Name: 심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 배우세요 섬유소 히드로겔에 신생 쥐 심근세포를 캡슐화하여 심장 조직 공학 모델을 만드는 방법을. 2주 배양 후 수축력과 세포 생존율을 평가하는 기술을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

국립 심장 폐 혈액 연구소 (수상 # R00HL093358에 LDB) -이 작품은 국립 보건원에 의해 지원되었다.

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
<li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li>
<li>Krebs, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+poly%28lactic-co-glycolic%29+acid+scaffolds+with+in+situ+pore+formation+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering.</a> Acta. 5, 2847-2859 (2009).</li>
<li>Zimmermann, W. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li>
<li>Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+distension+of+fibrin-based+tissue+constructs%3A+evidence+of+adaptation+during+growth+of+engineered+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).</li>
<li>Jockenhoevel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+gel+-+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cardio-thoracic+surgery+%3A+official+journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).</li>
<li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sourcing+and+culture+conditions+for+fibrin-based+valve+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs.</a> Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).</li>
<li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin-based+arterial+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+66+%28Part+A%22%5BJournal%5D)">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

심근 시스템의 체외 모델에서 일관성 있고 가능한 삼차원의 섬유소 젤 결과에 신생아 쥐 cardiomyocytes의 캡슐. 세포 속은 때, 그들은 metabolically 활성화하고, 압축 개조 및 원시 심장 조직을 12 일치 세포외 매트릭스를 재현 할 수 있기 때문에 섬유소가 선호 biomaterial입니다. 우리가 cardiomyocytes이 환경에 자신을 맞출 수 있기 때문에, 그들의 기능은 등방성 조직 6 비해 큰 수축 강제의 결과로 심장 근육에 더 많은 특징입니다. 잠재적인 치료 어플 리케이션을 위해, 그것은 생존과 기능을 모두 촉진 물질 내에서 세포를 캡슐이 필요합니다. 프로토콜은 3 차원 microenvironment에서 심장 세포의 동작을 제어하는​​ 섬유소 네트워크를 만들기위한 효율적이고 정확한 방법을 보여 여기 소개. 몇 가지 잠재적인 문제는 이러한 구조의 생성과 문화 중에 발생할 수 있습니다. 한 잠재적인 문제는 크게 구조의 기능에 영향을 미칩니다 이전 캡슐화하기 위해 세포 생존 능력을 유지하고 있습니다. 노력은 격리와 섬유소 젤 내의 세포 캡슐 사이의 시간을 줄임으로써 격리 다음과 세포 죽음을 제한하여야한다. 구조는 엄격한 일정에 따라 매일 미디어를 제공하여야한다. 또한, 사용되는 솔루션의 모든 균등을 보장하기 위해 중요합니다. 피브리노겐, 트롬빈​​과 세포의 혼합물은 이기종 환경을 생성하는 경우, ECM을 리모델링하는 세포의 능력은 기계적 부부와 계약이 잠재적으로 방해합니다. 설계 조직의 연속성에 장애를 방지하기 위해 구성의 주입시 공기 방울의 형성을 방지하는 것도 중요하다. 이 문제를 완화하는 한 가지 방법은 주사기로 구성을 천천히 주입하는 데 필요한 것보다 더 많은 겔을 그릴 수 있습니다. 마지막으로, 한번 섬유소 매트릭스가 설정하고 24 시간 동안 문화 매체되었습니다, 그것은 섬유소 젤의 셀 기반의 압축을 촉진하기 위해 링 몰드의 측면에서 구조를 분리하는 것이 필수적입니다. 금형의 중간에있는 구조를 유지할 수있다는 것은 가스와 영양소 교환을 용이하게합니다. 반지의 금형의 측면에 준수는 원하는 세포 정렬을 방해 수 있습니다. 그 의식이 잘린가 건강 및 미국 수의학 협회의 의학 국립 연구소 모두의 지침에 따라 적절한 방법으로이 프로토콜의 euthanization의 방법으로 사용됩니다하는 것이 중요합니다. 그러나, 일부 기관은 신생아 쥐에 대한 잘린 다음 마취제 사용을 권장합니다. 그것은 excised 심장 조직 / 세포 hypoxic 조건에서 시간의 최소한을 보장하기 때문에 우리는 의식 잘린을 선택했습니다. hypoxia의 비교적 적은 금액은 국소 빈혈과 크게이 프로토콜의 결과에 영향을 미칠 수있는 잠재적 myocyte 죽음을, myocyte 발생할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> 나트륨 인산염 이염 </td><td> 시그마 </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일염기의 </td><td> 시그마 </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G5400 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 91308-12 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 고급 핀셋 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-20 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 큰 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 91401-14 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 마이크로 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 91501-09 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 메스 핸들 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10008-13 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-918 - 5A </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 흡수 벤치 underpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 무균 드레이프 </td><td> 피셔 과학 </td><td> GM42526 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 