Name: 비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 학습하세요 속도 검색 공촛점 현미경과 마이크로엔도스코피 구축 방법을. 표준 부품을 활용한 맞춤형 실시간 영상 시스템으로 신경과학 및 생물물리학 연구에 유연하고 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.

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저자는이 프로젝트의 지원 ThorLabs 감사하고 싶습니다. AJN은 NSF 대학원 원정대의 지원을 인정하고자합니다. 이 작품은 부분적으로 NIH 원장의 새로운 혁신 보너스 프로그램을 통해 국립 보건원, OD007096 - 01 DP2 부여 번호 1 후원했다. 새로운 혁신 보너스 프로그램에 대한 정보는에 있습니다 <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . 저자는 하버드 전자 연구실 사용에 대한 톰 헤이스 감사하고 싶습니다.

<ol><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Springer Verlag. 985-985 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li>
<li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li>
<li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li>
<li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li>
<li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+%28Cell-viZio%29+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li>
<li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Endoscopica%22%5BJournal%5D)">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li>
<li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li>
<li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+optics%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li>
</ol>

이 비디오이 비디오 생산은 Thorlabs 주식 회사가 후원했습니다

이 비디오 속도 이미징 시스템은 약 8 kHz에서에서 공진 갈바 노 미러 작동을 사용합니다. 최대 전력으로 실행하면 공진 거울은 아주 크게 될 수 있으며, 높은 피치는 충분한 노출 시간 귀찮은 심지어 위험할 수 있습니다. 여기 증명하지지만, 그것은 상당히 시스템 볼륨 및 / 또는 귀마개 적절한 청력 보호 장비를 착용을 줄이기 위해 투명 케이스 내부의 공진 갈바 노 미러를 방어막을 권장합니다. 공진 갈바 노 미러는 sinusoidal 패턴에서 검색합니다. 그러나, framegrabber 카드 신호가 수평 및 수직 방향 모두에서 완전히 선형 스위프 속도를 가정에 참조하십시오. sinusoidal 청소는 검사의 가장자리에 속도가 느려집니다 때문에, 이미지 압축 아티팩트가 빠른 (가로) 이미지 축을 따라 볼 수 있습니다. 이 문제를 최소화하기 위해 한 가지 방법은 의도적으로 공진 갈보 미러 스캔 범위를 드라이브보다 훨씬 큰릴레이 렌즈 직경. 이렇게에서 sinusoidal 스캔 패턴은 거의 선형 스위프 중앙 이​​미지 왜곡을 최소화, 샘플을 트래버스합니다. 또 다른 방법은 빠른 축을 linearize에 게시 프로세스 이미지 수집하는 것입니다. 이것은 이미지로 알려진 형광 패턴 (예 : 격자 등) 완성하고 수집된 이미지를 unwarps 처리 스크립트를 만들 수있는 알려진 패턴 크기를 사용하실 수 있습니다. 이 특정 스캔 시스템은 종종 수직 지향 비디오 속도 현미경을 필요로 생체내 이미징에의 목적을 위해 설계되었습니다. 세포 이미징 실험을 위해, 거꾸로 현미경 더 일반적으로 사용됩니다. 여기에 제시 디자인은 쉽게 그러한 거꾸로 현미경을 구축하기 위해 변경할 수 있으며 필요하다는 것을 모두가 마지막 2 &quot;직경 미러의 회전이다. 대신 아래 스캔 광선을 직접하기 위해 거울을 orienting의 거울 위쪽으로 광선을 직접하실 수 있습니다. 목적 렌즈 배치t 샘플 무대와 함께 미러에서 동일한 거리는 반전 도형에 이미지를 허용합니다. 이미징 시스템 microendoscopic 이미징에 대해 전적으로 건설하는 경우, 전혀 수직 현미경의 디자인을 &quot;접는&quot;이유가 없습니다. 