Name: 배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 배아 마우스 혈관계 형광 염료 라벨링 기법을 통해 혈관 발달 및 유전자 돌연변이 효과를 연구하는 방법입니다. 이 기법은 면역형광 현미경으로 3차원 혈관 구조를 시각화하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIAID에서 NRM 및 JLB에 SREB의 논문의 화목 상을 부여하는 번호 R01AI055001 및 R01AI082127 지원했다.

1. 플루오레신는 dextran과 GSL I - isolectin B 네 얼굴 정맥 주사가 배아 vasculature를 라벨에 표시 <ol><li> isolectin B 1.5mL Eppendorf 튜브에 PBS에서 4 (20ug/200uL) 37에 따뜻한 ° C. - 인산에 FITC - dextran (50ug/mL)를 준비 식염수 (PBS) 또는 GSL 1 버퍼 그린 / PBS GSL 1 FITC - dextran 솔루션 (총 볼륨 1mL) 및 주식 1.25mM 빨리 180uL 주식 1.25mM 빠른 그린 / PBS의 100uL 추가 - isolectin 솔루션은되도록 B 4 (총 볼륨 200uL) 눈에 파란색. </li><li> allantoic 스토킹 (제대 동맥과 정맥)은 그대로두고, 함께 E14.5 - E18.5 배아와 난황을 해부하다. </li><li> 새로운 petrie 요리 (60 X 15mm)로 배아를 전송하고 실온에서 PBS에 젖어. </li><li> 머리 / 얼굴의 화살보기를 제공하기 위해 배아를 놓습니다. 부드럽게 머리에있는 배아를 파악하기 위해 마이크로 해부 집게를 사용하십시오. </li><li> 30G 바늘을 사용 50uL FITC - dextran (50ug/mL) 또는 GSL 1 삽입 - isolectin B 4 (200uL PBS에서 20ug)를 머리 뒤쪽 방향으로 바늘을 가리키는 얼굴 정맥에. </li><li> 염료가 제대 정맥에서 볼 때, 바늘을 제거하고 all​​antoic 스토킹 (제대 동맥과 정맥)에서 배아를 구분한다. </li><li> 주사 다음, 배아는 염료가 배아를 통해 순환되도록 2~3분에 대한 실온에서 PBS에 남아있을 수 있습니다. </li></ol> 2. 피부 vasculature 전체 마운트 분석 <ol><li> 염료는 배아에 걸쳐 순환 수 있도록 후, 다시, 사지의 지역에서 피부 샘플을 제거하고 복부 등 8,9. </li><li> 차가운 PBS의 피부 샘플을 씻고, 그리고 이시간 8,9에 대한 4% PFA / PBS에 수정. 십분 2mL 차가운 PBS로 4mL 명확 약병에 각각에 대해 3 번 씻으십시오. </li><li> 현미경에 놓습니다 스킨 샘플 100 각 슬라이드에 미디어를 장착의 μl와 커버 유리 슬라이드 및 추가합니다. </li><li> 슬라이드는 어두운 저장 영역에서 건조하도록 허용합니다. </li><li> 2 '이미지 수집'섹션 단계로 진행합니다. </li></ol> 3. thymus와 심장 vasculature 및 cryosections에 대한 perivascular 세포의 멀티 컬러 라벨은 (제 1, 7 단계에서 계속) <ol><li> 액체 질소에서 '플래시 프리즈'전체 배아. 공룡의 태아가되며 -80 ° C에서 분석까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 또는, thymus을 해부하다 4 ° C PBS로 씻어, 2 시간 동안 2mL 4 % Paraformaldehyde (PFA) / PBS에 수정. -80에서 사용 ° C. 때까지 차가운 PBS, 10에서 개최 thymi하고, 동결 및 상점에서 10 분 동안 3 번 씻으십시오 </li><li> cryosectioning 들어, 섹션에서 '블록'에 OCT를 확산하고 sectioning에 대한 배아 또는 해부 기관 / 티슈를 탑재합니다. </li><li> 10 μm의 두께는 섹션으로 냉동 조직을 잘라 슬라이드에 수집합니다. </li><li> 50~10분위한 아세톤의 섹션을 수정. 추운 TBS에서 3 번 씻으십시오. </li><li> 실온에서 습도 챔버에서 10 % 당나귀 혈청 / TBS에 차단합니다. </li><li> 4 습도 챔버의 주요 항체 100 μl 1 1 시간 하루에 대한 섹션을 품어 ° C : 예제에서, 우리는 쥐의 반 마우스 CD31 (1:100) 라벨 내피하고, 염소 반 마우스 PDGFR - β를 사용하여 (1:100) perivascular 세포를 분류합니다. 이것은 항체가 균일 섹션에 걸쳐 확산되도록하기 위해 개별적으로 절단 Parafilm 스트립과 함께 슬라이드를 커버하는 데 유용합니다. </li><li> 주요 항체와 부화 다음, 차가운 TBS에서 섹션에게 3 회 씻는다. 최소 30 분 적절한 보조 항체의 100 μl로 품어. </li><li> 추운 TBS에서 3 번 씻으십시오. 100 각 슬라이드에 미디어를 장착의 μl와 덮개 유리를 추가합니다. </li><li> 슬라이드는 어두운 저장 영역에서 건조하도록 허용합니다. </li><li> '이미지 수집'섹션을 참조하십시오. </li></ol> 4. thymus vasculature 및 vibratome 섹션에 대한 perivascular 세포의 멀티 컬러 라벨은 (제 1, 7 단계에서 계속) <ol><li> 배아로부터 thymus 엽 (叶)을 해부하다 차가운 PBS로 린스. