Name: 장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 EpiAirway 모델을 이용한 NTHI와 인간 호흡기 상피 조직의 장기 공동 배양 방법입니다. 이 기법은 세균 생존 특성을 평가하고 호흡기 감염 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 도움이 토론 패트릭 헤이든 (MatTek)을 감사하고, 로버트 스미스와 그 EM 기술에 대한 조지아 보건 과학 대학의 리비 페리 것입니다. 이 연구는 아빠 NIDCD 부여 DC010187에 의해 투자되었다

1. EpiAirway 조직에 대한 biosafety 캐비닛 준비 <ol><li> 다시 장갑 묶인 머리, 전용 실험 복을 입고, 층류를 시작합니다. 오분 후, 한쪽으로 캐비닛 (pipettors, 팁, 원심 분리기 튜브 등)에 도구를 이동, 스프레이 70 % 에탄올과 깨끗한 종이 타월로 닦아 아래와 biosafety 캐비닛 내부 및 창틀. 70 % 에탄올로 다시 청소 인테리어 스프레이 건조에 둡니다. 깨끗한쪽으로 도구를 이동하고 에탄올 절차를 반복하십시오. </li><li> 캐비닛의 에어로졸 장벽 피펫 팁 및 전용 pi​​pettors을 사용합니다. 개별 포장된 멸균 serological pipettes를 사용하려면, 폐기 포장 밖을 층류를 통해 연결 끝에 합격 깨면, 그리고 캐비닛에 피펫을 슬라이드. </li><li> EpiAirway 삽입은 무균 포셉으로 취급해야합니다. 플레이스 6 인치 미세 팁 곡선 자체 밀봉 살균 파우치와 압력솥에 집게를 해부. 사용하기 위해 최소한 6 하루 준비가있을 정도로 준비합니다. </li></ol> 2. EpiAirway 조직을 풀고 <ol><li> 70 % 에탄올로 biosafety 캐비닛에 작업 표면을 스프레이 깨끗한 종이 타월로 아래로 닦으십시오. 다시 스프레이와 표면을 사용하기 전에 건조 수 있습니다. EpiAirway 상자를 열고 스티로폼과 포장 재료를 폐기하십시오. </li><li> EpiAirway 항생제없는 유지 보수 언론, AIR - 100 - MM ABF (MM)는 MatTek 독점하고 삽입과 키트에 전송됩니다. biosafety 캐비닛, 미디어 유형과 날짜와 라벨이 여섯 무균 50 ML의 원심 분리기 튜브를하고 뚜껑을 느슨하게에. 70 % 에탄올로 미디어 병을 스프레이와 캐비닛 내부 엽니다. 각각의 튜브에 대한 새 살균 serological 피펫을 사용하여 각 튜브로 나누어지는 MM 25 ML, 4 ° C.에있는 뚜껑과 상점을 강화 매일 MM의 신선한 나누어지는을 사용합니다. </li><li> 1 X Dulbecco의 새로운 병 인산염 버퍼 칼슘, 마그네슘과 호수 (D - PBS)를 사용하여 위의 2.2를 반복합니다. 칼슘, 마그네슘없이 D - PBS를 사용하여 다시 반복합니다. 4 모든 aliquots를 저장 ° C. </li><li> EpiAirway 삽입 AIR - 100 ° C 고체 미디어 포함된 아가로 오스를 4에서 24 잘 판에 도착하고, 사용을위한 6 자 접시에 배치해야합니다. 에탄올 방지 마커를 사용하여 날짜와 설명 각 접시 라벨. 각 우물에 4 ° C EpiAirway의 MM 장소 1 밀리리터. 포장, 70 % 에탄올로 스프레이하고, biosafety 캐비닛의 위치에서 전송 플레이트를 제거합니다. 테이프를 제거하고 접시를 엽니다. autoclaved 집게를 사용하여 EpiAirway 삽입 위에 젖은 거즈를 제거합니다. </li><li> 6 잘 판의 우물에 아가로 오스에서 출시에 도움을 왜곡 움직임을 사용하여 autoclaved 포셉로 삽입하고, 장소를 선택하십시오. 어떤 아가로 오스는 전송 판의 온도가 주위에 증가 특히 같이 삽입을 준수합니다. 조심스럽게 삽입에서 아가로 오스를 제거하는 살균 면봉을 사용합니다. 멤브레인를 감동하지 않도록하고, 기포가가 삽입 아래에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 5% CO 2 humidified 37 ° C 배양기에 플레이트를 놓습니다. </li><li> 공동 문화를 시작하기 전에 인큐베이터에서 평형에 조직을 위해 최소 24 시간을 허용하십시오. </li></ol> 3. EpiAirway 조직의 유지 보수 <ol><li> autoclaved 집게를 사용하여 삽입을 선택하고 부드럽게 조직에 칼슘과 마그네슘으로 미리 예열 D - PBS 200 microliters을 피펫하고 삽입을 바위. 각도로 삽입을 기울이기 및 삽입의 하단에있는 멤브레인를 보유하고있는 플라스틱 고리로부터 무균 P1000의 피펫 팁을 넣으십시오. 조직을 만지지 마십시오. D - PBS는 씻어 표시 살균 cryovial에 장소 대기음. 샘플은 -20 ° C에서 냉동하고 나중에 mucin 및 / 또는 시토킨 표현 assayed 수 있습니다. </li><li> aspirating 신선한 MM 1 밀리리터로 대체하여 매일 기초 MM을 변경합니다. 