대신, 전체 검사 시스템은 광학 테이블에 객관적인 렌즈 지향 병렬로 단일 수평 브레드 보드에 만들 수 있습니다. 이것은 대부분의 상용 공촛점 현미경에서 찾을 수로보다 다양한 시스템을 desiring 사용자가 변수 핀홀를 통합하는 것이 좋습니다, 그 위대한 빌드 단순과 정렬의 편의를 위해 제공하고 있지만,이 빌드의 현미경은 고정 핀홀 구성을 사용합니다. 사용자가 방출 강도 변화의 샘플을 보완할 수있는 핀홀의 크기를 조정할 수 있도록함으로써, 이것은 사용자가 더 주어진 샘플에 대한 신호 강도와 해결 사이의 거래와를 최적화 할 수 있습니다. 채널현미경에 대해 선택한 이미지 섬유 oice은 중요하다. 우리가 그들의 가까운 섬유 코어 간격과 낮은 상대 autofluorescence로 인해 스미토모 일관된 이미지 섬유를 사용하는 것이 좋습니다. Fujikura 제조한 이미지 섬유 샘플에서 약한 형광 신호를 압도하고 microendoscope의 궁극적인 감도를 제한할 수 있습니다 autofluorescence 10 높은 금액을 가지고 발견되었습니다. 이와 특별한 설정에 사용되는 8 - 30N으로 스미토모 제조 섬유, 자신의 Fujikura 등가물보다 훨씬 낮은 수준 autofluorescence 있습니다. leeched 섬유 번들이 microendoscopy에 대한 매력적인 것으로 간주 수도 있지만, 그들의 디자인은 일반적으로 섬유 코어 띄엄띄엄 샘플 개체, 잠재적인 이익의 상당 지역을 떠나는 것을 의미합니다 너무 멀리 떨어져 각각의 광섬유 코어를 배치합니다. 마지막으로, 그것은 현미경 여기서 설명하는 동안 체외 및 생체내 applicati의 다양한 유용하게 사용될 수 있다고 지적한다기능하며 완벽한 기능을 갖춘 상용 시스템의 비용의 일부에 대해 만들 수 있습니다, 그것은 전송 빛 감지, 볼 접안 렌즈, 또는 비 공촛점 widefield epifluorescence에 대한 빔 경로 같은 기능을 가지고 있지 않습니다. 그것이 처음부터 이러한 기능을 가진 시스템을 구축 할 수 있지만, 그러한 시스템을 desiring 독자들의 요구를 충족보다는 완전히 새로운 빌드 시작하는 기존의 상용 시스템을 수정하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 부품 이름 </td><td> 제조 업체 </td><td> 항목 번호 </td><td> 사양 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 515 NM 밴드 패스 필터 </td><td> 채도 </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 25.4mm의 디아. X 50mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT49 - 766 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 25.4mm의 디아. X 76.2mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT49 - 768 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 25.4mm의 디아. X 88.9mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT49 - 769 </td><td></td><td> 이 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 50mm 디아. X 300mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT45 - 179 </tD&gt; <td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 8 kHz에서 R은 고주파 광 스캐너 </td><td> 전기 광학 제품 공사 (EOPC) </td><td> SC - 30 </td><td> 8 kHz에서 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> AGC 드라이버 </td><td> 전기 광학 제품 공사 (EOPC) </td><td> ACG : 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422 - PA Photosensor 모듈 </td><td> 하마 마츠 </td><td> H7422 - PA </td><td> 현재 권장 제한 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> M9012 전원 공급 장치 </td><td> 하마 마츠 </td><td> M9012 </td><td> H7422 - PA와 함께 사용하기위한 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS 목표 </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA