Name: 혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 혈액 배양에서 세균 병원체를 신속하게 식별하고 항생제 감수성을 평가하는 PCR 기반 워크플로우를. 16S 리보솜 DNA 다중 PCR 분석을 활용하여 당일 내에 결과를 얻을 수 있는 이 방법은 임상 진단에 효율적입니다.

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부 I : 병원균 식별 1. 샘플 준비 참고 : 다음과 같은 프로토콜에서 설명하는대로 전체 분자 흐름이 분자 진단에있어서의 품질 보증 3에 대한 권장 사항에 따라 수행되어야한다. <ol><li> 1시 10분 희석 샘플이 될 1.5 ML 반응 관에 0.9 % NaCl 0.9 ML에 혈액 문화의 0.1 ML의 나누어지는을 추가합니다. (희석 qPCR 억제를 방지하기 위해서). </li><li> 펠렛 5 분 박테리아 DNA를 13,400 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 100 μl 멸균 demineralised H 2 O를 안에 세균 펠릿을 Resuspend </li><li> 4 ° C까지 추가로 사용에서 DNA 샘플을 보관합니다. </li></ol> 2. 식별 분석 : 실시간 16 rDNA PCR <ol><li> 다음과 같이 반응 섞어 준비합니다. 분석은 시료 당 4 개의 별도의 반응으로 구성되어 있습니다. 각 혼합물은 12.50 μl 마스터를 포함믹스, 0.9 μm의 순방향 프라이머 (5 TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0.6 μm의 역방향 프라이머 (5 GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 프로브의 패널. 프로브의 금액은 아래에있는 네 개의 별도의 반응 각각에 대해 제공됩니다. </li><li> 첫 번째 반응은 다음과 같습니다 <ul><li> 0.2 μm의 범용 프로브 (5-식구들-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 </li><li> 0.2 μm의 P. 녹농균이라는 박테리아 프로브 (5 조-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> 두 번째 반응은 다음과 같습니다 <ul><li> 0.2 μm의 E. 대장균 프로브 (5 조-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) </li><li> 0.2 μm의 모나스 종. 프로브 (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) </li></ul></li><li> 세 번째 반응이 포함됩니다 : <ul><li> 0.2 μm의 포도상 SPP. 프로브 (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) </li><li> 0.2 μm의 S. 구균 프로브 (5-식구들-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) </li><li> 0.2 μm의 Enterococcus 종. (5 - 죠 - TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> 네 번째 반응이 포함됩니다 : <ul><li> 0.2 μm의 범용 프로브 (5-식구들-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) </li><li> 0.3 μm의 연쇄상 구균 SPP. 프로브 (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) </li><li> 0.2 μm의 S. pneumoniae 프로브 (5 조-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) </li></ul></li><li> 20 μl의 총 볼륨에 도달 멸균 demineralised H 2 O를 추가합니다. 96 - 웰 PCR 플레이트의 우물 각 반응 혼합물 20 μl를 추가합니다. </li><li> 각도에 샘플의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 96 - 웰 PCR 플레이트를 밀봉하는 접착제 필름을 사용합니다. </li><li> 다음과 같은 최적의 온도 사이클 조건을 사용하여 ABI 프리즘 7900HT 리얼 타임 PCR 시스템에 접시를 실행합니다 : <ul><li> 10 분 대한 ° C에서 50 미리 가열 </li><li> 15 분 95 ° C에서 초기 변성 </li><li> 42주기 <ul type="circle"><li> 15의 95 ° C에서 변성 </li><li> 1 분 동안 60 ° C에서 풀림 </li></ul></li></ul></li></ol> 3. 결과의 분석 <ol><li> 탭 분석 설정에서 0.1 CT 분석의 한계를 조정합니다. 6 월말 (주기) : 15 시작하는 기준 구성 (주기)를 좁힐. </li><li> 모든 샘플에 대한주기 임계값 (CT) 값을 기록합니다. 긍정으로서 PCR 결과를 고려할 컷 - 오프 값은 35 CT-값으로 설정할 수 있습니다. 혈액 배양에 존재하는 박테리아의 양은 CT-값을 35 이하로 발생, 10 7 10 11 CFU / ML로 원거리. </li></ol> 부 II : 항생제 자화율 시험 4. 긍정적인 혈액 배양 9 시부터 박테리아의 분리 <ol><li> 긍정적인 혈액 배양 병에서 국물의 5 ML을 기음과 혈청 분리관에 그 파일을 전송합니다. </li><li> 10 분 2000 XG에서 혈청 분리관을 원심 분리기. </li><li> 혈청 분리관에서 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 전송 BACteria는 멸균 면봉으로 튜브 겔 층에서 0.9 %의 식염수에 0.5 맥팔랜드 표준 정지 얻을 때까지. </li></ol> 5. 