각 잘에 대한 새 벽 피펫 팁을 사용합니다. 하루 10 %의 표백제로 사용되는 미디어를 취급하고 폐기. </li></ol> 4. EpiAirway 조직의 접종 <ol><li> 초콜릿 한천에 냉동 글리세롤 주식의 nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHi)의 새로운 문화를 밖으로 승리. humidified 5% CO 2 배양기에서 하룻밤 성장. </li><li> 그 다음날, 약 0.7의 OD (600 NM)에 칼슘과 마그네슘으로 미리 예열 D - PBS에서 NTHi의 한 식민지 resuspend. 적극적으로 사전 광학 밀도를 측정하는 소용돌이. 로 광학 밀도의 관계 식민지 - 성형 NTHi의 ML (CFU / ML) 단위당 것은 0.2의 OD가 (600 NM) 약 1.0 × 10 8 CFU / ML과 상통한다는 것입니다. 따라서 0.7의 OD (600 NM)는 3.5에 대한 X 10 8 CFU / ML입니다. 이 알고리즘은 접종하기 전에 각 NTHi 변형에 대한 검증해야합니다. </li><li> EpiAirway 조직은 AIR - 100는 0.6 cm 2 0.4 미크론 막의 표면적과 삽입에 성장하고 있습니다. 조직은 ~ 8.0 × 10 5 ~ 1.0 × 10 6 구성되어있다 &lt;/&gt; 세포를 한모금. 12 - 따라서, 1.0 X 10 7 CFU의 접종 약 10 감염의 다중성에 해당합니다. 예방, 3.1에서와 같이 각 EpiAirway 삽입을 린스, 다음 biosafety 캐비닛의 각 EpiAirway 인서트의 혀끝의 표면에 4.2 준비 세균성 정지 28 microliters를 추가합니다. 기초 MM의 예방하​​지 마십시오. 보육 각 접시를 반환합니다. </li></ol> 5. NTHi inoculum의 부량 <ol><li> 소독으로 0.1 % 젤라틴 (PBS - G), 압력솥과 인산염 버퍼 호수 (PBS) 솔루션을 준비합니다. 각각의 튜브에 멸균 PBS - G의 inoculum과 나누어지는 900 microliters의 OD (600 NM)에 따라 원하는 1시 10분의 dilutions와 라벨 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브. </li><li> 주사 NTHi를 열거하는 데 필요한 초콜릿 한천 플레이트의 수를 결정합니다. 한 시간 만이라도 상단의 절반에 휴식 접시의 바닥과 거꾸로 공기 인큐베이터에서 이러한 접시를 놓습니다. 이것은 접시가 모두 37 따뜻한 ° C와 NTHi의 드롭 도금을 촉진, 건조 표면.하실 수 있습니다 </li><li> 4.2에서 첫 번째 튜브로 세균성 정지 100 microliters을 추가하여 inoculum의 일련 1시 10분 dilutions를 시작합니다. 와동은 각 희석을 다해 5 초 동안 이전 다음 서비스를 제공하는 방법을. 각 희석의 절반 접시를 사용하여 미리 예열 및 표면 건조 초콜릿 한천 플레이트에 10 microliter의 aliquots 버려. 5 ~ 6 10 microliter의 aliquots 함께 실행하지 않고 각 100mm 판의 절반에 들어갈 수 있습니다. 언제 거꾸로 humidified 37 건조, 장소 ° C CO 2 배양기 하룻밤. </li><li> 그 다음날, 각 드롭 15-30 뚜렷한 식민지를 dilutions을 계산하고 NTHi의 실제 가능한 inoculum 다시 계산하여 CFU / ML을 결정합니다. </li></ol> 6. NTHi와 장기 공동 문화 <ol><li> 다음, -20에서 박테리아와 동결 같은 변형 ° 향후 분석을 위해 표시 cryovial에 C와 주사되어 각 조직의 세탁을 풀 3.1에서와 같이 24 시간마다는 삽입 씻으십시오. 이 샘플은 도트 blots에 의해 mucin의 존재 또는 엘리사에 의해 크린 시토킨의 표현에 대한 assayed 수 있습니다. 또한, 조직은 mRNA에 대한 수확 수 있으며 qPCR는 관심의 유전자에 수행할 수 있습니다. 3.2에서와 같이 매일 기초 MM을 변경합니다. 공동 문화의 기간 동안 계속합니다. </li></ol> 7. EpiAirway 조직의 수확 <ol><li> 칼슘, 마그네슘없이 D - PBS에서 사포닌의 신선한 1 % 솔루션을 준비, 필터 소독 및 37 ° C.에 따뜻한 </li><li> 37 ° C.에 칼슘, 마그네슘없이 MM 및 D - PBS의 다른 50 ML 튜브를 따뜻하게 </li><li> 5.1로 희석 튜브를 준비뿐만 아니라 삽입 번호와 NTHi 변형으로 표시 삽입 당 하나의 빈 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브. </li><li> EpiAirways은 자기편과 internalized 생물, 아니면 internalized 박테리아를 모두 포함하는 총 셀 관련 박테리아 중 하나에 대한 수확 수 있습니다. </li><li> 드롭 판 휴대 관련 또는 5.2과 같은 NTHi, 공기 인큐베이터에서 한 시간 동안 라벨과 건조를 침공. 