Name: StemCell 기술에서 RosetteSep 키트와 함께 인간의 피를에서 NK 세포의 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 학습하세요 인간 혈액에서 NK 세포를 음성 선택법으로 분리하는 방법을. StemCell Technologies RosetteSep 키트를 사용하여 높은 순도와 생존율을 확보하고 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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자세한 프로토콜은 각 로제트 Sep 절연 칵테일과 함께 포함되어 있으며 StemCell 기술 웹사이트 1 온라인입니다.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

이 기술을 사용하여 격리 세포는 더 이상 다른 세포 분리 키트를 사용하여 서로 다른 인구에 분리 수 있습니다.

PBS는 2% FCS와 Histopaque 솔루션으로 보충이 절차의 시작 전에 실내 온도로 이동해야합니다.

stemcell 기술에서 rosettesep 키트와 함께 인간의 피를에서 nk 세포의 농축

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

자연 킬러 (NK) 세포가 본래 면역 체계에 소속하고 암 및 감염 싸우고 주요 역할을 큰 세분화된 세포 독성 lymphocytes 있지만, 또한 임신과 이식 거부 반응의 초기 단계에 연루됩니다. 이러한 세포들은 격리 수있는 주변 혈액에 존재한다. 전지는 긍정적이거나 부정적인 중 선택을 사용하여 격리 수 있습니다. 긍정적인 선택을 위해 우리는 우리 모두가 세포하지만 관심의 세포에 존재하는 표면 마커를 타겟으로하는 항체의 칵테일을 사용하는 부정적인 선택을위한 반면, 관심의 세포에 존재하는 표면 마커로 이동 항체를 사용합니다. 이 후자의 기술은이를 원치 않는 세포 활성화 또는 differenciation의 위험을 감소, 항체 무료로 관심의 세포를 떠나는 장점을 제공합니다. 이 비디오 프로토콜에서 우리는 StemCell 기술에서 RosetteSep 키트를 사용하여 부정적인 선택에 의해 인간의 혈액에서 NK 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 절차는 인간의 말초 혈액을 (인간 과목을 보호하기 위해 기관 검토위원회의 승인을 프로토콜 이하)을 구하고 북한 세포에 결석 마커에 바인딩됩니다 항체의 칵테일로 혼합지만, 주변에있는 다른 모든 mononuclear 세포에있는 포함 혈액 (예, T의 lymphocytes, monocytes ...). 칵테일에있는 항체가에 적혈구를 glycophorin 이동 항체에 복합 있습니다. 모든 원치 않는 세포와 적혈구 따라서 단지에 갇혀있는 것입니다. 혈액과 항체 칵테일의 조합은 다음 희석 Histopaque 그라디언트에 overlayed하고, centrifuged입니다. NK 세포는 (&gt; 80 % 순수) Histopaque과 희석 플라즈마 사이의 인터페이스에서 수집된하실 수 있습니다. 비슷한 칵테일은 인간의 T lymphocytes와 같은 다른 세포 집단의 농축 사용할 수 있습니다.

자연 킬러 세포 lymphocytes의 작은 인구입니다. 여기 StemCell Technologies에서 키트를 사용하여 부정적인 선택에 의해 인간의 혈액에서 이러한 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 얻은 세포 따라서 절차의 번호를 사용 준비가 가능한 및 항체에 의해 훼손되지 않은, 그리고.

StemCell 기술에서 RosetteSep 키트와 함께 인간의 피를에서 NK 세포의 농축

자연살해(NK) 세포는 선천 면역 체계에 속하는 크고 과립이 풍부한 세포독성 림프구로, 암에 대항하여 싸우는 데 중요한 역할을 합니다...