Framegrabber 카드 </td><td> 에서 Matrox </td><td> Solios EA / XA </td><td> MIL 소프트웨어 필요; OEM 권장 인터커넥트 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 12V 전원 공급 </td><tD&gt; Meanwell </td><td> LPV - 100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 배 현미경 목표 렌즈 </td><td> 뉴 포트 </td><td> M - 5 배 </td><td> 0.10 NA, 25.4 mm 초점 거리 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 코히어런트 이미지 섬유 </td><td> 스미토모 </td><td> 8 - 30N </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 캡 스크류 및 하드웨어 키트 </td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT2 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 100 μm의가 핀홀을 탑재 </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td> 공간 필터를 건물에 적합 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 30mm의 케이지 큐브 클램프 </td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 30mm의 케이지 시스템 큐브, 4 웨이 </td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 406 NM, 5 MW, B 핀 코드, SM 섬유 Pigtailed 레이저 다이오드, FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS - 406 - FC </td><td> 오래된 제품, LP405 - SF10로 대체 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 5 분 에폭시, 1 온스 </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 6 축 운동학 광학 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 8-32 모자 스크류 및 하드웨어 키트 </td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT1 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 8-32 Setscrew 및 하드웨어 키트 </td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT3 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 외부 RMS 스레드와 내부 SM1의 스레드와 어댑터 </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 형용사. FC / PC와 FC / APC 콜리 메 이터, F = 2.0 mm, ARC : 400-600 NM </td><td> ThorLabs </td><td> CFC - 2X - A </td><td> F = 2.0 mm </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 조정 광섬유 콜리 메 이터 어댑터, 스레드 SM1 </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 알루미늄 브레드 보드, 12 &quot;X 18&quot;X 1 / 2 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20은 스레드 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> Benchtop 레이저 다이오드 / TEC 컨트롤러 </td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 일 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm의 긴 패스 이색성 거울 </td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;광학에 대한 운동학 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> ThorLabs 섬유 - Pigtailed 레이저 다이오드에 대한 LD / TEC 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Ø18 mm 광학 렌즈 