필요한 초콜릿 한천 플레이트의 수를 결정 </li><li> 총 세포 관련 박테리아를 수확, 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 200 microliters로 세 번 EpiAirways의 혀끝의 표면을 씻어 다음 삽입을 기울 및 기저 막에서 남아있는 MM를 헹굴. 최초의 세척은 나중에 분석을 위해 냉동 수 있으며 다음과 세척을 삭제. </li><li> 각 조직의 꼭대기의 표면에 7.1에서 멸균 1퍼센트 사포닌 솔루션의 세탁 MM없이 신선한 6 잘 판에 삽입하고, 피펫 250 microliters를 놓습니다. 10 분 인큐베이터로 돌아가기. </li><li> 인큐베이터에서 제거하고, 멸균 P1000 피펫 팁을 사용하여 사용하여 백업 및 규정 모션, 삽입의 가장자리에서 조직을 제거하는 원운동 다음을 막의 조직을 씻어. 큰 구멍 살균 P1000의 피펫 팁을 사용, 7.3에서 준비한 빈 튜브 라벨에 정지를 놓습니다. 삽입의 혀끝의 표면에 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 250 microliters를 추가합니다. </li><li> 수확으로 남아있는 조직이 있는지 확인하기 위해 거꾸로 위상 대비 현미경을 사용하여 삽입을 검사합니다. 필요한 경우, 다른 살균 P1000 피펫 팁로 다시 스크럽, 다음 큰 구멍 살균 P1000의 피펫 팁을 사용하여 7.8에서 관이 정지를 추가합니다. 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS를 사용하여 1 밀리리터로 튜브의 전체 볼륨을 가져와. </li><li> 일분 최고 속도에 적극적으로 와동 세포 현탁액. 26 게이지 바늘로 장착되어 살균 한 ML의 주사기를 사용하여 주사 바늘을 통해 주사기로 정지를 대기음. 천천히 거품을 만들 수 없습니다 간병, 바늘 3 회를 통해 현탁액을 전달합니다. 일분 적극적으로 다시 소용돌이. </li><li> 7 준비 첫 번째 희석 튜브에 큰 구멍 피펫 팁, 장소 정지 100 microliters을 사용합니다.3. 와동을 다해 초 동안 다음, 시리얼 1시 10분 dilutions합니다. 표면 건조 초콜릿 한천 플레이트에 드롭 판 원하는 dilutions. </li><li> internalized 세균만을 수확, 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 200 microliters 각각 삽입에게 3 회 씻는다. 첫 번째 세차를 유지하고 냉동. 100 마이크로 그램 / ML의 최종 농도로 미리 예열 MM에 gentamicin 황산을 추가합니다. 수확으로 삽입할 당 미디어 1.5 ML를 준비합니다. gentamicin 함유 MM과 기초 MM를 교체하고, 혀끝의 표면에 gentamicin 함유 MM 300 microliters를 추가합니다. 한 시간 만이라도 다시 CO 2 배양기에 플레이트를 놓습니다. </li><li> 혀끝의 표면에서 gentamicin 함유 MM를 제거하고 혀끝의 표면과 칼슘, 마그네슘없이 사전 예열 D - PBS로 광범위하게 삽입 기저 막 씻는다. 7.7-7.11와 같이 진행합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : NTHi과 함께 5 일간의 공동 문화를 후 (A.) 감염되지 않은 EpiAirway 조직 및 (B.) 조직의 전자 micrographs를 스캔은 그림 1에 표시됩니다. NTHi와 장기 공동 문화가 혀끝의에 상당한 손상되지 않습니다 조직, EpiAirway 모델의 유틸리티를 강조. 조직 내부 시간이 지남에 따라 계량 internalized 박테리아의 숫자를 묘사한 그래프는 그림 2에 표시됩니다. 두 결과가 매우 재현할 수 있으며, EpiAirway 조직하고 일관성 있고 인간 상부기도의 체외 모델에서 생물학 관련 공부하는 NTHi 호스트 병원체 상호 작용. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. EpiAirway 조직의 전자 현미경을 검사합니다. A. 감염되지 않은 제어 조직. NTHi 공동 문화의 5 일 후에 B. 조직. 혀끝의 표면에 대한 중대한 손상은 감염 조직에서 관찰되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. NTHi 개수 EpiAirway의 공동 문화 중에 시간이 지남에 따라 internalized. 스트레인 R2866은 다음 각 지정된 시점에서 internalized 박테리아에 대한 수확 약 1.0 X 10 7 CFU / 삽입 (데이 0)에서 주사를했다. 바 = 3이 최소한의 중복 복제 N를 나타냅니다. 오류 막대는 SD 있습니다.