안녕하세요, Christine Beaton입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과의 George Chen 교수 연구실에서 보조 연구원으로 근무하고 있습니다. 오늘은 StemCell Technologies의 cocktail kit를 사용하여 인간 혈액에서 자연살해 세포(natural killer cells)를 음성 선택(negative selection)하는 방법을 보여드리겠습니다.Stem Cell Technologies사의 이 키트를 사용하는 이유는 매우 높은 순도의 세포를 얻을 수 있고, 음성 선택(negative selection)을 통해 항체와 결합하지 않은 세포를 확보할 수 있기 때문입니다. 따라서 해당 세포들에서 예상치 못한 반응이 일어나는 것을 방지할 수 있습니다. Tsep 키트의 작동 방식은 혈액 내에서 분석 대상이 아닌 모든 세포에 결합하는 항체를 사용하는 것입니다.제 경우라면 T 세포, B 세포, 단핵구, 그리고 적혈구의 glycophorin A에 결합하는 항체가 있습니다. 연구진은 백혈구에 대항하는 항체 하나를 적혈구에 대항하는 항체 하나에 연결했습니다. 그렇게 되면 제거해야 할 백혈구 하나가 여러 개의 적혈구와 복합체를 형성하게 됩니다. 적혈구는 백혈구보다 밀도가 높기 때문에, 혈액과 항체가 포함된 혼합 칵테일을 밀도 구배액에 넣고 원심 분리를 하면 적혈구가 튜브 바닥으로 가라앉으면서 원치 않는 백혈구들을 함께 끌고 내려가게 됩니다. 따라서 구배액 상단에서 수집하게 되는 것은 항체에 전혀 결합되지 않은 순수하거나 거의 순수한 자연 살해 세포(natural killer cells)입니다.이제 인간 혈액 튜브에서 NK 세포를 분리해 보겠습니다. 여기 소듐 헤파린 튜브에 채취된 신선한 혈액이 있습니다. 밀도 구배 원심분리를 위해 Roset ep human NK Cell enrichment cocktail을 사용하겠습니다.실험 후반부에 1.077 밀도의 10 77 histo pack을 사용할 예정이며, 2% fetal calf serum이 첨가된 PBS 병도 준비해 두었습니다. 이 성분들은 냉장 보관하므로 사용 전 실온 상태가 되도록 합니다. 이제 혈액이 담긴 튜브 전체를 50 mil fcan 튜브에 옮기겠습니다.이 용기는 진공 용기이므로 내부가 진공 상태입니다. 내용물이 튀지 않게 열기 위해 캡의 작은 홈 위치를 확인하고, 튜브 안으로 공기가 들어갈 수 있도록 조심스럽게 들어 올립니다. 튜브의 진공 상태가 해제되면 캡을 더 쉽게 제거할 수 있으며, 그 후 10 mL 피펫을 사용하여 튜브 안의 혈액 전체를 피펫팅합니다. 혈액의 양은 약 10 mL일 것으로 예상됩니다.여기 9.5 µL의 혈액이 있으며, 이 9.5 µL 전체를 50 mL falcon tube에 넣겠습니다. 그 후 혈액이 담긴 피펫 팁은 즉시 바이오하저드 폐기물 봉투에 넣고, 튜브에는 항상 표백제를 약간 넣고 뚜껑을 닫은 후 바이오하저드 폐기물 봉투에 넣습니다. 이것이 항체 칵테일을 첨가하기 전 혈액의 모습입니다.이제 혈액에 항체 칵테일을 추가하겠습니다. 혈액 양이 약 9.5 mil이므로, 혈액 1 mil당 50 µL의 칵테일을 추가해야 합니다. 따라서 혈액에 450 µL의 칵테일을 추가하겠습니다. 그 다음 부드럽게 혼합하면 거의 즉시 응집 현상이 일어나는 것을 볼 수 있습니다. 보시는 바와 같이 현재 응집이 일어난 것을 확인할 수 있습니다.현재 원치 않는 백혈구와 적혈구 사이의 교차 누출이 일어나고 있습니다. 타이머를 20분으로 설정하고 튜브를 후드 안에 20분 동안 그대로 둡니다. 이제 혈액이 rosette sub cocktail과 함께 20분 동안 배양되었습니다.따라서 이를 PBS와 소태아혈청(fetal calf serum) 혼합액으로 1:1 희석하겠습니다. 그리고 이 혼합물을 histo pack 10 77 15 mL 튜브 두 개에 층 분리하여 얹어준 뒤, 원심분리기로 20분 동안 회전시킬 것입니다.현재 항체 칵테일이 포함된 혈액 약 10 µL가 있습니다. 여기에 2% fetal calf serum이 포함된 PBS 10 µL를 추가하겠습니다. 이렇게 하면 1:1 희석이 됩니다.보시는 바와 같이 혈액에 PBS를 첨가했을 때 즉시 섞이지 않으므로, 부드럽게 혼합해야 합니다. 따라서 가볍게 섞어줍니다. 