압력솥 가방 </td><td> 어부 </td><td> 01-812-54 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 거즈 패드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-761-52 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> betadine </td><td> Purdue 제품 </td><td> 67618-150-01 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 멸균 장갑 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 19-020 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 무균 전송 피펫 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 9962 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> collagenase </td><td> 워싱턴 </td><td> CLS2 </td><td> 절연 </td></tr><tr><td> 테플론로드 4분의 1 인치 직경 </td><td> McMaster - 카 </td><td> 8546K11 </td><td> 금형 부품 </td></tr><tr><td> 테플론 튜브 4분의 1 인치 ID, 2분의 1 인치 OD </td><td> McMaster - 카 </td><td> 8547K31 </td><td> 금형 부품 </td></tr><tr><td> 실리콘 O - 링 4분의 1 인치 ID, 2분의 1 인치 OD </td><td> McMaster - 카 </td><td> 9396K204 </td><td> 금형 부품 </td></tr><tr><td> 테플론 튜브 4분의 1 인치 ID, 16분의 5 인치 OD </td><td> McMaster - 카 </td><td> 52355K14 </td><td> 금형 부품 </td></tr><tr><td> 켄달 monoject의 주사기 6cc </td><td> 피셔 과학 </td><td> 05-561-41 </td><td> 금형 부품 </td></tr><tr><td> BD 주사기 3cc </td><td> 피셔 과학 </td><td> 309585 </td><td> 금형 부품 </td></tr><tr><td> 소 피브리노겐 </td><td> 시그마 </td><td> F8630 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 소 트롬빈 </td><td> 시그마 </td><td> T7513 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H0887 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 </td><td> S7653 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10,569 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> Pluronic F - 127 </td><td> 시그마 </td><td> P2443 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> 시그마 </td><td> 383147 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 0.2 미크론 필터 </td><td> 피셔 과학 </td><td> SCGVT05RE </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 40 마이크론 셀 strainers </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22-363-547 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 0.45 미크론 병 톱 필터 </td><td> 코닝 </td><td> 430627 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 유리 프리 필터 </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 18G 1 2분의 1 인치 긴 바늘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-826 - 5D </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 21G 1 인치 바늘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14 - 826C </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 단지를 구축 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 2116 </td><td> 구축 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,140 </td><td> 미디어 </td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> H1138 </td><td> 미디어 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16,000 </td><td> 미디어 </td></tr><tr><td> aminocaproic 산 </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 103305000 </td><td> 미디어 </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A5960 </td><td> 미디어 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 </td><td> I9278 </td><td> 미디어 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, 16% </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td> 조직학 </td></tr><tr><td> 최적의 절삭 온도 (-10 월) </td><td> 테드 펠라 </td><td> 27,050 </td><td> 조직학 </td></tr><tr><td> 2 methylbutane </td><td> 어부 </td><td> 03551-4 </td><td> 조직학 </td></tr><tr><td> 마우스 MYH1/2/4/6 일차 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 32732 </td><td> 조직학 </td></tr><tr><td> 토끼 Connexin 43 일차 항체 </td><td> 세포 신호 기술 </td><td> 3512 </td><td> 조직학 </td></tr><tr><td> Dylight 549 - 복합 당나귀 안티 마우스 차 항체 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 </td><td> 715-505-151 </td><td> 조직학 </td></tr><tr><td> Dylight 488 - 복합 Donke 안티 토끼 이차 항체 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 </td><td> 711-485-152 </td><td> 조직학 </td></tr><tr><td> 죽은 / 라이브 분석 </td><td> Invitrogen </td><td> L - 3224 </td><td> 분석 </td></tr></tbody></table>

