배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 유전자 변이가 혈관 발달 및 구조에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이를 위해 배아와 배외 조직을 함께 해부하여 주입에 적합한 샘플을 준비합니다. 그다음, 안면 정맥에 형광 염료를 주입하여 온전한 혈관계를 표지합니다.

그 후 분석을 위해 배아를 준비합니다. 마지막으로, 전체 마운트 또는 표지된 혈관 절편을 제작하며, 전체 마운트 또는 조직 절편의 면역형광 현미경 관찰을 통해 정상 혈관의 3차원 구조를 보여주는 이미지를 얻습니다. 저는 처음 혈관 신생을 통해 말초 혈관이 흉선과 연결되는 발생 시점을 결정하는 데 관심을 가졌을 때 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

FXI dextran 또는 GS L one I selectin B four를 준비하려면, 1.5 mL eppendorf 튜브에 담긴 PBS에 stock 1.25 mM fast green PBS를 FXI dextran에는 100 µL, GS L one I select B four에는 180 µL를 첨가하여 용액이 육안으로 파란색으로 보이게 합니다. 다음으로, 튜브를 37 °C로 가온합니다.

E 14.5에서 E 18.5 단계의 배아와 난황낭을 함께 해부하되, 알란토이스 줄기(Allantoic stalk)는 그대로 둡니다. 배아를 새 페트리 접시로 옮기고 실온의 PBS에 담급니다. 그다음, 얼굴의 시상면이 보이도록 배아의 위치를 잡습니다.

그 후 미세 해부용 핀셋을 사용하여 배아의 머리 부분을 부드럽게 잡습니다. 30게이지 바늘을 사용하여 FXI dextran 또는 GS L one I selectin B four 50 µL를 안면 정맥에 주입하며, 이때 바늘 끝을 머리 뒤쪽으로 향하게 합니다. 염료가 제대 정맥에서 보이면 바늘을 제거하고 배아를 lan에서 분리합니다.

염색약이 배아 전체에 순환될 수 있도록 배아를 상온의 PBS에 2~3분 동안 둡니다. 염색약이 배아 전체에 순환된 후, 사지, 등 및 복부 부위에서 피부 샘플을 채취합니다.

피부 샘플을 차가운 PBS로 세척하고 4% paraldehyde PBS에서 2시간 동안 고정합니다. 그다음 2mL의 차가운 PBS가 담긴 4mL 투명 바이알을 사용하여 10분씩 3회 세척합니다. 피부 샘플을 현미경 슬라이드 위에 올리고, 각 슬라이드에 마운팅 용액 100µL를 첨가한 후 커버슬립을 덮습니다.

슬라이드를 암실에서 건조시킨 후 BABB를 이용한 투명화 과정을 거쳐 이미징을 수행하며, 이후 피부 혈관의 고해상도 이미지를 얻기 위해 공초점 이미징을 수행할 수 있습니다. 동결 절편 제작을 위해 조직을 준비하려면, 전체 배아를 액체 질소에 급속 냉동하십시오. 섹션 블록에 OCT를 도포하고 배아를 고정합니다.

냉동 조직을 10 micron 두께로 절편하여 슬라이드에 수집합니다. 절편을 아세톤으로 5~10분 동안 고정한 후, 습도 챔버 내에서 차가운 TBS로 3회 세척하고 TBS에 10% Donkey serum을 첨가하여 블로킹합니다. 실온에서 각 절편에 1차 항체 100 microliters를 첨가합니다.

본 예시에서는 혈관 내피를 표지하기 위해 rat anti-US CD 31을 사용하고, 혈관 주위 세포를 표지하기 위해 goat anti-US P-D-G-F-R beta를 사용하여 항체가 절편 전체에 균일하게 도포되도록 합니다. 개별적으로 자른 파라필름 스트립으로 슬라이드를 덮습니다. 4 °C의 습도 챔버에서 슬라이드를 1시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음으로, 절편을 차가운 TBS로 3회 세척합니다. 적절한 2차 항체 100 µL를 처리하여 최소 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 차가운 TBS로 3회 세척한 후 각 슬라이드에 마운팅 용액 100 µL를 추가하고 커버글라스를 덮습니다.