마이크로 Titre 플레이트의 접종 <ol><li> 5 × 10 5 CFU / ML의 현탁액을 형성하는 두 농축 뮐러 Hinton II 국물의 0.5 맥팔랜드 서스펜션을 희석. </li><li> 항생제 (표 1)의 선택을 포함하는 마이크로 titre 플레이트의 우물이 서스펜션을 추가합니다. </li><li> 6 H에 대해 37 ° C에서 마이크로 titre 판을 품어. </li><li> 4 ° C (마이너스 성장 제어 등)에 정지 나누어지는을 저장합니다. </li><li> 부화 6 H 후, 멸균 튜브에 각 우물의 콘텐츠를 전송할뿐만 아니라, 부정적인 성장 제어 샘플 4 ° C.에 저장된되었다 그 </li><li> 5 분 용 16,000 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 세균성 펠렛을 방해하지 않고, 표면에 뜨는를 제거합니다. </li><li> 멸균 demineralised H에 펠릿을 Resuspend <li> 멸균 demineralised H 2 O에 동안 10 배 샘플을 희석 </li></li></ol> 6. 실시간 16 rDNA PCR 10 <ol><li> 다음과 같이 PCR 혼합물 준비 : <ul><li> 12.50 μl IQ SYBR 녹색 Supermix </li><li> 앞으로 0.5 μm의 프라이머 16-1 (5 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 </li><li> 0.25 μm의 역방향 프라이머의 16-2 (5 TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 </li><li> 20 μl의 총 볼륨에 무균 demineralised H 2 O </li></ul></li><li> 96 - 웰 PCR 플레이트의 우물에 PCR 혼합물의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 각도에 샘플의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 96 - 웰 PCR 플레이트를 밀봉하는 접착제 필름을 사용합니다. </li><li> 다음과 같은 최적의 온도 사이클 조건을 사용하여 MyiQ 단일 컬러 리얼 타임 PCR 검출 시스템에 접시를 실행합니다 : <ul><li> 4 분 95 ° C에서 초기 변성 </li><li> 초기는 ° C ~ 30의 65에서 풀림 </li><li> 35주기 <ul><li> 9시 변성15의 5 ° C </li><li> 1 분 동안 60 ° C에서 풀림 </li></ul></li><li> (° C ~ 0.57 ° C 단위로 20 분 안에 60-95에서) 곡선 분석을 용융 </li></ul></li></ol> 7. 결과의 분석 <ol><li> 다음 수식 (항생제의 종류에 따라) 중 하나를 사용하여 절단 CT 값을 계산합니다. <ul><li> 일반적으로 : 컷 - 오프 CT 값 = CT 값 긍정적인 성장을 제어 + 0.5 X (CT 값 마이너스 성장 관리 - CT 값 긍정적인 성장을 제어) </li><li> Piperacillin, piperacillin / tazobactam과 그람 음성 막대의 ceftazidime, Amoxicillin, oxacillin과 트리 메소 / S.aureus의 설파 메 톡 사 졸, Enterococcus SPP의 Amoxicillin :. 컷 - 오프 CT 값 = CT 값 긍정적인 성장을 제어 + 0.25 X (CT 값 마이너스 성장 제어 - CT 값 긍정적인 성장을 제어) </li></ul></li><li> 긍정적인 성장 관리로 멸균 demineralised H 2 O와 incubated 샘플을 사용하십시오.</li><li> 미생물에 따라 적절한 제외어 성장 제어를 사용합니다 : <ul><li> 그람 음성 막대 샘플은 항생제의 혼합으로 incubated </li><li> Enterococcus SPP. 샘플은 4 ° C에 보관 </li><li> S.aureus 샘플은 4 ° C에 보관 </li></ul></li><li> 자화율 (S) 또는 다음과 같이 테스트 항생제에 대한 변형의 저항 (R) 결정 : <ul><li> 컷 - 오프 CT 값보다 높은 CT 값은 느끼기 쉬운 상태를 나타냅니다 </li><li> 컷 - 오프 CT 값보다 낮은 CT 값은 저항을 나타냅니다 </li></ul></li></ol> 8. 대표 결과 두 모델 생물은 그람 음성 E. 즉 대장균 및 그람 양성 S. 구균은 세균성 병원균과 그 항균 프로파일의 결정 탐지 및 식별을위한 통합 절차를 시각화하기 위해 선택됩니다. 프로토콜의 첫 번째 부분은 병원균 식별로 구성되어 있습니다. Specific 프로브들은 8 임상 관련 미생물의 검출을 위해 설계되었습니다. 세균성 패널에 포함된 대상의 존재에 증폭 곡선이 생성되고 CT 값 (그림 2) 계산됩니다. 긍정으로서 PCR 결과를 고려할 컷 - 오프 값은 35 CT 값으로 설정됩니다. 그림 2A에서 E.coli에 감염된 혈액 문화의 신분 프로필이 표시됩니다. 16 범용 프로브라는 두 개의 독립된 반응 혼합물에 포함되어 있으며 결과적으로이 증폭 곡선 (25.20 및 25.95의 CT) 생성됩니다. 세 번째 신호는 E.위한 프로브 특정에서 파생됩니다 대장균 (27.04 중 CT). S.의 식별 구균에 감염된 혈액 문화는 그림 2B에 표시됩니다. 16 범용 프로브는 33.35과 33.71의 증폭 신호를 가지고 있습니다. 남은 두 신호는 황색 포도상 SPP 특정 프로브에서 파생됩니다. 그리고 S. 구균 (32.48 및 30.59의 CT). 