혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

본 절차의 전반적인 목표는 기존 방법보다 짧은 시간 내에 혈액 배양 분리균을 식별하고 항생제 감수성을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 새로운 16 s ribosomal DNA MultiPro PCR 분석법을 사용하여 혈액 배양 분리균을 식별함으로써 달성됩니다.

그 다음으로 분리균을 항생제 패널과 함께 6시간 동안 배양합니다. 다음 단계는 정량적 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R 분석을 사용하여 항생제 존재 하에서 분리균의 성장 또는 성장 억제 여부를 결정하는 것입니다. 최종적으로, 이러한 배양과 PCR의 조합을 통해 혈액 배양 분리균의 동정 및 항생제 감수성 테스트 결과를 더 빠르게 얻을 수 있음을 보여줍니다.

자동화된 phoenix 또는 IIC 시스템과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 사전 배양 상태가 필요하지 않으며, 동정 및 항생제 감수성 테스트 결과를 당일에 확인할 수 있다는 점입니다. 절차 시연은 본 연구실의 Vandy Hanson과 GID ing 박사 과정 학생들이 진행합니다. 미생물 성장이 확인된 혈액 배양액 100 µL를 0.9% sodium chloride 900 µL가 들어 있는 반응 튜브에 희석합니다. 그 다음, 샘플을 13,400 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 박테리아 침전물을 형성합니다.

Reese, 펠렛을 100 µL의 멸균 탈이온수에 현탁하십시오. 추가 사용 시까지 샘플을 4 °C에서 보관하십시오. 모든 샘플이 준비되면, 표적 박테리아로부터 특정 16 s 리보솜 DNA를 증폭시키기 위한 실시간 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오.

탈이온수를 사용하여 반응당 부피를 20 µL로 맞춥니다. 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 PCR 믹스 20 µL씩 분주합니다. 그런 다음 각 웰에 샘플 5 µL를 첨가하고 PCR 플레이트를 밀봉합니다.

다음으로, ABI Prism 7, 900 HT 리얼타임 PCR 시스템에서 PCR을 수행합니다. PCR이 완료되면 먼저 분석 설정 탭을 사용하여 CT 분석 값을 0.1로 조정하십시오. 그다음 베이스라인 설정을 시작 사이클 6, 종료 사이클 15로 좁게 설정합니다. 각 샘플의 CT 값을 기록하십시오.

PCR 결과가 양성이라고 판단하는 컷오프 값은 일반적으로 CT 값 35로 설정할 수 있습니다. 이 예시에서는 E. coli에 감염된 혈액 배양액의 확인 프로필이 두 가지 반응 믹스에서 나타나 있습니다. 범용 16 s 리보솜 DNA 프라이머를 포함하였으며, 25.2 및 25.95의 CT 값을 가진 두 개의 증폭 곡선이 생성되었습니다.

세 번째 증폭 곡선은 Coli 특이적 프로브로부터 도출되었습니다. 다른 특이적 프로브들은 검출 가능한 신호를 생성하지 않았습니다. 병원체가 확인되면 항생제 테스트를 수행할 수 있습니다.

양성 혈액 배양액 5 mL를 혈청 분리관으로 옮기는 것으로 시작합니다. 시료를 2000 ×g에서 10분 동안 원심 분리한 후, 튜브에서 상층액을 제거합니다. 그다음 멸균 면봉을 사용하여 튜브의 겔 층에 있는 세균을 0.9% sodium chloride에 옮겨, 탁도가 0.5 McFarland 표준에 도달할 때까지 희석합니다.

이는 mL당 약 1.5 × 10⁸ CFU(colony forming units)에 해당합니다. 다음으로, 약 5 × 10⁵ CFU/mL의 농도가 되도록 2배 농도의 Muller Hinton broth로 현탁액을 희석합니다.

항생제가 웰당 50 µL씩 이미 분주된 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 현탁액 50 µL씩을 분주합니다. 항생제 대신 물을 사용한 웰을 통해 각 샘플에 대한 양성 성장 대조군을 반드시 포함하십시오. 작업이 끝나면 플레이트를 덮습니다.

그 다음, 박테리아가 성장할 수 있도록 플레이트를 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 이때 박테리아 현탁액의 일부를 4 °C에 보관하여 성장 음성 대조군으로 사용하십시오. 6시간의 배양이 끝나면, 각 웰의 내용물과 음성 대조군 샘플을 각각 별도의 멸균 튜브로 옮깁니다.

16,000 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 상층액 80 µL를 제거하고 펠렛을 80 µL의 멸균 탈이온수에 다시 현탁합니다. 16s rRNA DNA 실시간 PCR에 사용하기 전, 샘플을 증류수로 1:10 비율로 희석합니다.

IQ cyber green super mix와 16 s ribosomal DNA 프라이머를 사용하여 PCR 믹스를 준비하고, 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 20 µL씩 분주합니다. 그런 다음 각 샘플 5 µL를 웰에 추가하고 플레이트를 밀봉합니다.

다음으로, 결과를 분석하기 위해 PCR을 수행합니다. 먼저, 컷오프 CT 값을 계산합니다. 일반적으로 컷오프 CT는 양성 성장 대조군의 CT 값에 음성 성장 대조군 CT 값의 0.5배를 더한 후, 성장 대조군의 CT 값을 뺀 값과 같습니다.

하지만 그람 음성 간균의 경우 piperacillin, tazobactam 병용 piperacillin 및 CEF dazadi에 대해, 그리고 staphylococcus aureus의 경우 amoxicillin, oxacillin, trimethoprim과 sulfamethoxazole 병용 투여 또는 enterococcus SPP의 amoxicillin에 대해서는 증폭 인자를 0.5에서 0.25로 낮추어야 합니다. 각 시료 내 균주의 감수성 또는 내성은 시료의 CT 값을 컷오프 ct와 비교하여 결정할 수 있습니다.

컷오프 값보다 높은 CT 값은 감수성을 나타내며, 컷오프 값보다 낮은 CT 값은 내성을 나타냅니다. 다음은 항생제 감수성 증폭 곡선의 예시입니다. 앞서 확인된 E. coli 균주를 대상으로 각각의 곡선으로 표시된 여러 항생제에 대한 감수성을 테스트하였습니다.

CT 값이 낮은 샘플은 항생제가 있는 환경에서 성장이 일어난 샘플로, 테스트한 항생제에 대해 내성이 있음을 나타냅니다. 반대로, CT 값이 높다는 것은 성장이 일어나지 않은 샘플임을 의미하며, 이는 테스트한 항생제에 민감함을 나타냅니다. 숙달되면, 이 기술은 적절히 수행되었을 때 9시간 이내에 완료할 수 있습니다.