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td> 한 유지 링 포함 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 2 &quot;광학 렌즈 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td> 리테이너 링 포함, 내부 및 외부 스레딩과 함께 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 미니 시리즈 케이지 어셈블리로드, 6 &quot;길고 Ø4 mm, 수량 1. </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;받침대 기둥 포스트, 동경 8-32 탭, 1&quot;롱 </td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;기둥 포스트 확장, 길이 = 0.5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;기둥 포스트 확장, 길이 = 0.75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;보호된 실버 미러, 두꺼운 3.2 mm </td><td> ThorLabs </td><td> ME1 - P01 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 회전 조절 초점 요소, L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </tD&gt; <td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> O2 &quot;보호된 실버 미러, 두꺼운 3.2 mm </td><td> ThorLabs </td><td> ME2 - P01 </td><td></td><td> 이 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 μm의가 핀홀을 탑재 </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 폴라리스 낮은 드리프트 Ø1 &quot;동적 미러 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> 폴라리스 - K1 </td><td> 낮은 드리프트 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> SM1 렌즈 튜브, L = 1 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L - 10 </td><td> 한 유지 링 포함 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 스레드 30mm의 케이지 플레이트, 0.35 &quot;두꺼운 </td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 이 </td></tr><tr><td> SM1에 M25 광학 구성 요소 스레딩 어댑터 </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td> 외부 SM1 스레드와 내부 M25.5x0.5 스레드 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 소형 빔 Diameter 갈보 시스템 </td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 작은 클램핑 포크 </td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 25분의 1 &quot;은 보편를 슬롯 counterbored </td><td> 15 </td></tr><tr><td> 공간 필터 시스템 </td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td> 핀홀은 별도 판매 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 5.6 &amp; 9mm 레이저에 대한 TE - 냉각 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Breadboards에 대한 수직 브라켓 </td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td> 각각의 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 계획 - 고차 색지움 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 일 </td></tr></tbody></table>

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 microendoscopy

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