그림 3도 표시되었다 E.coli 변형을 나타내는 항생제 자화율 시험 증폭 플롯의 예입니다 그림 2A 인치 각 라인은 세균 샘플로 incubated되었다 싶고, 항생제를 나타냅니다. 낮은 CT 값을 가진 샘플은 성장이 테스트 항생제에 대한 항생제, 나타내는 저항의 면전에서 오류가 발생하였습니다있는 샘플입니다. 반대로, 높은 CT 값이 더 성장 때문에 테스트 항생제에 대한 항생제, 표시 자화율의 효과적인 작동 중에 발생하지 않은있는 샘플을 나타냅니다. 표 1 중에 항균 프로필의 결정을 보여줍니다 대장균 및 S. 구균의 분리합니다. 모든 CT 값은보고하고, 프로토콜 텍스트 (7.1)에서 설명한 수식을 사용하여, 두 컷 - 오프 CT 값은 calcu 있습니다저항 및 자화율 구별 lated. 보고된 CT 값이 계산 컷 - 오프 CT 값 (및 그 반대)보다 낮으면 변형은 항생제에 강한 것입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> rDNA PCR 실시간 기가 사용 병원균 식별 및 항생제 자화율 시험 절차의 그림 1. 플로우 차트. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 인식 분석 :. 증폭 플롯과 사이클 문턱 값 (CT 값) 특정 프로브는 인과 병원체의 식별에 사용되는 반면 긍정적인 혈액 문화, 유니버설 16 rDNA 탐침에 의해 감지된다.. 혈액 문화의 A.의 증폭 줄거리는 엑스타시를 포함하는 대장균, S.를 포함하는 혈액 문화의 바실러스 증폭 줄거리 구균, Pseu AE, Pseudomon박테리아와 같은, 유니, 16 범용 프로브, Ecoli, 에스 대장균 프로브, Pseu SP, 모나스 종. 프로브, S. pneu, 연쇄상 구균 pneumoniae 프로브, Strep SP, 연쇄상 구균 SPP. 프로브, 힘들어, Enterococcus 종. 프로브, S. 구균, 포도상 구균 프로브, 포도상 SP, 포도상 SPP. 프로브. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 중에 항생제 자화율 테스트 그림 3. 증폭 줄거리 대장균은 (예제 1) 분리. 각 곡선이 변형이 함께 incubated되었다 싶고, 항생제를 나타냅니다. 초기 신호는 변형이 테스트 항생제의 면전에서 성장하고 항생제에 대한 내성 따라서는 것을 의미 높은 세균 하중에 의해 발생합니다. 늦은 신호 변형율은 항생제의 면전에서 성장하지 않은 것을 의미, 즉, 그것은 쉽습니다. <table border="1"><tbody><td> 예제 1 : E. 대장균 </td><td></td><td></td><td> 예제 2 : S. 구균 </td><td></td><td></td><tr><td> 대서양 표준시 </td><td> CT </td><td> R / S </td><td> 대서양 표준시 </td><td> CT </td><td> R / S </td></tr><tr><td> Amoxicillin 8 MG / L </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td> Amoxicillin 0.25 MG / L </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td> Amoxicillin-clavulanate 4분의 8 MG / L </td><td> 17,36 </td><td> R </td><td> Oxacillin이 MG / L </td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacillin 16 MG / L </td><td> 16,67 </td><td> R </td><td> Vancomycin이 MG / L </td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacillin-tazobactam 16 /4 MG / L </td><td> 24,15 </td><td> S </td><td> Gentamicin 4 MG / L </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td> * 시프 로플 록 사신 1 MG / L </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td> 트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸 38분의 2 MG / L </td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td> Ceftazidime 1 MG / L </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ceftazidime 8 MG / L </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin 4 MG / L </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸 38분의 2 MG / L </td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 마이너스 성장 제어 (항생제의 혼합물) </td><td> 30,41 </td><td></td><td> 마이너스 성장 제어 (샘플은 4 ° C에 보관) </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td> 긍정적인 성장 제어 </td><td> 16,90 </td><td></td><td> 긍정적인 성장 제어 </td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 컷 - 오프 CT-값 1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td> 컷 - 오프 CT-값을 1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td> 