<ol><li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae%3A+a+review+of+clinical+aspects%2C+surface+antigens%2C+and+the+human+immune+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li>
<li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Infect.+Dis.+J%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li>
<li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li>
<li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+tracheal%2Fbronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li>
<li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother.+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li>
<li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li>
<li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 방법은 허용하는 공기 - 액체 인터페이스에서 기본 인간의 호흡기 조직의 생물학 관련 배경으로 장기 호스트 병원체 상호 작용의 조사. 여기서 우리는 감염 유기체로 NTHi를 사용해야하지만, 시간이 지남에 따라 허용되지 않는 세포 독성을 소개하지 않는 박테리아의 상호 작용이 방법으로 계량하실 수 있습니다. EpiAirway 모델은 또한 바이러스, 약물, 또는 화학 물질에 영향을 인간의 상부기도 5의 연구에 사용될 수 있습니다, 6, 7, 8. 우리는 적어도 10 일간 NTHi에 감염된 40 개 이상의 일, 그리고 조직에 대한 감염되지 않은 조직을 유지했습니다. 우리는 원하는 경우에 감염된 조직이 크게 오래 유지 될 수 있다고 기대합니다. 이 방법의 한계 reconstitute 이러한 조직에서 유능한 면역 체계를 무능력을 포함하여 체외 모델에서, 그 비슷합니다. 조직의 일상적인 세척이이 조직에서 생산되는 mucin의 자연 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 사포닌 </td><td> Calbiochem </td><td> 558255 - 25GM </td><td> 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS에 1 %, 소독 필터 </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco의 칼슘, 마그네슘과 생리 인산염은 버퍼 </td><td> Lonza </td><td> 17 - 513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco의 칼슘이나 마그네슘없이 생리 인산염은 버퍼 </td><td> Lonza </td><td> 17 - 515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway 항생제없는 조직 </td><td> MatTek </td><td> AIR - 100 - ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway 항생제없는 유지 보수 미디어 </td><td> MatTek </td><td> AIR - 100 - MM - ABF </td><td> 키트와 함께 제공된 </td></tr><tr><td> 10X 인산염 버퍼 생리 식염수 </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1X로 희석 사용하기 전에 </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> JT 베이커 </td><td> 2124-01 </td><td> 1 X PBS 및 압력솥에 0.1 %의 최종 농도에 추가 </td></tr><tr><td> Difco GC 매체 자료 (초콜릿 한천 배지) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> 압력솥 36 500 ML ddH 2 O에서 g와 60 쿨 ° C </td></tr><tr><td> BBL의 혈색소 (초콜릿 한천 배지) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60 쿨 500 ML ddH 2 O에서 압력솥 10g, ° C 이상 GC 매체 기반으로 믹스 </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX 농축 (초콜릿 한천 배지) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> ° C와 rehydrated IsoVitaleX 10 ML을 추가, 초콜릿 한천 플레이트를 부어 55 GC 매체 기지와 헤모글로빈의 혼합물을 쿨 </td></tr><tr><td> 해부 포셉, 좋은 팁이 곡선 </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> 자체 밀봉 살균 파우치 </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin 황산, 10 MG / ML </td><td> Lonza </td><td> 17 - 519Z </td><td> gentamicin 죽이기 위해 EpiAirway의 MM 10 microliters / ML 추가 </td></tr></tbody></table>