이제 PBS와 혈액이 1:1로 혼합되었으며, 이를 15 mL의 histo pack에 첨가하겠습니다.그리고 혈액이 histo pack과 섞이는 것을 방지하기 위해 조심스럽게 층을 쌓겠습니다. 이를 위해 모든 혈액을 한 번에 옮기게 될 25 µL 파이펫 대신, 10 µL 파이펫을 사용하여 여러 단계에 걸쳐 진행하겠습니다. 쉽게 층을 쌓기 위해 histo pack 튜브를 거의 수평으로 잡습니다.튜브에 혈액을 소량 떨어뜨린 후 히스토 팩(histo pack) 쪽으로 내리겠습니다. 그런 다음 매우 천천히 혈액을 히스토 팩 위에 층을 이루도록 얹어줍니다. 혈액 층이 적절히 형성되면, 파이펫팅 속도를 조금 더 높여 진행할 수 있으며 튜브를 천천히 다시 수직 위치로 세울 수 있습니다.이제 항체 칵테일과 PBS가 혼합된 혈액 20 µL 전체를 두 개의 15 µL histo pack 위에 층을 이루도록 올렸습니다. 튜브의 접합부를 보시면 적혈구의 작은 응집체들이 밀도 구배 속으로 천천히 가라앉기 시작하는 것을 볼 수 있으며, 이 과정을 더 빠르게 진행하기 위해 원심분리를 실시하겠습니다. 이렇게 하면 20분 이내에 모든 적혈구가 튜브 바닥에 모이게 됩니다.그리고 gt를 수행할 때 매우 중요한 점이 하나 있는데, 브레이크를 꺼야 한다는 것입니다. 너무 빨리 제동하면 성분이 손상될 수 있기 때문입니다. 따라서 항상 브레이크를 끄고, 20분 동안 원심분리를 실시하여 처리하도록 합니다. 이제 성분이 20분 동안 회전하였습니다.여기 세포의 서로 다른 층들이 있습니다. 튜브의 바닥 부분부터 살펴보겠습니다. 여기에는 적혈구와 우리가 관심 없는 세포들이 모두 모여 있습니다.그 위에는 투명한 밀도 구배 층이 있으며, 그 위로는 노란색의 혈장 층이 있습니다. 오늘 우리가 관심을 갖는 세포, 즉 NK 세포는 이 구배 층과 혈장 층 사이에 형성된 얇고 하얀 세포층에 위치합니다.NK 세포는 혈액 세포 중 소수만을 차지하기 때문에 당연히 이 층은 매우 얇습니다. 이제 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 NK 세포 층을 제거하겠습니다. 그리고 이 층을 새로운 빈 50 mL Falcon 튜브에 옮기겠습니다.그다음 층으로 가서 파이펫으로 옮깁니다. 물론 세포 수가 매우 적습니다. 세포 수가 많을 때는 층을 매우 깔끔하게 얻을 수 있지만, 세포 수가 이렇게 적을 때는 그렇지 않습니다.제조사의 안내 사항에 권장된 바와 같이, 세포 손실을 방지하기 위해 밀도 구배액의 일부를 세포와 함께 채취하는 것이 좋습니다. 따라서 세포가 보이는 한 계속해서 파이펫으로 흡입합니다. 모든 세포를 다 꺼내고 나면, 투명한 시약과 노란색 혈장 사이의 뚜렷한 경계선을 확인할 수 있습니다.이제 모든 세포를 다 분리해낸 것으로 보입니다. 그래디언트를 보시면 histopaque와 혈장의 경계면에 하얗고 솜털 같은 물질이 보이지 않는 것을 알 수 있습니다. 이렇게 그래디언트에서 확인할 수 있는 모든 NK 세포를 제거하여 새로운 50 mL Falcon 튜브에 옮겼으며, 즉시 2% fetal calf serum이 첨가된 PBS를 튜브에 넣었습니다.따라서 50 mL까지 채웠으며, 세포를 원심분리하여 펠릿 형태로 가라앉히겠습니다. 이것이 1차 세척 과정입니다. 세포를 총 2회 세척하기 위해 이 과정을 한 번 더 반복하겠습니다.그 후, 세포는 배양하거나 유세포 분석 염색에 사용하는 등 원하는 모든 실험 절차에 사용할 준비가 됩니다. NK 세포의 순도는 최소 80% 이상이 되어야 하며, 그보다 더 높을 수도 있습니다. 본 절차를 통해 최대 98%의 순도를 얻은 사례가 있습니다.지금까지 Stem Cell Technologies사의 TS 키트를 사용하여 인간 혈액에서 자연 살해 세포를 분리하는 매우 빠르고 신뢰할 수 있는 기술을 보여드렸습니다. 물론 인간, 쥐 또는 생쥐에서 다른 세포 유형을 분리하고자 한다면, 다양한 T 세포 분리 키트를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 T 세포, B 세포, 그리고 T 세포의 하위 유형을 위한 키트들도 준비되어 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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