공촛점 현미경은 빠르게, 높은 감도, 복잡한 시스템의 고해상도 광학 sectioning을 지원, 생물학과 생물 의학 과학에서 귀중한 도구가되고있다. 공촛점 현미경은 정기적으로 세포 2-4 생활에서 특정 세포 목표 1, 모니터 역학을 공부하고, 전체 생물 5,6의 입체 진화를 시각화하는, 예를 들어, 사용됩니다. 같은 공촛점 microendoscopes 같은 공촛점 이미징 시스템의 확장은 생체내 7 고해상도 이미징을 허용하고 현재 임상 설정 8,9에서 질병 이미징 및 진단에 적용되고있다. 공촛점 현미경은 간단한 기하학적 광학를 사용하여 소위 &quot;광학 섹션&quot;을 만들어 입체적인 해상도를 제공합니다. 표준 넓은 필드 현미경에서는 시료에서 발생하는 형광는 객관적인 렌즈에 의해 수집되고 검출기에 직접 전달. 수락 동안영상 얇은 샘플 수, 두꺼운 샘플은 객관적 초점 비행기 위 아래에 생성된 형광에 의해 흐려된다. 대조적으로, 공촛점 현미경은 거부하고, 샘플을 가상, 광학 sectioning 수 밖 초점 샘플 고해상도 입체 표현을 빌드하는 빛을. 공촛점 현미경은 검출 빔 경로에 공촛점 조리개를 사용하여이 위업을 달성. 목적으로 샘플의 수집 형광은 스캐닝 미러 통해 기본 이색성 거울, 조심스럽게 이상 스톡스 - 이동 형광 방출을 통과하는 동안에는 레이저 여기 빔과 같은 짧은 파장을 반영하기 위해 선택한 거울을 통해 다시 릴레이입니다. 이 긴 파장 형광 신호는 다음 목적 렌즈의 초점 비행기와 정확하게 활용 비행기에 위치하는 핀홀의 양쪽에 렌즈 한 켤레에 전달됩니다. 객체의 초점 볼륨에서 수집 광자는 collimated 아르객관적인 렌즈로하며 핀홀을 통해 공촛점 렌즈에 의해 초점이 있습니다. 초점 평면 위나 아래에 생성된 형광 따라서 제대로 collimated되지 않습니다, 그리고 현미경 초점에서 단 표시등이 표시되는 광학 섹션을 만들고, 공촛점 핀홀 하나 통과되지 않습니다. (그림 1). 따라서 핀홀 효과적으로 한 제한된 공간 위치 감지 방출 confining, 초점 비행기에서 가상 조리개 역할을합니다. 현대 상업 공촛점 현미경은 비교적 간단하고 접근 이전에 복잡한 이미징 절차를 만드는 사용자에게 완전 자동화된 작업을 제공합니다. 이러한 시스템의 유연성과 전력에도 불구하고, 상업 공촛점 현미경 잘 같은 생체내 이미징 애플 리케이션에서 많은 같은 모든 공촛점 이미징 작업에 적합하지 않습니다. 그들의 요구를 충족하기 위해 맞춤형 이미징 시스템을 만들 수있는 능력이 없다면, 중요한 실험 reac 밖으로 남아있을 수많은 과학자에 H. 이 문서에서는, 우리는 기본 구성 요소에서 사용자 지정, 비디오 속도 공촛점 이미징 시스템의 전체 구조에 대한 단계별 방법을 제공합니다. 직립 현미경은 표준 속도 공진 갈바 노 미러 느린 축 스캔되지만, 빠른 스캔 축을 제공하기 위해 공진 갈바 노 미러를 사용하여 구축됩니다. 목적 렌즈 초점이 정확한 스캔 빔을 만들려면 다음과 거울 네 개의 릴레이 렌즈를 사용하여 소위 telecentric 비행기에 위치합니다. 공촛점 감지는 표준 재고품 photomultiplier 튜브 (PMT)를 사용하여 달성되며, 이미지 캡처와에서 Matrox의 framegrabber 카드 및 포함된 소프트웨어를 사용하여 표시됩니다.

사용자 정의, 실시간 공촛점 스캐닝 이미징 시스템의 전체 구조는 설명합니다. 쉽게 동영상 속도 현미경 및 microendoscopy 사용할 수있는이 시스템은, 비용의 일부로 표준 상용 공촛점 시스템을 사용하여 액세스할 수 없습니다 이미징 형상 및 응용 프로그램의 배열을 허용합니다.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

공초점 현미경(Confocal microscopy)은 생물학 및 생의학 분야에서 매우 가치 있는 도구가 되었으며, 신속하고 민감도가 높으며 해상도가 뛰어난 광학적...

본 영상에서는 표준 기성 부품들을 사용하여 비디오 속도 스캐닝 공초점 현미경을 제작하는 방법을 보여줍니다. 스캐닝 공초점 현미경은 래스터 평면 전체로 빔을 이동시키기 위해 두 개의 스캐닝 미러가 협응하여 움직이는 원리를 이용합니다. 첫 번째 미러에서 나온 빛은 첫 번째 릴레이 렌즈 세트를 통해 수평으로 스캔되며, 다시 두 번째 스캐닝 미러의 고정된 한 점으로 집중됩니다. 이후 동일한 스캐닝 동작이 스캔 렌즈와 튜브 렌즈를 통해 전달되어, 확장된 광빔이 대물렌즈의 후면 조리개에 위치하게 됩니다.첫 번째 거울에 비해 움직임이 느린 두 번째 거울은 Y축을 동시에 스캔하여, 그림에 표시된 평면의 위아래로 스캔 동작이 가능하게 함으로써 시료 표면에 직사각형 래스터를 생성합니다. 상용 현미경을 구매하는 것보다 이 프로토콜이 갖는 주요 장점은 저렴한 비용과 이미징 프로젝트의 특정 요구 사항에 맞춰 기기를 맞춤 설정할 수 있다는 점입니다. 모든 레이저를 사용할 때는 눈의 부상을 방지하기 위해 적절한 안전 조치를 취하는 것이 필수적입니다.