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 epiairway 모델의 사용

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

2; Nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHi)는 호흡기 점막 1 반복 및 만성 감염을 일으킬 수 인간 적응 그람 음성 세균 있습니다. 이러한 생물은 호흡 조직 및 내부 생존하는 메커니즘, 박테리아와 인간 세포의 성공적인 장기 협력 문화가 필요합니다 수행할 수있는 모델을 연구한다. 우리는 공기 - 액체 인터페이스에 제기된 주요 인간의 호흡기 상피 조직을 사용 EpiAirway 모델 (MatTek, 애쉬 랜드, MA). 이들은 꽉 분기점, 속눈썹이있는 세포와 nonciliated, mucin를 생산하고, 감염에 대한 응답으로 크린 시토킨를 생산하는 능력을 유지 고블렛 세포를 포함하지 않는 불후의, 잘 차별, 3 차원 조직입니다. 인간 상부기도의 체외 모델에서 본 생물학 관련은 여러 가지 방법으로 사용할 수 있으며이 방법의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 NTHi과 quantitate와 EpiAirway 조직의 장기 공동 문화 셀 - 관련 및 internalized 박테리아를 수행하는 것입니다 . 뿐만 아니라, 공동 문화 감염의 mucin 생산 및 시토킨 프로필이 결정하실 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 많은 현재의 프로토콜의 기존 방법에 따라 개선 연장 기간 세 이상의 세균 감염을 지원하지 않습니다 인간의 세포의 잠수 monolayer 또는 트랜 스웰 문화를 사용합니다. 유기체가 overlying 미디어에 복제할 수있다면 예를 들어,이 실험을 체포, 세포 독성 및 호스트 세포의 손실 허용되지 않는 수준이 발생할 수 있습니다. EpiAirway 모델은 장기 호스트 병원체 상호 작용의 특성을 허용합니다. EpiAirway에 대한 소스가 오히려 불후의 라인보다 일반적인 인간 tracheo - 기관지 세포이기 때문에 또한, 각 구조와 기능 4 모두 실제 인간의 상부 호흡기 트랙트 조직의 훌륭한 표현이다. 이 방법은 EpiAirway 조직은 이전에 배달 2 일 안티 - 미생물 및 안티 곰팡이 화합물의 젖을에서, 모든 절차는 항생제가없는 조건에서 수행됩니다. 이것은 모두 박테리아와 인간의 기본 조직은 동일한 biosafety 캐비닛에 사용되므로, 특별 고려 사항을 요구하고, 오랜 시간 동안 공동 양식입니다.

이 방법은 EpiAirways, 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 기본 인간의 호흡기 상피 조직, 생물학 관련 공동 문화 확장 박테리아의 특성을 허용<em&gt; 체외에서</em&gt; 모델입니다. 접근 방식은 공동 문화 장기 의무가있는 모든 미생물과 함께 사용할 수 있습니다.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