슬라이드를 암소에서 건조시킵니다. 진동 절편 제작(vibram sectioning)을 위해, 배아에서 흉선 엽을 분리하여 차가운 PBS로 헹굽니다. 조직을 실온의 4% paraformaldehyde PBS에 2시간 동안 고정합니다.

샘플을 PBS Triton X로 세척한 후, 4% low melt agarose PBS로 작은 플라스틱 카트리지를 채웁니다. 샘플을 agarose PBS에 담그고, 조직이 카트리지 바닥에 닿아 있는지 확인합니다. 얼음 위에서 agarose를 응고시킵니다.

그런 다음 면도날을 사용하여 과도한 아가로스를 잘라냅니다. VIBRAM 블록에 접착제를 바르고 샘플을 블록에 부착합니다. 샘플과 날이 잠길 때까지 Vibram 워터 배스에 차가운 PBS를 붓습니다.

속도와 진폭을 설정하십시오. 진폭은 낮추어야 합니다. 과도한 교반으로 인해 절편이 찢어지는 경우, 조직을 50개 절편으로 자르십시오.

그 다음 핀셋을 사용하여 절편들을 24-웰 마이크로플레이트의 차가운 PBS로 옮깁니다. PBS Triton X에 희석된 10% donkey serum 500 µL에서 절편들을 30분 동안 블로킹합니다. anti CD 31 및 anti P-D-G-F-R beta와 같은 1차 항체를 첨가한 후, 덮개가 덮인 마이크로플레이트에서 4 °C로 8시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로 4 °C에서 총 8시간에 걸쳐 PBS Triton X로 3회 세척합니다.

절편을 다시 블로킹하고 2차 항체에서 배양한 후, 4°C에서 총 8시간 동안 PBS Triton X로 샘플을 3회 세척합니다. 그다음 4% paraformaldehyde PBS에서 30분 동안 얼음 위에서 샘플을 재고정하고, 다시 얼음 위에서 30분 동안 PBS Triton X로 3회 더 세척합니다. 각 단계당 10분씩 단계별 methanol PBS Triton X 시리즈를 통해 샘플을 탈수합니다.

그 후 100% methanol을 신선한 methanol로 교체하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 유리 오목 슬라이드에 놓고 BABB와 methanol의 1:1 혼합 용액으로 샘플을 덮습니다. 샘플을 10~15분 동안 배양합니다.

다음으로, 용액을 100% BABB로 교체하고 실온에서 10~15분 동안 또는 투명해질 때까지 배양합니다. 커버 글라스를 덮고 매니큐어를 두세 번 덧발라 밀봉합니다. 실온의 어두운 곳에서 매니큐어를 경화시킵니다.

시료는 4°C에서 보관할 수 있으나, 12~24시간 이내에 이미지를 촬영해야 합니다. Plan-Apochromat 20x 0.8 대물렌즈와 633, 488, 543 nm 레이저 라인을 사용하는 공초점 현미경으로 10 µm 동결 절편을 촬영하십시오. Plan-Apochromat 10x 0.4 대물렌즈와 488, 543, 633 nm 레이저 라인을 사용하여 50 µm OCT 임베딩 절편의 1 µm 공초점 Z-섹션을 획득하십시오. Zeiss AIA vision 4.6 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 연속 Z-섹션을 재구성하십시오. 배아 혈관계의 효율적인 라벨링은 배아 생쥐의 혈관 결함을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 도표들은 E16.5 흉선 혈관의 특이적 라벨링과 GS L1 및 I-selectin의 공동 라벨링을 보여줍니다.

CD 31을 주입한 B four 배아와 우심실 및 좌심실의 염색 결과입니다. 이 실험들에서는 cryo sections를 위한 GSL one I selectin B four 프로토콜이 사용되었습니다. 이 절차를 따른 E 16.5 마우스 피부 혈관 네트워크의 hole mount 라벨링 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

혈관과 함께 기질 세포 및 혈액 세포를 공동 라벨링하는 것과 같은 다른 방법들을 사용하여, 정상 및 병리적 조건 모두에서 생쥐 배아의 혈액 세포와 기질 세포가 혈관과 어떻게 상호작용하는가와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.