컷 - 오프 CT-값 2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td> 컷 - 오프 CT-값 2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> * amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, * 시프 로플 록 사신, gentamic 위해트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸에서 ** piperacillin, piperacillin-tazobactam, ceftazidime에 대한 </td><td></td><td></td><td> vancomycin과 gentamicin을 위해 *** **** amoxicillin, oxacillin과 트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸의 경우 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 두 샘플 (E.coli와 S.aureus)의 항생제 자화율 시험의 결정. PCR-검정의 CT 값이 자동으로 프로토콜 텍스트에 표시된 수식을 사용하여 긍정적이고 부정적인 성장 컨트롤에서 두 컷 - 오프 CT의 alues​​을 계산 수있는대로이 Excel 파일에 복사되었습니다. 항생제는 컷 - 오프 CT 값보다 CT 값을 낮게 나타나면 CT 값이 절단보다 높은 아니었다면, 변형은 항생제에 강한이며, 변형은 쉽습니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기에서 설명한 프로토콜은 병원체의 급속한 식별을 가능하게함으로써 혈류 감염 환자의 예후를 개선하는 적절한 항생제의 조기 관리로 이어질 수있는 기능성 항균 프로파일을 제공합니다. 시험 요청한 조건에 따라 최소 즉 저렴한 비용, 높은 처리량은 설정 - 주변의 시간, 테스트 조건 조정할 수 있습니다. 모든 절차가 하나 근무일 이내에 수행할 수 있습니다. 또한 프로토콜의 두 부분이 크게 이정표 주위에 시간을 단축하는 동시에 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된대로 식별 패널은 우리 병원에서 가장 임상적으로 관련성이 높은 박테리아의 선택입니다. 주요 원칙은 16 유전자 영역을 목표로하고 있기 때문에, 다른 미생물에 대한 구체적인 프로브 설계 및 분석에 추가할 수 있습니다. 완전한 분석은 원래 혈액 배양의 신속한 분석을위한되었다뿐만 아니라 O의 처리에 사용될 수 있습니다군터 샘플 자료. 이것은 또한 항생제 자화율 시험에 사용된 항생제의 경우 : 자세한 또는 다른 항생제는 로컬 저항 패턴 및 가이드라인을 바탕으로 추가할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> 머크 화학 </td><td> 106,404 </td><td> 물에 0.9 % </td></tr><tr><td> Vacutainer SST 혈청 분리관 5 ML </td><td> BD 진단 시스템 </td><td> 367,986 </td><td></td></tr><tr><td> 뮐러 Hinton II 국물 </td><td> BD 진단 Dystems </td><td> 212,322 </td><td> 44g / 물의 패 </td></tr><tr><td> Rotixa 50 RS를 원심 분리기 </td><td> 안드레아스 Hettich 게엠베하 &amp; 주식 KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> 5415 D를 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 중단 </td><td></td></tr><tr><td> Primers </td> &lt;TD&gt; 시그마 - 올드 리치 </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> 프로브 </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biosystems </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental 마스터 믹스 2.0 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,396,838 </td><td></td></tr><tr><td> IQ SYBRGreen Supermix </td><td> 바이오 방사선 연구소 BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp 광학 96 자 반응 플레이트 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp 광학 접착제 필름 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,311,971 </td><td></td></tr><tr><td> IQ 96 자 PCR 플레이트 </td><td> 바이오 방사선 연구소 BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B 접착제 씰 </td><td> 바이오 방사선 노동atories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> 실시간 PCR 탐지 시스템 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> ABI 프리즘 7900HT </td><td></td></tr><tr><td> 리얼 타임 PCR 탐지 시스템 </td><td> 바이오 방사선 연구소 BV </td><td> MyiQ 단일 색상 </td><td></td></tr></tbody></table>