비형형성 헤모필루스 인플루엔자(Nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi)는 인간에 적응한 그람 음성균으로, 호흡기의 재발성 및 만성 감염을 일으킬 수 있습니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 epi airway 모델을 사용하여 비정형 헤모필루스 인플루엔자(Nontypeable Hemophilus influenza 또는 NTHI)와 인간 일차 호흡기 상피 조직의 장기 공동 배양을 수행하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로서 NTHI를 정단 표면에 접종하여 박테리아가 조직에 부착하고 침투하도록 함으로써 달성됩니다. 인서트(insert)는 정상적인 점액 흐름을 모방하고 뮤신 폐기물 및 세포 파편을 제거하기 위해 24시간마다 예열된 DPBS로 세척합니다.다음으로, 원하는 시점에 조직을 수확하여 총 세포 결합 또는 세포 내로 유입된 NTHI의 생존 여부를 결정합니다. 마지막으로, 이 방법을 통해 생균수 기반의 조직 내 시간 경과에 따른 NTHI 생존의 균주 특이적 특성을 평가할 수 있습니다. 이러한 방식은 비형형성 헤모필루스 인플루엔자에 의한 장기 감염에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.또한 Moraxella Alis와 같은 다른 인간 병원체 연구에도 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연할 Dr.Doin은 본 실험실의 박사후 연구원이었습니다. 운반 플레이트를 포장에서 꺼내어 실험 준비를 합니다. 운반 플레이트에 70% ethanol을 뿌린 후, 플레이트를 생물안전작업대(biosafety cabinet) 안에 넣습니다.6-웰 플레이트의 각 웰에 4 °C의 epi airways 유지 배지를 1 mL씩 분주합니다. 그다음 테이프를 제거한 후 플레이트를 열고 epi airway 인서트를 덮고 있는 거즈를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 비트는 동작으로 aros에서 인서트를 분리합니다.필요한 경우, 인서트를 6-웰 플레이트의 웰 중 하나에 넣으십시오. 멸균된 면봉을 사용하여 멤브레인을 건드리지 않도록 주의하며 인서트에서 에어로스(aros)를 조심스럽게 제거하십시오. 인서트 아래에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오.그 다음 6-웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 다음과 같이 매일 인서트(insert)를 세척합니다. 칼슘과 마그네슘이 포함된 DPBS를 미리 데운 후, 팁에 DPBS를 채웁니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 인서트를 조심스럽게 들어 올리고, 미리 데운 DPBS 200 µL를 조직 위에 피펫팅합니다.그런 다음 조직에 닿지 않도록 인서트를 흔들어 DPBS를 고르게 분산시킵니다. 다음으로, 인서트를 기울인 후 인서트 바닥에서 멤브레인을 고정하는 플라스틱 링에 P 1000 피펫 팁을 댑니다. 그런 다음 버퍼 용액을 조심스럽게 흡입하여 나중에 연구할 수 있도록 크라이오 튜브에 담습니다.마지막으로, 기저 유지 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 신선한 배지로 교체합니다. 칼슘과 마그네슘이 포함된 DPBS를 추가로 예열합니다. 예열된 DPBS 3 mL를 15 mL 튜브에 넣은 다음, 초콜릿 한천 배지에서 하룻밤 동안 배양한 비정형 인플루엔자균(nontypeable influenza) 또는 NTHI의 단일 콜로니를 튜브에 넣고 재현탁합니다.이제 튜브를 최소 10초 동안 강하게 볼텍싱한 다음, 광학 밀도를 측정합니다. 박테리아 농도가 OD 600 nanometers 약 0.7에 도달할 때까지 NTHI 단일 콜로니를 계속해서 추가합니다. 다음으로, 이전과 동일하게 미리 데워둔 DPBS로 각 EPI 기도 인서트를 세척한 후, 각 인서트의 apical 표면에 박테리아 현탁액 28 microliters를 첨가합니다.기저 유지 배지에 접종하지 않도록 주의하십시오. 