가능한 한 항상 적절한 레이저 보안경을 착용하십시오. 빔을 정렬하거나 직접 작업하지 않는 참관인 또는 연구원은 반드시 보안경을 착용해야 합니다. 빛나거나 반사되는 시계 또는 장신구는 모두 제거하십시오.가장 중요한 점은 빔 블록이나 고정된 명함 등을 사용하여 빔의 경로를 차단함으로써 항상 빔을 추적하고 제어해야 한다는 것입니다. 이는 빔의 경로를 예측하기 어려울 수 있는 미러 정렬 과정에서 특히 중요합니다. 또한, 절대로 눈의 높이를 빔 경로와 일치시키지 마십시오.현미경을 조립하기 전, 빔 경로를 가로질러야 하는 경우 레이저를 끕니다. 광학 브레드보드와 90도 브래킷, 모든 거울, 렌즈 및 다이크로익 미러를 비롯하여 적절한 클램프와 장착 하드웨어, 두 개의 스캐닝 거울 및 광검출기를 포함하여 조립에 필요한 모든 장비가 준비되었는지 확인하십시오. 또한 정렬 과정 중에 스캐닝 동작을 테스트하고 거울을 조작하기 위해 함수 발생기를 가까이 두는 것이 유용합니다.안정성을 위해 브레드보드를 볼트로 고정하는 것을 강력히 권장합니다. 피그테일 파이버 어댑터를 광학 마운트에 장착하고, 이 어셈블리를 광학 브레드보드 중앙에 배치하여 현미경 구축을 시작하십시오. 이는 여기에 표시된 것과 같이 청색 빔의 시작점에 해당합니다.광원을 켭니다. 조절 나사를 사용하여 빔이 수평 및 수직 방향 모두에서 직선으로 진행하도록 대략적으로 조정합니다. 파이버 콜리메이터 앞에 아이리스를 배치합니다.다음으로, 빔이 중심을 통과하도록 조리개의 높이를 조정합니다. 그런 다음 빔 경로를 따라 조리개를 ator에서 멀리 이동시킵니다. 빔의 정렬 상태를 확인합니다.필요한 경우, 두 개의 조정 나사를 사용하여 조리개 위 빔의 위치를 다시 조정하십시오. 레이저 빔이 거울의 중앙에 위치하도록 마운트된 이색성 거울을 빔 경로에 배치하십시오. 빔의 높이가 변하지 않도록 주의하면서, 거울 홀더를 회전시켜 빔이 약 90도로 반사되게 하십시오.마운트의 나사를 조여 거울을 테이블에 고정합니다. 다음으로, 마운트된 공진 갈바노미터 거울을 레이저 빔 경로에 배치합니다. 이때 레이저 빔이 거울 표면의 정확한 수평 중앙에 위치하도록 주의하십시오.미러 마운트를 회전시켜 레이저 빔이 90도 각도로 반사되도록 합니다. 그다음, 레이저 빔의 수직 높이를 동일하게 유지하도록 미러의 반사 각도를 대략적으로 조정합니다. 이어서, 아이리스 2개를 가져와 공진 갈바노미터(resonant gal) 바로 앞에 배치합니다.그 다음, 공진 갈바노 미러(resonant gal mirror)에서 반사된 레이저 빔을 기준으로 삼아, 이전과 동일하게 수직 높이를 설정합니다. 이제 광학 브레드보드의 나사 구멍을 눈금 가이드로 사용하여 두 개의 아이리스(iris)를 직선상에 고정합니다. 경로상의 첫 번째 미러인 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 조정하여 첫 번째 아이리스의 중심에 빔이 오도록 맞춥니다.그런 다음 경로에 있는 두 번째 거울을 조정합니다. 빔이 두 번째 iris의 중심에 오도록 resonant gal을 조절하십시오. 빔이 두 iris를 모두 통과하여 정렬될 때까지 이 두 거울을 반복적으로 조정합니다.공진 갈바노 미러(resonant gal mirror)에서 반사된 레이저 빔이 여전히 미러의 대략적인 중심에서 반사되는지 확인합니다. 빔이 편향된 경우, 파이버 콜리메이터 마운트를 조정하고 두 개의 개방된 조리개 중앙에 빔이 위치하도록 조정을 반복합니다. 다음 단계는 첫 번째 고정 텔레센트릭 평면을 두 번째 고정 텔레센트릭 평면에 결상시키는 두 개의 릴레이 렌즈를 배치하는 것입니다.이 특정 현미경의 경우, 첫 번째 릴레이에서 선택된 렌즈들은 동일한 초점 거리 F를 가지므로, 여기서 두 거울 사이의 거리는 단순히 4F가 됩니다. 이 설정에서 F는 90mm이므로, 4F 위치는 스캐닝 거울로부터 360mm 떨어진 지점이 됩니다. 렌즈가 빔 경로의 중심에 정확히 위치하도록 하려면, 첫 번째 렌즈를 빔 경로에 배치하고 빔 경로상에 있는 다음 조리개에 맺힌 레이저 빔 스폿을 확인하십시오. 렌즈를 배치한 후, 빔의 수직 중심이 조리개 중심에 오도록 렌즈 높이를 조정하십시오.다음으로, 조리리 중심에 빔이 위치하도록 수평 빔 위치를 조정합니다. 두 번째 렌즈에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 이어서 스캐닝 미러를 설치하고 현미경을 회전시켜, 수직으로 조정해야 하는 부품들을 보다 간편하게 배치하고 정렬할 수 있도록 합니다.두 번째 텔레센트릭 평면(tele centric plane)의 정확한 위치를 찾으려면, 공진 갈바노미터(resonant galvo)를 스캐닝 유닛에 연결하고 전원을 켭니다. 명함을 사용하여 두 렌즈를 통과하는 스캐닝 빔의 경로를 추적하십시오. 