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 4% PFA / PBS에 thymus을 수정. </li><li> 용융 낮은 4%의 작은 플라스틱 카트리지와 잠수함의 PBS - 트리톤 X (0.15 %) 3 시간, 10 분 장소 thymi에 씻으 아가로 오스 / PBS (~ 4 ° C). thymus은 카트리지의 하단에 접촉해야합니다. </li><li> 아가로 오스는 얼음 (3~5분)에 응고 수 있습니다. 초과 아가로 오스를 잘라하기 위해 면도날을 사용합니다. vibratome 블록에 접착제를 추가하고 차단하는 샘플을 준수합니다. </li><li> 샘플 및 블레이드가 포장되어 때까지 vibratome 물을 욕조에 차가운 PBS를 추가합니다. </li><li> 속도와 진폭을 (높은 진폭과 낮은 중간 속도 소프트 thymus 섹션에 이상적입니다) 설정합니다. 섹션 초과 교반으로 인해 헤어질 경우 진폭은 감소한다. </li><li> 50 음 섹션을 잘라 버릴거야. </li><li> 붓을를 사용 차가운 PBS에 24 잘 microplate에 섹션을 수집합니다. </li><li> 30 분 동안 PBS - 트리톤 X에서 10 % 당나귀 혈청 (0.15 %) 500 μl의 블록 섹션. </li><li> 같은 차 항체와 함께 하루를 8 시간에 대해 품어 섹션 안티 CD31 및 안티 - PDGFR - β, 대상 24 잘 microplate 인치 </li><li> 4 8 시간 총 ° C.여 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오 </li><li> 30 분 동안 PBS - 트리톤 X에서 10 % 당나귀 혈청 (0.15 %)에서 블록 섹션. </li><li> 4 ° C와 함께 적절한 보조 항체에 하루에 8 시간 섹션을 품어. </li><li> 4 8 시간 총 ° C.여 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오 </li><li> 다시 수정 샘플 4%에 PFA / 얼음에 30 분 PBS. </li><li> 얼음 30 분 이상의 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오. </li><li> 25% MeOH, 50 % MeOH, 75 % MeOH, 각 단계를위한 10 분 100 % MeOH : 등급 MeOH / PBS - 트리톤 X 시리즈를 통해 샘플을 탈수. 십분 후에 신선한 MeOH로 100 % MeOH를 교체하고 실온에서 1 시간 품어. </li><li> 유리 용기에서 혼합 BABB (벤질 알코올 : 벤질 벤조 산) 1시 2분 비율 인치 50 % BABB와 50 % MeOH의 최종 농도에 대한 MeOH와 BABB을 결합합니다. 10-15분에 대한 MeOH : BABB에서 샘플을 품어. </li><li> 상온에서, 10-15 분 또는 정리 할때까지 백퍼센트 BABB과 부화로 유리 용기 샘플을 전송합니다. </li><li> 측면으로 신선한 100 % BABB 및 전송 샘플과 우울증 슬라이드 (0.7mm 깊이)를 입력합니다. 매니큐어로부터 2-3 코트와 유리 (제 1.5) 및 인감을 커버 추가합니다. 상온에서 어둠의 강화 매니큐어가 손톱 허용 후 4 샘플을 저장 ° C. 참고 : 슬라이드가 완전히 공촛점 이미지 수집하기 전에 봉인해야합니다. 형광 염료가 BABB에 페이드 수있는 이미지는 12~24시간 이내에 취득해야합니다. </li><li> '이미지 수집'섹션을 참조하십시오. </li></ol> 5. 이미지 수집 <ol><li> 이미지 10 488과 계획 - 고차 색지움 20X/0.8 목표를 (512 X 512 픽셀)를 사용 공촛점 현미경으로 μm의 냉동 섹션 - (FITC-dextran/GSL 1 - B 사 isolectin), 543 -, 그리고 633 - NM 레이저 라인. </li><li> 공촛점 취득 전체 마운트 피부 및 50 μm의 488과 계획 - 고차 색지움 10X/0.4 목표를 (512 X 512 픽셀)를 사용하여 아가로 오스 - 임베디드 섹션의 Z - 섹션 - (FITC-dextran/GSL 1 - B 사 isolectin), 543 - 와 633 - nm의 레이저 라인. 시리얼 Z - 부분은 각 각 채널에 대해 1 미크론에서 순차적으로 수령해야합니다. </li><li> 자이스 혈구 Axiovision 4.6이나 기타 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 Z - 섹션을 직렬 재구성. </li></ol> 6. 대표 결과 : 배아 vasculature의 효율적인 라벨링은 배아 생쥐에서 혈관 결함을 평가하기위한 중요합니다. 그림 1은 각각 좌우 심실의 얼룩 (1E - F) 이외에 E16.5 thymus 혈관 (1A - B)와 CD31 (1B)와 함께 공동 상표, 특정 라벨을 보여줍니다. GSL I - isolectin B와 같은 섹션 1, 3, 5에 설명된 cryosections 4 프로토콜은 이러한 실험에 사용되었다. 전체 마운트 E16.5 생쥐의 피부 혈관 네트워크의 레이블, 섹션 1, 2에서 설명된 프로토콜을 사용하여, 5은 그림 1C - D에 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> 한 전설을 그림. FITC GSL I - E16.5 마우스 배아에 isolectin B 네 얼굴 정맥 주사. 배아 피부 vasculature 다음 주입의 주입 다음 배아 thymus의 A.의 Cryosection. isolectin B 4 CD31 공동 상표의 B. 병합합니다. C.와 D. 전체 마운트. E. 및 배아 심장의 E. F.의 Cryosection (오른쪽 뇌실) F. (뇌실 왼쪽) 다음과 같은 분사.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