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

혈류 감염 때문에 패혈증의 가능성이 발현, 심한 패혈증 및 패혈증에 의한 쇼크 1의 높은 사망률 속도와 관련된. 따라서 적절한 항생제 치료의 급속한 행정부는 혈류 감염의 치료에 제일 중요합니다. 이 과정에서 중요한 요소는 박테리아 식별 및 항생제 자화율 시험의 결과에 크게 의존 타이밍입니다. 이러한 매개 변수 모두가 일상적으로 시간이 많이 소요되며 평균 24~48시간 2, 4를 취한다 문화 기반 테스트에 의해 얻을 수 있습니다. 연구의 목적은 DNA를 기반​​ 혈류 감염의 신속한 식별을위한 assays뿐만 아니라, 신속한 항균 자화율 시험을 개발하는 것이었습니다. 첫 번째 분석은 종 또는 속 특정 프로브 5 보완 rDNA 기반 실시간 PCR 분석 eubacterial 16입니다. 이러한 프로브, 모나스 종을 포함한 그람 음성 박테리아를 사용하여., 녹농균이그리고 대장균뿐만 아니라 포도상 SPP., 포도상 구균, Enterococcus SPP., 연쇄상 구균 SPP. 및 연쇄상 구균 pneumoniae를 포함한 그람 양성 세균은 구분할 수 있습니다. 이 multiprobe 분석을 사용하여 원인이되는 미생물의 첫번째 식별은 2 시인데 후에 주어졌다. 둘째, 우리는 S.의 항생제 자화율 테스트를위한 세미 분자 분석을 개발 구균, Enterococcus 종. 그리고 (통성) aerobe 그람 음성 막대 6. 이 분석은 PCR은 세균 7의 성장을 측정하는 데 사용된하는 연구를 기반으로했다. 혈액 배양에서 직접 수확한 박테리아는 항생제의 선택 6 H 위해 incubated 및 Sybr 그린 기반 실시간 PCR 분석을 따라하는 것은 성장 억제를 결정합니다. 이 두 방법의 조합은 같은 날 (그림 1)에 대한 적절한 항생제 치료의 선택을 안내할 수 있습니다. 결론적으로신분증과 항생 자화율 모두, 분자 분석은 병원균 검출을위한 빠른 대안을 제공하고 혈류 감염의 진단을 향상시킬 수 있습니다.

세균성 병원체 진단을위한 간단 하루 워크플로우 방식의 디자인은 혈류 감염의 급속한 인식을 가능하게합니다. 여덟 임상적으로 관련성이 높은 세균성 대상과 항생제 저항 프로파일을 포함하는 더 적절한 치료로 이어질 수있는 당일에 임상 초기 통찰력을 제공합니다.

혈류 감염은 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크의 발현 가능성으로 인해 높은 사망률과 연관되어 있습니다1. ...

