도구를 사용합니다. 우선 피부를 절개하여 제거합니다.

피부를 제거한 후, 심장 바로 위에 위치한 흉선을 손상시키지 않도록 흉곽의 양측을 조심스럽게 절개합니다. 흉선은 여기서 심장 바로 위에 위치한 창백하고 거의 흰색에 가까운 기관으로 확인할 수 있습니다. 이제 흉선을 제거하는데, 기관 전체를 모두 제거하도록 하되, 나중에 클린벤치(hood)에서 다듬을 예정이므로 너무 깔끔하게 떼어내려고 무리하게 주의를 기울일 필요는 없습니다.

그리고 이를 penicillin과 streptomycin을 첨가한 PBS가 들어있는 튜브에 넣습니다. 박테리아 성장을 방지하기 위해, 이제 세포의 단일 세포 현탁액을 만들겠습니다. 이를 위해 70 micron 세포 스트레이너를 사용하겠습니다.

물론 모든 장비는 멸균된 것을 사용하겠습니다. 흉선을 페트리 접시에 옮깁니다. 보시는 바와 같이, 상태가 그리 깨끗하지 않습니다.

흉선은 하얀색 기관이며, 그 표면에 림프절과 혈전이 있습니다. 따라서 이를 제거하겠습니다. 그리고 세척된 흉선을 받을 준비를 위해 세포 스크리너에 항생제가 첨가된 PBS 10 mL를 넣겠습니다.

따라서 세척을 위해 흉선에서 모든 오염물을 단순히 제거합니다. 이제 흉선이 거의 완전히 깨끗해졌으므로, 핀셋으로 집어 올려 셀 스트레이너 위에서 가위로 작게 자른 뒤, 잘게 자른 흉선 조각들을 모두 셀 스트레이너 안에 넣습니다. 그 작업이 끝나면, 당연히 멸균된 1 mL 주사기 플런저를 사용하여 흉선 조각들을 셀 스트레이너로 밀어내어 단일 세포 현탁액을 만듭니다.

그러면 단일 세포들이 통과하여 셀 트레이너 외측의 PBS에 위치하게 됩니다. 이제 세포를 셀 트레이너로 압착해 통과시켰으며, PBS가 더 이상 투명하지 않은 것을 확인할 수 있습니다. 현재 PBS는 단일 세포 현탁액으로 채워져 있으며, 이를 얼음에 보관 중인 50 mL 튜브로 옮기겠습니다.

세포 여과기에 PBS를 다시 채우고 시린지 플런저를 더 눌러 튜브로 옮기는 과정을 PBS가 튜브에 30~40 mL 정도 모일 때까지 몇 번 더 반복하겠습니다. 작업이 완료된 후의 세포 여과기 모습은 이와 같습니다. 이제 모든 세포를 수집했으므로, 1200 RPM에서 약 10분 동안 원심분리하여 침전시키겠습니다.

원심분리기로부터 꺼낸 세포들이 여기 있으며, 상층액을 제거하는 단계이므로 펠렛의 크기가 상당히 큰 것이 정상입니다. 펠렛은 당연히 튜브 바닥에 그대로 남아 있습니다. 재현탁을 더 쉽게 하기 위해, 펠렛이 거의 마르지 않은 상태에서 이를 분쇄하겠습니다.

그러고 나서 PT가 완전히 해체되어 다시 단일 세포 현탁액 상태가 될 때까지 손가락으로 꽤 강하게 톡톡 쳐줍니다. 이제 멸균된 PBS로 세포를 재현탁할 것이며, 타이머당 5 mL의 PBS를 첨가합니다. 현재 타이머가 하나뿐이므로 5 mL만 첨가하겠습니다.

이것이 제가 이리게이터(irrigator)로 가져갈 현탁액입니다. 그리고 세포가 살아있되 몇 시간 내에 사멸하도록 하기 위해 30°C의 관수 온도를 사용합니다. 이렇게 하면 세포가 항원을 처리할 수 있으면서도, 배양액을 오염시키지 않게 됩니다.

활성화하려는 T 세포를 살펴보면, 전혀 건강해 보이지 않는다는 것을 알 수 있습니다. 일부는 죽기 시작했습니다. 형태가 이상하며, 더 이상 발견되지 않습니다.