섹션에서 전체 마운트 및 PECAM - 1 (CD31) 얼룩은 배아 생쥐에서 vasculature을 라벨에 대한 종래의 방법입니다. 이 방법은 직접 및 / 또는 간접 immunofluorescence와 마우스 조직을 permeabilize하기 위해 세제의 사용을 필요로합니다. 이것은 다소 적시에 처리하는 증명한다. 여기, 우리는 FITC - dextran 또는 isolectin B 사 안면 정맥 주사 직접함으로써 항체 라벨 단계에 대한 요구를 제거, 배아 vasculature 레이블을 고용했습니다. &#39;새는&#39;phenotypes이 방법으로하지만 기존의 항체 얼룩 방법으로 공개 될 것이다 또한이 방법은 vasculature의 기능 상태를 평가하실 수 있습니다. 우리는 배아 thymus의 섹션을 분석하고, 마음뿐만 아니라, 곧 얼굴 정맥 주사 후 피부 vasculature 전체 마운트하여이 기술의 효율성을 검증했습니다. 또한, 우리는 CD31 다음 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> FITC - dextran </td><td> 시그마 </td><td> FD150S - 1G </td></tr><tr><td> isolectin B 4 - 플루오레신는 GSL 1 분류 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> FL - 1201 </td></tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 195,178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76,240 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> 최적의 절삭 온도 컴파 운드 (OCT </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> 당나귀 세럼 </td><td> 잭슨 </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> 쥐 방지 마우스 CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558,736 </td></tr><tr><td> 염소 안티 마우스 PDGFR - β </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> 당나귀 안티 쥐 CD31 알렉사 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102,516 </td></tr><tr><td> 당나귀 안티 염소 알렉사 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> 트리톤 X -100 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> X - 100 </td></tr><tr><td> 낮은 용융 아가로 오스 / PBS </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A9414 - 25G </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A413 - 4 </td></tr><tr><td> 벤질 알코올 </td><td> Acros 과학 </td><td> 148,390,010 </td></tr><tr><td> 벤질 벤조 산 </td><td> Acros 과학 </td><td> 105,860,010 </td></tr><tr><td> 우울증 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> 커버 유리 (22X22) -1.5 </td><td> 써모 과학 </td><td> 152,222 </td></tr><tr><td> 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 해부 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS - 5135 </td></tr><tr><td> Parafilm 번호 OM992 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 24 잘 microplates </td><td> 에버그린 과학 </td><td> 222-8044 - 01F </td></tr><tr><td> Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL 맑은 튜브 </td><td> 국립 과학 </td><td> B7800 - 2 </td></tr></tbody></table>