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 cardiomyocytes의 캡슐

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

입체 히드로겔 환경에서 Culturing 세포는 조직 공학에 대한 구조를 개발뿐만 아니라 체외에서 다양한 문화 조건 하에서 세포 반응을 연구를위한 중요한 기술이다. 입체 환경은 더 밀접하게 세포로 인해 모든 크기 1 기계적 및 화학적 자극의 응용 프로그램에 생체내에서 관찰 무엇 모방한 것이었 지요. 입체 hydrogels는 중 같은 PEG - DA 2와 3 또는 PLGA 등 콜라겐 4, hyaluronic 산성 5 섬유소 6,7와 같은 자연 발생 단백질의 숫자로 합성 고분자로부터 만들 수 있습니다. 섬유소, 자연스럽게 발생 혈액 응고 단백질에서 생성된 Hydrogels는 신체의 자연 상처 치유 8 프로세스의 일부로 메쉬를 형성 중합 수 있습니다. 섬유소는 조직 공학을위한 이상적인 임시 발판 만들기, 셀 분해 및 9 잠재적 autologous입니다. 여기 자세히 삼일 늙은 쥐의 새끼와 조직 공학을위한 섬유소의 히드로겔 구조의 캡슐에 대한 세포의 준비에서 신생아 cardiomyocytes의 절연을 설명합니다. 신생아 myocytes은 심장 조직 형성 및 엔지니어링 4 체외 연구에서 사용되는 일반적인 셀 소스입니다. 섬유소 젤이 효소 트롬빈과 혼합 섬유소에 의해 생성됩니다. 트롬빈은 다른 단량체 10과 상호 작용하는 구속력이 사이트를 공개, 피브리노겐에서 fibrinopeptides FpA 및 FpB을 클리브. 이러한 상호 작용은 단량체가 히드로겔 메쉬를 형성 섬유로 자체 조립 원인. 이 효소 반응의 타이밍이 섬유소로 트롬빈의 비율을 변경하거나, 트롬빈에 칼슘의 비율로 조정할 수 있기 때문에, 하나는 주사 다른 형상 11,12의 번호와 구조를 주형 수 있습니다. 더 나아가 우리 문화 13시 겔을 제한하는 방법으로 인해 조직의 정렬을 생성할 수 있습니다. culturing 정적 조건에서 두 주 동안 설계 심장 조직 구성 후 심장 세포의 구조를 개조하기 시작하고 전기 서성 거려 조건 6에 따라 수축 힘을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜의 일환으로, 우리는 기능 심장 근육에 의해 생성된 활성 힘을 분석 최종 세포 생존을 결정하기위한 전기 자극을뿐만 아니라, 방법에 따라 구축 (라이브 죽었을 포함한 문화 시대 이후 myocardium을 설계 조직을 분석하는 방법을 설명합니다 분석)과 수축 (마이 오신 중쇄 또는 MHC)와 myocytes 사이 세포 커플링 (Connexin 43 또는 Cx43)에 대한 중요한 전형적인 단백질의 표현과 형태를 검토 immunohistological 염색법.

우리는 신생아 cardiomyocytes 및 조직 공학을위한 섬유소의 히드로겔 구조의 캡슐에 대한 세포의 준비의 절연을 설명합니다. 우리는 전기 자극 및 세포 생존과 immunohistological 얼룩에 따라 생성되는 활성 강제를 포함하여 문화 시대 이후 조직 공학 m​​yocardium을 분석하는 방법을 설명합니다.

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

3차원 하이드로젤 환경에서 세포를 배양하는 것은 조직 공학용 구조물을 개발하고 ...을(를) 연구하는 데 있어 중요한 기술입니다.