그 후 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 NTHI를 정량화하고, 초콜릿 아가 플레이트를 먼저 예열한 다음 표면을 건조시킵니다. 이어서 0.1% 젤라틴이 포함된 멸균 PBS 또는 PBSG를 사용하여 NTHI 접종액을 단계 희석하십시오.접종액 10 µL씩을 플레이트에 분주한 후, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 각 드롭당 15~30개의 뚜렷한 콜로니가 형성된 희석 배수를 계산하여 mL당 CFU를 결정하고, 이를 통해 실제 생존 가능한 NTHI 접종량을 역산하여 세포 결합 박테리아의 총량을 수확합니다. 에피 기도(epi airways)의 정단 표면을 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS 200 µL로 세 번 헹굽니다.그런 다음 인서트를 기울여 기저막에 남아 있는 유지 배지를 헹구어 냅니다. 세척한 인서트를 새로운 6-웰 플레이트에 넣고, 각 조직의 정단 표면에 멸균된 1% saponin 용액 250 µL를 첨가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 10분 동안 배양합니다.각 희석 튜브에 PBSG 900 µL를 채워 연속 희석을 위한 튜브를 준비합니다. 다음으로, P 1000 피펫 팁을 사용하여 막에서 조직을 앞뒤로 문지른 후, 원형으로 움직여 인서트 가장자리에서 조직을 제거합니다. 그런 다음 멸균된 대구경 P 1000 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 빈 1.5 mL einor 튜브에 옮깁니다.이제 인서트의 apical 표면에 250 µL의 DPBS를 추가한 다음, 도립 위상차 현미경을 사용하여 수확해야 할 조직이 남아 있는지 확인합니다. 현탁액을 einor 튜브에 넣고 500 µL의 DPBS를 추가하여 격렬하게 혼합합니다. 세포 현탁액을 1분 동안 볼텍싱합니다.그런 다음 26 gauge 바늘이 장착된 멸균된 1 mL 주사기를 사용하여, 바늘을 통해 현탁액을 주사기 속으로 흡입합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 현탁액을 바늘을 통해 천천히 세 번 통과시킵니다.그 후 현탁액을 다시 1분 동안 강하게 볼텍싱합니다. 다음으로, 구경이 큰 피펫 팁을 사용하여 현탁액 100 µL를 첫 번째 희석 튜브로 옮깁니다. 튜브를 5초 동안 강하게 볼텍싱한 후, 1:10 연속 희석을 수행하여 희석액을 초콜릿 한천 배지에 분주합니다.그 다음, 내부로 유입된 박테리아를 수확하기 위해 생존 박테리아 수를 측정할 수 있도록 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 각 인서트를 200 µL의 DPBS로 세 번만 세척합니다. 하단 유지 배지를 100 µg/mL 젠타마이신 황산염(gentamycin sulfate)이 포함된 배지로 교체한 후, 젠타마이신이 포함된 유지 배지 300 µL를 상단 표면에 첨가합니다.인서트를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 배양하는 동안, DPBS를 미리 가온합니다. 그 다음, apical 표면에서 Gentamycin이 포함된 유지 배지를 제거합니다. 이어서, 가온된 DPBS를 사용하여 인서트의 apical 표면과 basal 막을 충분히 세척합니다.마지막으로, 이 그림에서 내재화된 박테리아의 연속 희석 및 도말을 수행하기 전에 방금 시연한 세척 및 수확 절차를 반복하십시오. 왼쪽의 감염되지 않은 상피 기도 조직과 오른쪽의 5일간 NTHI에 감염된 상피 기도 조직의 주사 전자 현미경 이미지를 비교해 보겠습니다. NTHI와의 장기 공동 배양이 정단 조직에 상당한 손상을 일으키지 않는 것을 확인할 수 있으며, 이는 상피 기도 모델의 유용성을 강조합니다.상피 기도 공동 배양 중 시간에 따른 NTHI의 내부화 수를 나타낸 그래프가 여기에 제시되어 있습니다. R 2 8 6 6 균주를 인서트당 약 1 × 10⁷ CFU로 접종하였습니다. 이후 각 표시된 시점에서 내부화된 박테리아를 수확하여 그 수를 측정하였습니다.이 영상을 시청하고 나면, A PRE 모델을 사용하여 NTHI를 일차 호르몬 호흡 조직과 장기 공동 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

