장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

다음 실험의 전반적인 목표는 epi airway 모델을 사용하여 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Nontypeable Hemophilus influenza 또는 NTHI)와 인간 일차 호흡기 상피 조직의 장기 공동 배양을 수행하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로서 NTHI를 정단 표면에 접종하여 박테리아가 조직에 부착하고 침투하도록 함으로써 달성됩니다. 인서트(insert)는 정상적인 점액 흐름을 모방하고 뮤신 폐기물 및 세포 파편을 제거하기 위해 24시간마다 예열된 DPBS로 세척합니다.

다음으로, 원하는 시점에 조직을 수확하여 총 세포 결합 또는 세포 내로 유입된 NTHI의 생존 여부를 결정합니다. 마지막으로, 이 방법을 통해 생균수 기반의 조직 내 시간 경과에 따른 NTHI 생존의 균주 특이적 특성을 평가할 수 있습니다. 이러한 방식은 비형형성 헤모필루스 인플루엔자에 의한 장기 감염에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

또한 Moraxella Alis와 같은 다른 인간 병원체 연구에도 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연할 Dr.Doin은 본 실험실의 박사후 연구원이었습니다. 운반 플레이트를 포장에서 꺼내어 실험 준비를 합니다. 운반 플레이트에 70% ethanol을 뿌린 후, 플레이트를 생물안전작업대(biosafety cabinet) 안에 넣습니다.

6-웰 플레이트의 각 웰에 4 °C의 epi airways 유지 배지를 1 mL씩 분주합니다. 그다음 테이프를 제거한 후 플레이트를 열고 epi airway 인서트를 덮고 있는 거즈를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 비트는 동작으로 aros에서 인서트를 분리합니다.

필요한 경우, 인서트를 6-웰 플레이트의 웰 중 하나에 넣으십시오. 멸균된 면봉을 사용하여 멤브레인을 건드리지 않도록 주의하며 인서트에서 에어로스(aros)를 조심스럽게 제거하십시오. 인서트 아래에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오.

그 다음 6-웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 다음과 같이 매일 인서트(insert)를 세척합니다. 칼슘과 마그네슘이 포함된 DPBS를 미리 데운 후, 팁에 DPBS를 채웁니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 인서트를 조심스럽게 들어 올리고, 미리 데운 DPBS 200 µL를 조직 위에 피펫팅합니다.

그런 다음 조직에 닿지 않도록 인서트를 흔들어 DPBS를 고르게 분산시킵니다. 다음으로, 인서트를 기울인 후 인서트 바닥에서 멤브레인을 고정하는 플라스틱 링에 P 1000 피펫 팁을 댑니다. 그런 다음 버퍼 용액을 조심스럽게 흡입하여 나중에 연구할 수 있도록 크라이오 튜브에 담습니다.

마지막으로, 기저 유지 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 신선한 배지로 교체합니다. 칼슘과 마그네슘이 포함된 DPBS를 추가로 예열합니다. 예열된 DPBS 3 mL를 15 mL 튜브에 넣은 다음, 초콜릿 한천 배지에서 하룻밤 동안 배양한 비정형 인플루엔자균(nontypeable influenza) 또는 NTHI의 단일 콜로니를 튜브에 넣고 재현탁합니다.

이제 튜브를 최소 10초 동안 강하게 볼텍싱한 다음, 광학 밀도를 측정합니다. 박테리아 농도가 OD 600 nanometers 약 0.7에 도달할 때까지 NTHI 단일 콜로니를 계속해서 추가합니다. 다음으로, 이전과 동일하게 미리 데워둔 DPBS로 각 EPI 기도 인서트를 세척한 후, 각 인서트의 apical 표면에 박테리아 현탁액 28 microliters를 첨가합니다.

기저 유지 배지에 접종하지 않도록 주의하십시오. 그 후 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 NTHI를 정량화하고, 초콜릿 아가 플레이트를 먼저 예열한 다음 표면을 건조시킵니다. 이어서 0.1% 젤라틴이 포함된 멸균 PBS 또는 PBSG를 사용하여 NTHI 접종액을 단계 희석하십시오.