이 프로시저의 전반적인 목적은 심장 조직 공학을 위해 신생 쥐의 심근세포를 FI 하이드로젤 내에 캡슐화하는 것입니다. 이는 먼저 생후 2~3일 된 신생 쥐의 심장을 분리함으로써 수행됩니다. 그 다음, 분리된 심장을 콜라게나아제(collagenase)로 소화시킵니다.심장 세포를 세포외 기질로부터 분리하기 위해, 심장 세포를 피브린 하이드로젤로 캡슐화합니다. 마지막으로, 구성물을 2주 동안 배양합니다. 최종적으로, 결과에 따르면 이 구성물은 전기 자극에 반응하여 약 1.3 milli Newtons의 수축력을 생성하는 능력을 갖춘 것으로 나타났습니다.또한, 심근 단백질의 조직학적 염색을 통해 제작물의 정렬된 구조를 관찰할 수 있습니다. 공학적으로 제작된 심근 구조체는 손상 또는 질환 이후 흉터 조직을 공학 조직으로 수선하거나 대체함으로써 심장 기능을 개선하여, 심근경색의 잠재적 치료법으로 활용될 수 있습니다. 이러한 구조체는 다양한 자극이 수축력과 정상 및 병태생리학적 심장 발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 가치 있는 in vitro 모델 시스템으로 사용될 수 있습니다.각 개인을 위한 배지 준비와 수술 기구 멸균을 마친 후, 후드 작업대 위에 흡수성 벤치 패드를 깔고 그 위를 멸균 드레이프로 덮습니다. 멸균된 수술 기구와 4x4 거즈 패드를 멸균 드레이프 위에 놓습니다. 기구에 닿지 않도록 주의하며, 멸균된 20번 메스 날을 개봉하여 드레이프 위에 놓습니다.새끼 쥐의 머리를 절단한 후, 베타딘(Betadine)을 적신 거즈로 흉부를 닦아냅니다. 견갑골을 함께 움켜쥐어 새끼 쥐를 고정합니다. 부분 흉강 절개술을 시행하여 심장을 노출시키고, 견갑골에 가하는 압력을 높여 심장이 갈비뼈 밖으로 밀려 나오게 합니다.견갑골 절개를 위해, 메스 날을 심장 뒤쪽으로 밀어 넣어 대혈관을 절단하고 장기를 제거합니다. 심장을 PBS glucose가 담긴 페트리 접시의 얼음 위에 놓습니다. 심장이 분리되면, 얼음처럼 차가운 PBS glucose로 헹구어 잔류 혈액과 결합 조직을 제거합니다.각 심장의 상단 1/3을 제거하여 하단 2/3만 남깁니다. 이는 대부분의 심실 조직만을 분리하기 위함이며, 분리한 조직을 얼음처럼 차가운 PBS glucose가 담긴 새 Petri dish에 넣습니다. 멸균된 마이크로 가위와 포셉을 사용하여 심장을 약 1mm³ 크기의 조각으로 조심스럽게 잘게 다집니다.조직을 50 milliliter 원추형 튜브로 옮기고 버퍼를 10 milliliters만 남기고 모두 제거합니다. 콜라게나제 용액 7 milliliters를 첨가합니다. 콜라게나제-조직 혼합물을 37 degrees Celsius에서 7분 동안 흔들어 섞어줍니다.조직 조각을 분해하기 위해 파이펫으로 10회 조심스럽게 섞어줍니다. 조각들이 가라앉을 때까지 기다린 후 액체를 흡입하여 제거합니다. 조직 조각에 7 mL의 collagenase를 첨가하고 7분 동안 다시 소화시킵니다.남은 각 단계에서, 조직 조각들을 분쇄하기 위해 부드럽게 10회 파이펫팅합니다. 조직이 가라앉은 후, 상층액을 빨아들여 별도의 50 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. 조직 조각들에 7 milliliter의 collagenase를 첨가하고 7분 동안 다시 소화시킵니다. 소화 과정에서 상층액을 추가할 때마다, 각 상층액 튜브에 서로 다른 혈청 파이펫을 사용하여 10 milliliter의 정지 용액을 첨가합니다.피브린 겔 구조체 캐스팅을 준비하려면 프로토콜의 서술 부분을 참조하십시오. 이전에 제작한 맨드릴을 6cc 시린지 케이스에 넣고, 3cc 시린지를 플런저로 사용하여 O-링과 테플론 와셔 사이를 단단히 밀봉하십시오. 1밀리리터의 피브린 겔을 만들려면, 코니컬 튜브에 피브리노겐 스톡 112 µL와 20 mM HEPES 558 µL를 혼합하여 F 용액을 제조하십시오.별도의 원추형 튜브에 0.9% saline 용액으로 버퍼를 준비합니다. thrombin 스탁 17 µL와 2 normal calcium 용액 1.3 µL를 DMEM 135 µL에 첨가하여 T 용액을 만듭니다. 세 번째 원추형 튜브에서 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 밀리리터당 2,940만 개의 세포 농도, 즉 컨스트럭트 내 최종 목표 세포 농도의 6배가 되도록 재현탁합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 구조체 제작 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 피브리노겐과 트롬빈 용액을 혼합하면 피브린의 중합 반응이 빠르게 일어납니다. 