두 번째 텔레센트릭 평면은 공진 갈바노미터로부터 약 4F 떨어진 곳에 위치하며, 스캐닝 빔이 정지해 있는 것처럼 보이는 지점으로 확인할 수 있습니다.이 위치의 브레드보드 아래에 연필로 표시하십시오. 텔레센트릭 평면(tele centric plane)이 확인되면, 스캐닝 미러 입력을 0V로 설정하고 미러 제어 하드웨어의 전원을 켜서 미러가 중립 위치에 안착하도록 합니다. 그런 다음 표준 스캐닝 Galil 미러를 텔레 평면의 정확한 위치에 배치하십시오.텔레 평면(tele plane)에서의 빔이 스캐닝 미러의 정확한 중심에 닿도록 미러 위치를 조정한 후 미러 마운트를 조입니다. 이제 갈바노 미러(gal mirror)를 고정하는 잠금 나사를 풀고 미러를 회전시켜 빔이 수직으로 전파되는지 확인합니다. 그런 다음 레이저와 스캐닝 전자 장치를 끕니다.광섬유와 스캐닝 미러의 연결을 해제하십시오. 그런 다음 90도 브레드보드 장착 브래킷을 사용하여 두 번째 브레드보드를 첫 번째 브레드보드에 고정하십시오.마지막으로, 새로운 브레드보드가 평평하게 놓이도록 현미경 전체를 조심스럽게 회전시킨 후, 클램프를 사용하여 현미경을 해당 위치에 고정하십시오. 여기서 gal o와 레이저를 다시 연결하고, gal O를 0 V로 되돌리는 것을 잊지 마십시오. 이전에 수직으로 구성했던 나머지 설정은 평평한 브레드보드 위에서 간편하게 수행할 수 있습니다.다음으로, 공식적으로 스캔 렌즈 및 튜브 렌즈라고 불리는 두 번째 릴레이 렌즈 세트를 설정하겠습니다. 적절한 렌즈 조합을 선택하는 방법에 관한 매우 중요한 정보는 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 먼저 렌즈를 설치하는 것부터 시작하십시오.먼저, 빔을 대물렌즈로 유도하는 데 필요한 거울들을 배치합니다. 첫 번째 2인치 대형 거울을 브레드보드 가장자리 근처에 놓고, 거울 마운트를 회전시켜 레이저 빔을 대략 90도 방향으로 반사시킵니다. 거울의 반사 각도를 조정하여 빔의 수직 높이를 동일하게 유지하십시오.그런 다음, 다른 2인치 거울을 브레드보드의 반대쪽 끝에 배치하여 빔이 90도 각도로 향하게 하고, 조정 나사를 사용하여 위치를 고정합니다. 다음으로, 두 개의 아이리스를 설치하고 앞서와 같이 두 거울을 조정하여 빔을 중앙에 맞춥니다. 그런 후, 빔 경로 상의 gal로부터 초점 거리만큼 떨어진 위치에 스캔 렌즈를 배치하고 수평 및 수직 위치를 조정합니다.두 거울 사이의 첫 번째 조리개에 레이저 스폿을 맞춥니다. 2인치 대형 튜브 렌즈를 스캔 렌즈로부터 적절한 거리에 조심스럽게 배치하고, 수평 및 수직 위치를 조정하여 첫 번째 조리개 중앙에 빔이 오도록 합니다. 이 설정에서 튜브 렌즈는 모든 구성 요소가 배치된 상태로 75 millimeters 더해 300 millimeters 거리에 위치합니다.갈 O를 표준 전기 함수 발생기 또는 제어 회로의 출력단에 연결하고, peak-to-peak 전압을 1~3 V로 설정하십시오. 그 다음 명함 등을 사용하여 두 거울을 스캔하기 시작하십시오. 튜브 렌즈 뒤 300 mm 지점의 정지 평면에서 레이저 빔의 위치를 찾으십시오.대물렌즈를 빔 경로에 배치하고, 대물렌즈의 후방 개구면이 정지 평면에 최대한 가깝게 위치하도록 합니다. 샘플 스테이지를 설치하고, Z축 이동 마운트가 가동 범위 내에서 이동할 때 대물렌즈 마운트에 충돌하지 않는지 확인하십시오. 컨포컬, 핀홀 및 검출기를 설정하려면 먼저 모든 전원 공급 장치와 광섬유의 연결을 해제하는 것부터 시작하십시오.현미경 어셈블리를 회전시켜 공진 스캐닝 미러를 고정한 상태로 다시 브레드보드 위에 놓습니다. 콜리메이터와 표준 스캐닝 미러, 전원, 공급 및 제어 케이블을 다시 연결한 후, 이전과 같이 스테이지의 표준 스캐닝 gal을 구동하는 제어 전압을 0 V로 설정하고, 두 개의 커버 슬립 사이에 밝은 염료 샘플을 샌드위치 형태로 배치합니다. 그런 다음 레이저 광원을 켜고 염료에 초점을 맞춥니다.명함(business card)을 사용하여 형광이 최대한 밝게 나타나도록 레이저 출력을 조정합니다. 시료에서 방출된 형광이 대물렌즈와 스캐닝 시스템을 거쳐 다이크로익 미러(dichroic mirror)로 전달되는 경로를 추적하십시오. 다이크로익 미러는 레이저 빔은 반사하고 형광 방출 광선은 투과시킵니다. 다이크로익 미러의 반대편에서 이 형광 신호를 찾으십시오.이제 실내 조명을 낮추십시오. 이색 거울(dichroic mirror) 뒤에 거울을 배치하여 방출광을 90도 각도로 반사시킵니다. 그다음 거울이 부착된 아이리스(iris)를 사용하여 형광 빔이 브레드보드와 최대한 직선이며 평행하게 진행되도록 유도하십시오.다음으로, Thor Labs의 공간 필터 케이지 마운트 어셈블리를 사용하여 공초점 핀홀 유닛을 설정합니다. 이 도표는 설정 과정을 개략적으로 보여줍니다. 스캐닝 미러는 고정된 대물렌즈와 텔레포커스(tele) 위치에 있는 고정 평면에 배치됩니다.정지 평면 사이의 후면 개구 평면 렌즈 쌍은 스캔된 빔을 전달하는 역할을 합니다. 