우리는 면역 적격 마우스에서 만성 상처 감염을 생성하기위한 지연 접종 프로토콜을 설명합니다.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

이 논문은 바이러스 감염 동안 폐렴구균이 무증상 집락 상태에서 질병을 유발하는 병원체로 전환하기 위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 질병 진행의 여러 단계 동안 다양한 숙주에서 다미생물 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

엔테로이드는 조직 생리학 및 병태생리학, 약물 개발 및 재생 의학을 연구하기 위한 새로운 모델로 부상하고 있습니다. 여기서는 관련 조직 세포 유형과의 공동 배양을 허용하는 소 일차 세포 2D 장내 유래 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 모델은 위장 연구 모델링을 위한 중개적 이점을 제공합니다.

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

본 프로토콜은 in vitro에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델의 적용을 개략적으로 설명합니다. 특히, 설명된 모델 시스템은 구강 건강 대 질병의 맥락에서 생물막(치석)과 관련된 미생물에 노출된 다층 구강 상피를 사용합니다.

In vitro에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델 시스템

현재 만성 세균 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 감염을 일으키기 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 임상 격리 물질에 의한 상처 감염에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

배우세요 EpiAirway 모델을 이용한 NTHI와 인간 호흡기 상피 조직의 장기 공동 배양 방법입니다. 이 기법은 세균 생존 특성을 평가하고 호흡기 감염 연구에 활용할 수 있습니다.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

더 많은 동영상 탐색