따라서 몰드 캐스팅에 주입할 때 하이드로젤 내에 기포가 유입되는 것을 방지하면서 균일한 용액을 확보할 수 있도록 신속하게 작업해야 합니다.피브린 겔 구조물을 캐스팅할 준비가 되면, 18게이지 1.5인치 바늘이 장착된 1mL 시린지를 준비하십시오. 21게이지 1인치 바늘도 함께 준비합니다. 1mL의 피브린 겔 용액을 만들기 위해 50mL 원심 분리 튜브에 667µL의 F 용액을 넣은 후, 167µL의 세포 용액을 추가하십시오.마지막으로, 167 µL의 T 용액을 넣습니다. 공기 방울이 생기지 않도록 혼합물을 조심스럽게 피펫팅합니다. 이 시점에서 반응이 시작되었으므로, 즉시 컨스트럭트를 주입해야 합니다.주사기와 18 gauge 바늘을 사용하여 피브린 용액을 흡입합니다. 이때 바늘에 기포가 들어가지 않도록 주사기를 뒤집지 않게 주의하십시오. 18 gauge 바늘을 21 gauge 바늘로 교체합니다.주사기를 가볍게 두드려 기포를 모두 제거합니다. 다음으로, 테플론 O-링의 홈을 따라 주사기를 스토퍼로 둘러싸인 몰드 내부로 삽입하고 용액을 주입합니다. 몰드를 기울여 내부가 완전히 채워지도록 합니다.그다음 나머지 몰드를 채웁니다. 몰드를 3개씩 묶어 파라필름으로 감싼 후, 37 °C의 인큐베이터 또는 오븐에 넣습니다. 피브린이 충분히 중합될 수 있도록 겔을 20분 동안 배양합니다.각 배양 용기에 구조체당 21 milliliters의 심근 구조체 배지를 채웁니다. 멸균된 3 cc 주사기 외피를 플런저로 사용하여 구조체가 부착된 맨드렐을 DMEM이 담긴 커다란 페트리 접시로 밀어 넣습니다. 그런 다음 구조체를 샘플 용기에 넣습니다.병을 37°C에서 2주 동안 배양하십시오. 피브린 구조물 클램프의 분석을 시작하려면, 자극기에서 나오는 리드선의 악어 클립을 배스 내 전극의 와이어에 연결하십시오. 데이터 수집 보드, 펄스 발생기 및 힘 변환기를 켭니다.힘 트랜스듀서를 5G 설정으로 맞추고 영점을 조절합니다. 힘 트랜스듀서의 데이터를 표시하고 저장하는 맞춤형 LabVIEW 프로그램을 실행합니다. 데이터 폴더에 각 샘플을 위한 새로운 빈 텍스트 파일을 생성합니다. 핀셋을 사용하여, 구성물 링을 테플론 지지대에서 조심스럽게 밀어내어 힘 측정 시스템의 고정 금속 포스트 위에 배치함으로써 맨드릴 지지대에서 구성물을 제거합니다.배지조(Medium bath). 핀셋을 사용하여 힘 변환기 포스트 주변의 구조물을 밀어 올립니다. 구조물의 반대쪽 끝을 변환기 암 위에 놓고 변환기에 수치가 읽힐 때까지 조입니다.심장 자극기에 1.0 G force를 가합니다. 펄스 전압은 20 volts, 지속 시간은 6 milliseconds, 빈도는 1 hertz로 설정하십시오. output on off 버튼을 눌러 전기적 페이싱을 시작합니다.파형이 규칙적으로 변할 때까지 기록을 시작합니다. MATLAB에서 파형을 분석하여 수축력 속도와 이완 속도를 결정합니다. 심근세포 피브린 구조체는 처음에 몰드의 전체 너비를 덮고 있습니다.2주간의 배양 후, 조직은 초기 너비의 약 5분의 1로 수축합니다. 제작물의 전기적 페이싱을 통해 여기에 표시된 것과 같은 수축력 데이터를 생성합니다. 약 1.3 millinewtons의 수축력이 예상됩니다.구조체의 세포 생존율은 산소가 구조체 내부로 확산되는 데 제약이 있기 때문에, 배양액과 접촉하는 구조체 표면으로부터 세포가 얼마나 떨어져 있는지에 따라 달라집니다. 구조체의 표면에서는 공초점 현미경을 통해 높은 세포 생존율이 관찰되었습니다. 구조체의 정렬된 구조는 마이오신 중쇄(myosin heavy chain)를 적색으로 염색하여 확인하였으며, 근세포 간의 세포 결합에 필수적인 Connexion 43은 녹색으로 나타납니다.숙련되었을 때, 전체 프로토콜은 약 5시간이 소요됩니다. 분리 단계에는 약 3시간이 소요되며, 구조체 제작 단계에는 약 2시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때는 피브린 네트워크 내에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 항상 바늘 끝이 아래를 향하도록 유지하는 것이 중요합니다.또한, 몰드를 기울이면 주입 중에 바늘 구멍이 항상 가장 높은 지점에 위치하게 되어, 몰드 캐스팅 내부가 피브린 용액으로 완전히 채워질 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후면, 신생 쥐로부터 심근세포를 먼저 분리하고, 조립이 용이한 원통형 몰드에 피브린 용액을 주입 성형하여 심근세포를 링 모양의 피브린 하이드로젤 내에 캡슐화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