배아 마우스에 vasculature을 라벨링하는 방법

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

기능성 혈관 네트워크의 설립 organogenesis의 필수적인 부분이며, 최적의 장기의 기능이 필요합니다. 예를 들어, thymus 적절한 vasculature 형성과 patterning에있는 기관 및 주변에 성숙한 T 세포 출구로 thymocyte 입학 필수적입니다. thymus에서 혈관의 공간적 배열은 로컬 microenvironment의 신호, 즉 상피 세포 thymic (TEC)에 의존적일 수 밖에 없습니다. 몇 가지 최근의 보고서는 thymus 혈관 결함 1,2에서 이러한 신호 결과의 중단을 제안한다. 이전 연구는 신생아와 성인의 thymus vasculature 1,2 레이블을하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 우리는 여기서 배아 thymus에서 혈관을 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 방법은 FITC - dextran 또는 Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 I (GSL 1 - isolectin B 4)의 사용을 결합한 얼굴 정맥 주사 및 CD31 항체 얼룩 thymus 혈관 구조와 thymic perivascular mesenchyme 3-5 라벨 PDGFR - β를 식별할 수 있습니다. cryosections 또는 vibratome 섹션을 사용할 수있는 옵션도 제공됩니다. 이 프로토콜은 thymus 혈관 형성에 TEC - 파생 분자의 역할을 정의하는 것이 중요합니다 thymus 혈관 결함을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 전체 vasculature를 레이블로, 그것은 또한 피부와 마음 60-10 포함한 배아에 걸쳐 여러 기관과 조직에 혈관 네트워크를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