따라서 이 세포들은 이제 활성화될 준비가 되었습니다. 이들은 실제 시간 경과 후 항원을 매우 필요로 하는 상태입니다. 일부 세포가 사멸하여 용액 내에 독성 화합물을 방출할 수 있으므로, 빠르게 세척하는 것이 매우 중요합니다.

그 다음 PBS 용액을 사용하여 튜브의 부피를 50 mL까지 채웁니다. 동시에, 자극을 기다리고 있는 T-세포를 다른 50 mL 튜브로 옮겨 두 튜브를 동시에 원심분리할 수 있도록 하겠습니다.

여기 조금 전에 채취한 혈액이 있습니다. 37°C에서 10분 동안 방치한 후 얼음에 두었습니다. 보시는 바와 같이 혈액이 완전히 응고되었습니다. 이제 이 혈액에서 혈청을 분리해야 합니다.

따라서 첫 번째 단계로 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 튜브에서 응고물을 떼어내고, 분석하고자 하는 혈청이 포함된 모든 액체를 수집하겠습니다. 이때 응고물에 갇히지 않은 일부 세포들도 함께 수집됩니다. 이 액체를 다른 튜브로 옮기는데, 전송 과정에서 때때로 작은 응고물 조각들이 함께 섞여 나올 수 있습니다. 하지만 어차피 해당 액체에 남아 있는 세포들을 제거해야 하므로 이는 큰 문제가 되지 않습니다.

액체가 들어 있는 소형 튜브를 원심분리하겠습니다. 이렇게 하면 세포와 응고된 덩어리를 제거할 수 있으며, 이제 혈액의 액체 성분을 회전시켜 세포와 혈청을 분리하겠습니다. 2분 동안 원심분리하는 것으로 충분합니다.

이제 혈청의 원심분리가 완료되었으므로, 세포에서 혈청을 제거하겠습니다. 혈청은 노란색을 띠어야 하는데, 이 샘플은 용혈 현상으로 인해 붉은색을 띠고 있어 완벽한 예시는 아닙니다. 아주 이상적인 상태는 아니지만, 그럼에도 불구하고 이를 어떻게 여과하는지 보여드리겠습니다.

저는 0.2 micron 주사기 어댑터 필터를 사용하여 혈청을 여과해 멸균 상태를 확인하겠습니다. 하지만 용혈 현상이 발생했으므로, 이번 배치(patch)의 혈청은 자극 실험에 사용하지 않겠습니다. 대신 이전 실험 때 냉동 보관해 두었던 Louis 랫 혈청을 사용하겠습니다.

왼쪽에는 T 세포의, 오른쪽에는 항원 제시 세포의 PT가 있습니다. 이제 두 튜브 모두에서 상층액을 제거하겠습니다. 그리고 앞서 했던 것처럼, 손가락으로 톡톡 두드려 펠렛을 풀어줌으로써 세포들이 다시 단일 세포 현탁액 상태가 되도록 하겠습니다.

T세포와 항원제시세포, 두 세포군 모두에 대해 이 과정을 수행하겠습니다. 그 후, 세포들을 부유시켜 수를 측정하겠습니다. 이어서 T세포 3 million개와 항원제시세포 150 million개를 혼합하여 지름 10 centimeter 페트리 접시에 넣겠습니다.

총 부피 10 mL인 두 개의 혈청 튜브가 여기 있습니다. 오른쪽은 오늘 준비한 것인데 용혈로 인해 붉은색을 띠는 반면, 왼쪽은 며칠 전에 준비하여 냉동 보관한 튜브입니다. 이것은 노란색이며 용혈이 없어 상태가 훨씬 더 좋습니다.

이것이 오늘 제가 조직 배양에 사용할 것입니다. 6개의 페트리 접시를 자극하기에 충분한 세포가 있으므로, 항원 제시 세포에는 30 mL의 배지를 넣고 T 세포에도 동일한 배지 30 mL를 넣겠습니다. 그런 다음 항원 제시 세포 튜브에 항원인 오발부민을 추가하겠습니다.

현재 스톡 농도는 1 mg/mL이며, 페트리 접시에서의 최종 농도를 10 µg/mL로 맞추고자 합니다. T세포에는 류이스 랫 혈청을 첨가할 예정이며, 최종적으로 페트리 접시 내의 랫 혈청 농도가 1%가 되도록 충분한 양을 첨가하겠습니다.