첫 번째 렌즈 쌍은 초점 거리가 동일하여 1:1 망원경을 형성합니다. 공식적으로 스캔 렌즈와 튜브 렌즈로 알려진 두 번째 렌즈 쌍은 초점 거리가 동일할 필요가 없으며, 종종 대물렌즈의 후면 개구가 과충전되도록 보장하는 빔 확장 망원경 역할을 합니다.시료에서 방출된 빛은 스캐닝 시스템을 통해 되돌아와 다이크로익 거울을 통과합니다. 단초점 렌즈 또는 대물렌즈가 방출광을 공초점 핀홀로 집속시키며, 이후 렌즈에 의해 병행광으로 만들어집니다. 마지막 렌즈는 공초점 필터링된 방출광을 광전증배관에 집속시킵니다.첫 번째 집광 렌즈 마운트가 방출 빔의 중심에 오도록 주의하며 공간 필터 유닛을 방출 빔 경로와 일직선으로 배치하십시오. 본 실험에서는 핀홀 크기가 100 microns인 공간 필터 유닛을 선택하였습니다. 다음으로, 유닛에 짧은 초점 거리 렌즈를 장착하고 핀홀 표면에서 명확한 초점이 관찰될 때까지 Z축 이동 마운트를 슬라이드하십시오.전체 장치가 형광 빔이 설정한 직선을 따라 정렬되었는지 확인하십시오. 장치를 브레드보드에 고정합니다. 이제 이동 스테이지의 조절 노브를 사용하여 두 축을 조정함으로써 핀홀 마운트 표면에 대해 2D 검색을 수행하고, 핀홀을 통과하는 형광 신호가 최대가 되는 지점을 찾으십시오.다음으로, 핀홀 뒤의 케이지 마운트에 코팅 렌즈를 배치합니다. 명함 등을 사용하여 컨포컬 유닛을 통과하는 형광 이온을 찾고, 방출되는 형광이 최대한 평행하게 정렬될 때까지 포스트를 따라 코팅 렌즈를 슬라이드하며 조정합니다. 광전증배관(photo multiplier tube) 어셈블리를 설치합니다. 형광 방출 빔 경로에 50 millimeter 초점 거리 렌즈를 배치하고 그 초점을 찾습니다.브레드보드 위에 이 위치를 표시하십시오. 이제 레이저를 완전히 끄고, 광전증배관의 창이 표시된 초점 위치에 최대한 가깝게 위치하도록 배치하십시오. 그런 다음 조절 가능한 렌즈 튜브를 사용하여 어셈블리를 집광 렌즈에 연결하십시오.핀홀 이후의 모든 노출된 빔 경로를 검은색 테이프로 감싸고, 레이저 출력을 매우 낮게 유지한 상태에서 레이저를 켭니다. 오실로스코프에서 전압을 주의 깊게 확인하며 광전자 증배관(photomultiplier tube)을 켭니다. 레이저 강도를 높이면서, 오실로스코프 화면에 스파이크 형태의 판독값 또는 DC 오프셋이 나타날 때까지 전압을 높입니다.레이저 전원을 끄거나 빔 경로를 차단하여 신호가 사라지는 것을 확인 함으로써, 이 신호가 실제로 형광에서 비롯된 것인지 확인하십시오. 마지막으로, 오실로스코프에서 신호가 최대가 되도록 핀홀을 반복적으로 정렬하십시오. 먼저 포커싱 렌즈의 Z 위치를 조절한 다음 YZ 이동 스테이지를 조정하면, 비디오 레이트 현미경 하드웨어 구성이 완료됩니다.먼저, 광전증배관(photo multiplier tube)의 전원을 끕니다. 이제 함께 제공된 서면 프로토콜의 도식에 따라 거울 맞춤형 제어 보드와 컴퓨터를 연결하십시오. 이 시스템은 공초점 스캐닝 미세 내시경 검사를 수행하는 용도로 조정하여 사용할 수 있습니다.스테이지를 광섬유 고정 스테이지로 교체하는 방법은 첨부된 텍스트 또는 세부 사항을 참조하십시오. 완성된 정립형 공초점 주사 현미경과 마이크로 내시경은 여기 보이는 것과 같은 모습이어야 합니다. 레이저 빔과 방출 빔은 이해를 돕기 위해 표시되었습니다.마이크로 내시경 수술 중, 파이버 마운트는 실험을 위해 이미지 파이버를 고정하는 역할을 합니다. 이 파이버 마운트는 용도에 따라 XY 스테이지로 쉽게 교체할 수 있습니다. 여기에 표시된 정립 현미경 플랫폼은 비디오 속도 프레임 그래버 카드를 사용하여 수신 신호로부터 이미지를 생성함으로써, 흰색 명함에 인쇄된 소문자 M을 촬영한 대표적인 테스트 이미지입니다.탈색됨.백색 용지는 UV 및 청색광에 의해 쉽게 흥분되는 형광 물질을 포함하고 있어, 어두운 부분 뒤로 밝은 배경이 나타납니다. 이러한 형광 방출을 수집하기 위해 M 렌즈와 515 nanometers 중심의 방출 필터가 선택되었습니다. 이미지 프레임의 측면 가장자리 근처에서 약간의 이미지 왜곡이 관찰될 수 있습니다.이러한 왜곡은 8 kHz gvo 거울의 사인파 스캐닝 패턴으로 인해 발생하며, 동봉된 문서에서 자세히 다룹니다. 이 영상은 명함을 스캔하여 얻은 샘플 비디오 속도 데이터를 보여줍니다. 이 영상을 시청함으로써 비디오 속도 공초점 스캐닝 현미경을 제작하고 정렬하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.레이저 광원을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 모든 반사성 장신구를 제거하고 눈의 높이가 빔 라인과 일치하지 않도록 하는 등의 주의 사항을 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

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