접종액 10 µL씩을 플레이트에 분주한 후, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 각 드롭당 15~30개의 뚜렷한 콜로니가 형성된 희석 배수를 계산하여 mL당 CFU를 결정하고, 이를 통해 실제 생존 가능한 NTHI 접종량을 역산하여 세포 결합 박테리아의 총량을 수확합니다. 에피 기도(epi airways)의 정단 표면을 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS 200 µL로 세 번 헹굽니다.

그런 다음 인서트를 기울여 기저막에 남아 있는 유지 배지를 헹구어 냅니다. 세척한 인서트를 새로운 6-웰 플레이트에 넣고, 각 조직의 정단 표면에 멸균된 1% saponin 용액 250 µL를 첨가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 10분 동안 배양합니다.

각 희석 튜브에 PBSG 900 µL를 채워 연속 희석을 위한 튜브를 준비합니다. 다음으로, P 1000 피펫 팁을 사용하여 막에서 조직을 앞뒤로 문지른 후, 원형으로 움직여 인서트 가장자리에서 조직을 제거합니다. 그런 다음 멸균된 대구경 P 1000 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 빈 1.5 mL einor 튜브에 옮깁니다.

이제 인서트의 apical 표면에 250 µL의 DPBS를 추가한 다음, 도립 위상차 현미경을 사용하여 수확해야 할 조직이 남아 있는지 확인합니다. 현탁액을 einor 튜브에 넣고 500 µL의 DPBS를 추가하여 격렬하게 혼합합니다. 세포 현탁액을 1분 동안 볼텍싱합니다.

그런 다음 26 gauge 바늘이 장착된 멸균된 1 mL 주사기를 사용하여, 바늘을 통해 현탁액을 주사기 속으로 흡입합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 현탁액을 바늘을 통해 천천히 세 번 통과시킵니다.

그 후 현탁액을 다시 1분 동안 강하게 볼텍싱합니다. 다음으로, 구경이 큰 피펫 팁을 사용하여 현탁액 100 µL를 첫 번째 희석 튜브로 옮깁니다. 튜브를 5초 동안 강하게 볼텍싱한 후, 1:10 연속 희석을 수행하여 희석액을 초콜릿 한천 배지에 분주합니다.

그 다음, 내부로 유입된 박테리아를 수확하기 위해 생존 박테리아 수를 측정할 수 있도록 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 각 인서트를 200 µL의 DPBS로 세 번만 세척합니다. 하단 유지 배지를 100 µg/mL 젠타마이신 황산염(gentamycin sulfate)이 포함된 배지로 교체한 후, 젠타마이신이 포함된 유지 배지 300 µL를 상단 표면에 첨가합니다.

인서트를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 배양하는 동안, DPBS를 미리 가온합니다. 그 다음, apical 표면에서 Gentamycin이 포함된 유지 배지를 제거합니다. 이어서, 가온된 DPBS를 사용하여 인서트의 apical 표면과 basal 막을 충분히 세척합니다.

마지막으로, 이 그림에서 내재화된 박테리아의 연속 희석 및 도말을 수행하기 전에 방금 시연한 세척 및 수확 절차를 반복하십시오. 왼쪽의 감염되지 않은 상피 기도 조직과 오른쪽의 5일간 NTHI에 감염된 상피 기도 조직의 주사 전자 현미경 이미지를 비교해 보겠습니다. NTHI와의 장기 공동 배양이 정단 조직에 상당한 손상을 일으키지 않는 것을 확인할 수 있으며, 이는 상피 기도 모델의 유용성을 강조합니다.

상피 기도 공동 배양 중 시간에 따른 NTHI의 내부화 수를 나타낸 그래프가 여기에 제시되어 있습니다. R 2 8 6 6 균주를 인서트당 약 1 × 10⁷ CFU로 접종하였습니다. 이후 각 표시된 시점에서 내부화된 박테리아를 수확하여 그 수를 측정하였습니다.

이 영상을 시청하고 나면, A PRE 모델을 사용하여 NTHI를 일차 호르몬 호흡 조직과 장기 공동 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.