항원 제시 세포 현탁액을 균질화한 다음, 각 페트리 접시에 이 세포 현탁액 5 mL씩을 옮겨 담겠습니다. 항원 제시 세포 현탁액을 꺼낼 때 지방과 섬유 조직의 작은 덩어리가 항상 보일 텐데, 이는 지극히 정상적인 현상입니다.

사이트 준비 과정 내내 그것이 계속 나타납니다. 걱정하실 필요는 없습니다. 따라서 제거할 수 있다면 제거하고, 그렇지 않으면 그냥 페트리 접시에 그대로 둡니다.

이는 제 세포 배양에 전혀 영향을 주지 않습니다. 모든 APC를 페트리 접시에 옮긴 후, T-세포를 사용하여 동일한 과정을 반복하겠습니다. 따라서 각 페트리 접시에 5 mL의 T-세포 현탁액을 넣겠습니다.

이제 모든 세포가 페트리 접시에 들어갔으며, 모든 T-세포가 항원 제시 세포와 접촉할 기회를 가질 수 있도록 매우 잘 섞어주는 것이 중요합니다. 이를 위해 페트리 접시를 겹쳐 쌓고, 접시로 보이지 않는 8자 모양을 그리며 섞어줍니다. 모든 세포가 충분히 섞이도록 이 과정을 몇 차례 반복합니다.

혼합을 모두 마친 후, 해당 디쉬들을 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤한 배양기에 넣겠습니다. 배양기에서 48시간 동안 배양하면 배지의 색상이 약간 변하여 더 오렌지색을 띠게 되며, 세포들이 잘 활성화됩니다.

현미경으로 모든 페트리 접시를 하나씩 확인합니다. 매우 큰 세포들은 활성화된 T-세포이며, 매우 작은 세포들은 죽은 항원 제시 세포입니다. T-세포의 크기가 매우 큰 것으로 보아 자극이 매우 잘 이루어졌음을 알 수 있습니다.

페트리 접시를 조금 움직여 보면, 여기 왼쪽 편에 보이다가 이제 중앙으로 온 커다란 세포 덩어리가 있는데, 이것들이 활발하게 분열 중인 세포들입니다. 이제 모든 세포를 원심분리 튜브에 옮겨 원심분리하여 가라앉히고, 수를 센 다음 쥐 한 마리당 1,000만 개를 주입하겠습니다. 자극이 매우 잘 되었기 때문에 쥐 한 마리에 그만큼 많은 T 세포를 주입할 필요가 없습니다.

따라서 저는 두 개의 페트리 접시에서 얻은 세포만 사용할 것입니다. 이 세포들을 원심 분리하여 10 million개를 주입하고, 남은 세포들은 며칠 후 냉동 보관하기 위해 배양하겠습니다.

배양 배지는 T세포 성장 인자와 말 혈청을 첨가한 일반적인 T세포 배양 배지를 사용합니다. T세포는 부유 세포이므로 특별히 많은 조치를 취할 필요는 없습니다. 다만 대부분의 세포가 배지와 함께 회수되는지만 확인하면 됩니다.

마지막으로, 모든 세포 배양 접시를 새 배지로 헹구어 모든 세포를 완전히 회수하겠습니다. 자극 단계에서 사용했던 것과 동일한 배지 10 mL를 사용합니다. 보통 첫 번째 배지 회수 시 T세포가 대부분 수거되지만, 세포가 매우 귀중하므로 단 하나라도 소실되지 않도록 이 과정을 수행하는 것이 좋습니다. 필수적인 단계는 아니지만 권장되는 방법입니다.

따라서 원심분리를 통해 세포를 가라앉히겠습니다. 이렇게 하면 사멸된 세포 일부를 제거하고 주로 살아있는 세포만으로 시작할 수 있습니다. 그리고 세포에 신선한 배지를 제공하고자 합니다.

다시 1,500 RPM으로 약 8분 동안 원심분리하겠습니다. 세포를 펠렛화하는 과정이므로 브레이크 설정은 그대로 유지합니다. 이제 두 튜브의 상층액을 모두 따라내면, 한쪽 튜브에 작은 펠렛이 형성된 것을 확인할 수 있습니다.

이것은 2개의 페트리 접시에서 얻은 것입니다. 그리고 여기 4개의 페트리 접시에서 얻은 펠릿이 있습니다. 이 펠릿들은 활성화된 T 세포뿐만 아니라 항원 제시 세포까지 포함하고 있기 때문에 크기가 매우 큽니다.