이 절차의 전반적인 목표는 기존 방법보다 짧은 시간 내에 혈액 배양 분리균의 항생제 감수성을 확인하고 평가하는 것입니다. 이는 먼저 새로운 16 s ribosomal DNA MultiPro PCR 분석법을 사용하여 혈액 배양 분리균을 확인함으로써 달성됩니다.그 후 분리균을 항생제 패널과 함께 6시간 동안 배양합니다. 다음 단계는 정량적 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R 분석법을 사용하여 항생제 존재 하에서 분리균의 증식 또는 증식 억제 여부를 결정하는 것입니다. 최종적으로, 결과는 이러한 배양과 PCR의 조합을 통해 혈액 배양 분리균의 동정 및 항생제 감수성 테스트를 더 빠르게 수행할 수 있음을 보여줍니다.자동화된 phoenix 또는 IIC 시스템을 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 사전 배양 상태가 필요 없으며, 동정 및 항생제 감수성 테스트 결과를 당일에 확인할 수 있다는 점입니다. 해당 절차의 시연은 저희 실험실의 Vandy Hanson과 GID ing 박사 과정 학생들이 진행하겠습니다. 미생물 성장이 확인된 혈액 배양액 100 µL를 0.9% sodium chloride 900 µL가 들어 있는 반응 튜브에 희석하십시오. 그런 다음 샘플을 13,400 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 박테리아를 펠릿화하십시오.Reese, 펠렛을 100 µL의 멸균 탈이온수에 현탁하십시오. 샘플을 4 °C에서 보관하며 추후 사용할 때까지 유지하십시오. 모든 샘플이 준비되면, 표적 박테리아로부터 특정 16 s 리보솜 DNA를 증폭시키기 위한 실시간 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오.탈이온수를 사용하여 반응당 부피를 20 µL로 맞춥니다. 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 PCR 믹스 20 µL씩 분주합니다. 그다음 각 웰에 샘플 5 µL를 첨가하고 PCR 플레이트를 밀봉합니다.다음으로, BI Prism 7, 900 HT 실시간 PCR 시스템에서 PCR을 수행합니다. PCR이 완료되면 먼저 분석 설정 탭을 사용하여 CT 분석 값을 0.1로 조정합니다. 그런 다음 베이스라인 설정을 시작 사이클 6, 종료 사이클 15로 좁힙니다. 각 샘플의 CT 값을 기록합니다.PCR 결과를 양성으로 간주하기 위한 컷오프 값은 일반적으로 CT 값 35로 설정할 수 있습니다. 이 예시에서는 E. coli에 감염된 혈액 배양액의 식별 프로필이 두 가지 반응 믹스에서 나타납니다. Universal 16s ribosomal DNA 프라이머가 포함되었으며, CT 25.2와 25.95의 두 가지 증폭 곡선이 생성되었습니다.세 번째 증폭 곡선은 Coli 특이적 프로브로부터 유도된 것입니다. 다른 특이적 프로브에서는 검출 가능한 신호가 생성되지 않았습니다. 병원균이 확인되면 항생제 테스트를 수행할 수 있습니다.먼저 혈액 배양 양성 검체에서 5 mL의 배지를 혈청 분리관으로 옮깁니다. 샘플을 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 튜브에서 상층액을 제거합니다. 그다음 멸균 면봉을 사용하여 튜브의 겔 층에 있는 박테리아를 0.9% sodium chloride에 옮겨 0.5 McFarland 표준의 탁도를 가진 용액이 될 때까지 희석합니다.이는 밀리리터당 약 1.5 × 10⁸ CFU(colony forming units)에 해당합니다. 다음으로, 현탁액을 2배 농도의 Muller Hinton broth로 희석하여 약 5 × 10⁵ CFU/mL의 농도로 만듭니다.항생제가 웰당 50 µL씩 분주되어 있는 마이크로타이터 플레이트에 현탁액을 웰당 50 µL씩 분주합니다. 항생제 대신 증류수를 넣은 웰을 사용하여 각 시료에 대한 양성 성장 대조군을 반드시 포함하십시오. 분주가 끝나면 플레이트를 덮습니다.그런 다음, 박테리아가 성장할 수 있도록 플레이트를 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 음성 성장 대조군으로 사용할 박테리아 현탁액의 일부를 4 °C에 보관하십시오. 6시간 배양 후, 각 웰의 내용물과 음성 대조군 샘플을 각각 별도의 멸균 튜브로 옮깁니다.16,000 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 상층액 80 µL를 제거하고 펠렛을 멸균 탈이온수 80 µL에 재부유시킵니다. 16s ribosomal DNA 실시간 PCR에 사용하기 전, 시료를 물로 1:10 비율로 희석하십시오.IQ cyber green super mix와 16 s ribosomal DNA 프라이머를 사용하여 PCR 믹스를 준비하고, 96웰 PCR 플레이트의 웰당 20 µL씩 분주합니다. 그런 다음 각 샘플 5 µL를 웰에 첨가하고 플레이트를 밀봉합니다.다음으로, 결과를 분석하기 위해 PCR을 수행합니다. 먼저, 컷오프 CT 값을 계산합니다. 일반적으로 컷오프 CT는 양성 성장 대조군의 CT 값에 음성 성장 대조군 CT 값의 0.5배를 더한 후, 성장 대조군의 CT 값을 뺀 값과 같습니다.하지만 그람 음성 간균의 piperacillin/tazobactam 및 CEF dazadi, 그리고 staphylococcus aureus의 amoxicillin, oxacillin, trimethoprim/sulfamethoxazole 또는 enterococcus SPP의 amoxicillin의 경우에는 증폭 인자를 0.5에서 0.25로 낮추어야 합니다. 각 시료 내 균주의 감수성 또는 내성은 시료의 CT 값을 컷오프 ct와 비교하여 결정할 수 있습니다.컷오프 값보다 높은 CT 값은 감수성을 나타내며, 컷오프 값보다 낮은 CT 값은 내성을 나타냅니다. 다음은 항생제 감수성 증폭 곡선의 예시입니다. 앞서 확인된 E. coli 균주를 대상으로 각각의 곡선으로 표시된 여러 항생제에 대한 감수성 테스트를 수행하였습니다.CT 값이 낮은 샘플은 항생제가 존재하는 환경에서도 성장이 일어난 샘플로, 테스트한 항생제에 대해 내성이 있음을 나타냅니다. 반대로, CT 값이 높다는 것은 성장이 일어나지 않은 샘플임을 의미하며, 이는 테스트한 항생제에 민감함(susceptibility)을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 9시간 이내에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현장 하이브리드화 분석에서 형광 펩타이드 핵산 (PNA 물고기)를 사용하여 긍정적인 혈액 배양에서 Enterococcus faecalis와 다른 Enterococcus 종의 직접 확인을위한 신속한 프로토콜.