기능적인 혈관 네트워크의 구축은 기관 형성의 필수적인 부분이며, 최적의 기관 기능을 위해 반드시 필요합니다. 예를 들어, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 유전자 변이가 혈관 발달 및 구조에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이를 위해 배아와 배외 조직을 함께 해부하여 주입에 적합한 샘플을 준비합니다. 그다음, 안면 정맥에 형광 염료를 주입하여 온전한 혈관계를 표지합니다.그 후 분석을 위해 배아를 준비합니다. 마지막으로, 전체 마운트 또는 표지된 혈관 절편을 제작하며, 전체 마운트 또는 조직 절편의 면역형광 현미경 관찰을 통해 정상 혈관의 3차원 구조를 보여주는 이미지를 얻습니다. 저는 처음 혈관 신생을 통해 말초 혈관이 흉선과 연결되는 발생 시점을 결정하는 데 관심을 가졌을 때 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.FXI dextran 또는 GS L one I selectin B four를 준비하려면, 1.5 mL eppendorf 튜브에 담긴 PBS에 stock 1.25 mM fast green PBS를 FXI dextran에는 100 µL, GS L one I select B four에는 180 µL를 첨가하여 용액이 육안으로 파란색으로 보이게 합니다. 다음으로, 튜브를 37 °C로 가온합니다.E 14.5에서 E 18.5 단계의 배아와 난황낭을 함께 해부하되, 알란토이스 줄기(Allantoic stalk)는 그대로 둡니다. 배아를 새 페트리 접시로 옮기고 실온의 PBS에 담급니다. 그다음, 얼굴의 시상면이 보이도록 배아의 위치를 잡습니다.그 후 미세 해부용 핀셋을 사용하여 배아의 머리 부분을 부드럽게 잡습니다. 30게이지 바늘을 사용하여 FXI dextran 또는 GS L one I selectin B four 50 µL를 안면 정맥에 주입하며, 이때 바늘 끝을 머리 뒤쪽으로 향하게 합니다. 염료가 제대 정맥에서 보이면 바늘을 제거하고 배아를 lan에서 분리합니다.염색약이 배아 전체에 순환될 수 있도록 배아를 상온의 PBS에 2~3분 동안 둡니다. 염색약이 배아 전체에 순환된 후, 사지, 등 및 복부 부위에서 피부 샘플을 채취합니다.피부 샘플을 차가운 PBS로 세척하고 4% paraldehyde PBS에서 2시간 동안 고정합니다. 그다음 2mL의 차가운 PBS가 담긴 4mL 투명 바이알을 사용하여 10분씩 3회 세척합니다. 피부 샘플을 현미경 슬라이드 위에 올리고, 각 슬라이드에 마운팅 용액 100µL를 첨가한 후 커버슬립을 덮습니다.슬라이드를 암실에서 건조시킨 후 BABB를 이용한 투명화 과정을 거쳐 이미징을 수행하며, 이후 피

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 전체 마운트 immunohistochemistry를 소개하고 레이저 마우스 배아 사지 피부에 복잡한 혈관 네트워크 형성을 분석하는 데 여러 상표와 공촛점 현미경을 검사합니다.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

이 프로토콜은 생쥐의 임신 중 모계 혈관 구조의 변화를 평가하는 기술을 설명합니다. 입체학적 방법을 사용하여 탈피나선동맥의 리모델링을 정량적으로 평가하고 결과는 면역조직화학을 사용하여 정성적으로 확인했습니다.

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Echocardiographic 시험 쥐에서 자주 사용 됩니다. 비싼 고해상도 초음파 장치가이 목적을 위해 개발 되었습니다. 이 프로토콜에서는 심장 형태를 결정 하는 조직학 형태학 분석 함께 저렴 한 echocardiographic 절차를 설명 합니다.

마우스의 심장 형태학의 echocardiographic 및 조직학 검사

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

이 기사에서는 픽스 쳐에 희석 한 DiI의 심장 관류에 의해 텔 레 ost 물고기의 혈관을 라벨링 하기 위한 빠른 프로토콜을 설명 하고, 송사리를 모델로 하 고 뇌 및 뇌 하 수 체 조직에 초점을 맞추고 있습니다.

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

뇌혈관 기능 장애를 조사하기 위한 모델로 생쥐의 대혈관 확장을 화학적으로 유도하는 것을 시연하고 있으며, 이는 혈관성 치매 및 알츠하이머병 모델링에 사용할 수 있습니다. 또한 실리콘 고무 화합물을 주입하여 혈관 구조를 시각화하고 혈관 크기의 변화를 측정하기 위한 명확한 시각적 지침을 제공하는 방법을 보여줍니다.

A visual approach for inducing dolichoectasia in mice to model large vessel-mediated cerebrovascular dysfunction(대혈관 매개 뇌혈관 기능 장애를 모델링하기 위해 마우스에서 백우절충증을 유도하기 위한 시각적 접근법)

이 프로토콜은 광시트 형광 현미경을 사용하여 정량적 전체 마운트 3차원 혈관 이미징을 위한 신속한 방법을 소개합니다. 이 방법의 효능은 전산 유체 역학을 통해 정량화된 혈역학적 힘과 함께 병아리 배아 모델의 인두 궁 동맥 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

정량적 연구를 위한 소동물 혈관 구조의 신속한 전체 마운트 고해상도 이미징

배우세요 배아 마우스 혈관계 형광 염료 라벨링 기법을 통해 혈관 발달 및 유전자 돌연변이 효과를 연구하는 방법입니다. 이 기법은 면역형광 현미경으로 3차원 혈관 구조를 시각화하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

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