이제 상층액을 제거하고, 주입할 세포에는 주입용으로 사용할 배지 1 mL를 추가하겠습니다. 그리고 나머지 세포들은 T세포 성장 인자와 말 혈청이 포함된 배양 배지 100 $\mu$L에 현탁하겠습니다. 이것이 제가 주입할 세포들입니다.

그리고 이 세포들을 각각 50 mL 용량의 플라스크 두 개에 나누어 넣겠습니다. 각 플라스크에 bone-derived T-세포 성장 인자를 10% 첨가합니다. 또한, 열처리 활성화 마혈청(heat-inactivated horse serum)을 10% 첨가합니다.

그런 다음 필요한 배지의 대부분을 추가하겠습니다. T 세포는 과도한 피펫팅을 선호하지 않으므로, 위아래로 섞지 않습니다. 따라서 절대적으로 필요한 최소량만 피펫팅하고 그대로 두어 준비를 마칩니다.

인큐베이터에 넣을 준비가 되었으며, 매일 상태를 확인합니다. 아마 24시간 후에 분할해야 할 것이고, 그렇지 않더라도 40시간 또는 48시간 후에는 반드시 분할해야 합니다. 하지만 매일 확인하도록 하겠습니다.

이들은 T-cell 성장 인자에서 매우 빠르게 성장하는 경향이 있습니다. 따라서 최소 48시간마다, 혹은 더 짧은 간격으로 계대 배양해야 합니다. 배양 배지의 색상도 함께 확인하겠습니다.

이제 세포들이 활성화되었으며, 완전히 활성화된 상태입니다. 이때가 쥐에게 주입하기에 가장 적절한 시기입니다. 그리고 이틀 후에 쥐의 귀에 챌린지를 수행하겠습니다.

세포가 다시 안정될 때까지 며칠을 기다리면, 세포들이 그만큼 빠르게 염증 부위로 이동하려고 합니다. 따라서 이제 세포들을 37°C, 5% CO2 조건의 배양기에 넣고, 25 gauge 바늘을 사용하여 쥐에게 주입하겠습니다. 이제 세포가 정맥 내로 주입되었으므로, 쥐를 이곳에 두고 48시간 후에 귀 부위에 챌린지를 수행하겠습니다.

며칠 전, 저는 GFP로 표지된 albumin 특이적 T 세포를 랫드에 주입했습니다. 그리고 오늘은 동일한 랫드의 귀에 챌린지를 수행할 예정입니다. 오른쪽 귀에 albumin을 주입하겠습니다.

그리고 왼쪽 귀에는 PBS를 주입하겠습니다. 주입하는 volin의 용량은 20 µg/20 µL입니다. 사용 중인 albumin은 Texas red로 표지된 albumin과 표지되지 않은 albumin을 1:1로 혼합한 것입니다.

제가 주사하는 방법을 보여드릴 부위가 여기입니다. 저는 오른손잡이이므로 왼손을 사용할 것입니다. 왼손의 장갑을 벗어 한 손가락은 귀 아래에, 다른 손가락은 위에 배치하여 피부를 잡아당겼습니다. 이렇게 하면 바늘의 위치를 정확히 확인하여 매우 얇은 두 층의 피부 사이 공간으로 진입할 수 있습니다.

따라서 이를 위해 매우 가느다란 27 gauge 바늘을 사용하여 주입합니다. 이제 방향을 돌려 보면, Texas red가 들어간 곳과 PBS가 들어간 곳을 확실히 구분할 수 있습니다. 현재는 접종 후 42시간이 경과한 시점이며, 스프링 장착 마이크로미터를 사용하여 귓바퀴 두께를 측정하겠습니다.

따라서 알부민으로 유발된 오른쪽 귀와 유발되지 않은 왼쪽 귀를 모두 측정하겠습니다. 두 귀의 두께 차이를 통해 염증의 강도를 파악할 수 있습니다. 지금까지 쥐를 이용한 지연형 과민반응(DTH)을 유도하는 전체 과정을 보여드렸습니다.

지금까지 항원 특이적 T 세포를 in vitro에서 활성화하는 방법, 이를 쥐에 입양 전이하는 방법, 그리고 해당 쥐에 항원을 투여하여 염증 정도를 측정하는 방법을 살펴보았습니다. Chand 연구실에서는 쥐의 염증 반응에 있어 칼륨 채널 차단제의 효과를 테스트하기 위해 이 절차를 일상적으로 사용하고 있습니다.