encapsulation-cardiomyocytes-fibrin-hydrogel-for-cardiac-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

decellularized 조직에서 주사용 매트릭스 젤을 준비하고 밀고 myocardium에 주입을위한...

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

이 프로토콜은 자신의 주변의 세포외 기질에서 발표가 되려면 여러 phenotypes로 차별화에 시달릴 수도 줄기 세포의 고유 기능을 활용에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 원고는 동시에 지방 파생 줄기 세포를 공동으로 차별화하는 데, PEG-섬유소와 콜라겐으로 구성되어 bilayered 히드로겔을 활용 모델, 우리의 설명 및 특성을...

ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

이 모델 시스템은 비파괴 방식으로 내생 콜라겐 (재) 조직 리얼 타임으로 공부하는 데 사용할 수있는 근섬유 채워진 섬유소 젤에서 시작됩니다. 모델 시스템은 서로 다른 세포 소스, 중간 첨가제와 함께 사용할 수있는, 매우 조정할 수 있으며, 특정 요구에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

엔지니어링 섬유소 기반 조직의 면역 조직 및 제약 조건의 적용에서 생성하고 세포와 콜라겐 (재) 조직을 유도하는 스트레인

설치류 모델에서 LAD 결찰에 의한 심근 경색을 치료하는 biograft의 주입은 통상적으로 두 개의 심장 절개 수술을 요구하고있다. 사망률 감소 및 세포와 연관된 고체 및 젤라틴 biomatrices의 정착을위한 최적의 조건을 제공하기 위해, 최소 침습 절차가 개발되었다.

쥐에서 심장 마비에 대한 세포 기반 치료 : 심근 경색에 대한 두 개흉술 및 세포 및 Biomatrix의 심 외막 이식

이 프로토콜은 하이드로겔 시스템과 피브린 기반 접착제를 사용하여 심근 경색의 줄기 세포 치료를 위한 불량한 세포 생착의 한계를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 사용하면 경색 후 세포와 조직의 접촉을 유지할 수 있어 손상 부위에서 유익한 제제의 치료 잠재력을 높일 수 있습니다.

하이드로 겔은 구축 및 쥐 심근 경색 모델에서 치료를 제공하기 위해 접착제 접근을 섬유소 기반.

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

여기 우리는 복잡 한 형상의 설계 조직 히드로-기반 생산에 사용할 수 있는 사용자 지정입니다 금형 날조를 위한 신속 하 고, 손쉬운, 고 저가 방법 제시. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 생산 조작된 심장 조직에서 실시 하는 기계 및 조직학 평가 결과 설명 합니다.

사용자 지정 레이저 에칭 마스터스에서 조직 문화 금형 설계

줄기 세포 기지를 둔 치료는 심근 경색 후에 부상당한 심장 조직을 복구하는 능률적인 전략으로 부상했습니다. 우리는 효소적으로 교차 연결 될 수있는 젤라틴 하이드로 겔을 사용하여 줄기 세포 이식에 대한 최적의 생체 내 응용 프로그램을 제공합니다.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

배우세요 섬유소 히드로겔에 신생 쥐 심근세포를 캡슐화하여 심장 조직 공학 모델을 만드는 방법을. 2주 배양 후 수축력과 세포 생존율을 평가하는 기술을 익히세요.

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

더 많은 동영상 탐색