의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus</em직접 혈액 배양에서> 종

용해성 파지 바이오 센서 및 항체 비즈 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별 할 수 있습니다. 파지는 석영 크리스탈 마이크로 센서의 표면에 랭 뮤어 - 블로 젯 방식으로 고정 넓은 범위 포도상 구균 프로브로 근무 하였다. 항체 비즈 MRSA를 인식하고 있습니다.

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.

빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

여기에서는 물에서 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별과 항생제 내성 유전자(ARG)의 분자 특성 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 배양 기반 및 비배양 기반(메타게놈 분석) 기술을 사용하면 인도 뭄바이의 담수에 존재하는 다양한 ARG의 총 박테리아 다양성과 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

여기에서는 지능형 고처리량 항균 감도 검사/파지 스크리닝 시스템의 원리, 구조 및 지침을 소개합니다. 그 응용은 중국 산둥성의 가금류에서 분리한 살모넬라균 을 예로 들어 설명합니다. Lar 지수를 계산하고 항생제 내성 평가에 대한 중요성을 종합적으로 논의합니다.

지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수

EUCAST는 자동 혈액 배양을 위한 직접 항균제 감수성 검사(AST) 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 질량 분석 기반 미생물 식별에 대한 의존성은 자동화된 미생물 식별 시스템에서 직접 접종 준비 프로토콜을 사용하여 제거할 수 있습니다. 이 접근 방식은 검체 채취 후 24시간 이내에 AST 보고서를 제공할 수 있습니다.

질량 분석법 없이 EUCAST RAST 방법을 용이하게 하기 위해 자동 미생물 식별 시스템을 사용한 직접 미생물 식별

다양한 박테리아 병원체는 호흡기 감염을 일으킬 수 있으며 정확하게 감지하고 신속하게 치료하지 않으면 심각한 건강 문제를 초래할 수 있습니다. 루프 매개 등온 증폭을 통해 이러한 병원체를 빠르고 정확하게 검출하면 임상 환경에서 호흡기 감염을 효과적으로 관리하고 제어할 수 있습니다.

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

배우세요 혈액 배양에서 세균 병원체를 신속하게 식별하고 항생제 감수성을 평가하는 PCR 기반 워크플로우를. 16S 리보솜 DNA 다중 PCR 분석을 활용하여 당일 내에 결과를 얻을 수 있는 이 방법은 임상 진단에 효율적입니다.

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

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