Name: 배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 배아 마우스 혈관계 형광 염료 라벨링 기법을 통해 혈관 발달 및 유전자 돌연변이 효과를 연구하는 방법입니다. 이 기법은 면역형광 현미경으로 3차원 혈관 구조를 시각화하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIAID에서 NRM 및 JLB에 SREB의 논문의 화목 상을 부여하는 번호 R01AI055001 및 R01AI082127 지원했다.

1. 플루오레신는 dextran과 GSL I - isolectin B 네 얼굴 정맥 주사가 배아 vasculature를 라벨에 표시 <ol><li> isolectin B 1.5mL Eppendorf 튜브에 PBS에서 4 (20ug/200uL) 37에 따뜻한 ° C. - 인산에 FITC - dextran (50ug/mL)를 준비 식염수 (PBS) 또는 GSL 1 버퍼 그린 / PBS GSL 1 FITC - dextran 솔루션 (총 볼륨 1mL) 및 주식 1.25mM 빨리 180uL 주식 1.25mM 빠른 그린 / PBS의 100uL 추가 - isolectin 솔루션은되도록 B 4 (총 볼륨 200uL) 눈에 파란색. </li><li> allantoic 스토킹 (제대 동맥과 정맥)은 그대로두고, 함께 E14.5 - E18.5 배아와 난황을 해부하다. </li><li> 새로운 petrie 요리 (60 X 15mm)로 배아를 전송하고 실온에서 PBS에 젖어. </li><li> 머리 / 얼굴의 화살보기를 제공하기 위해 배아를 놓습니다. 부드럽게 머리에있는 배아를 파악하기 위해 마이크로 해부 집게를 사용하십시오. </li><li> 30G 바늘을 사용 50uL FITC - dextran (50ug/mL) 또는 GSL 1 삽입 - isolectin B 4 (200uL PBS에서 20ug)를 머리 뒤쪽 방향으로 바늘을 가리키는 얼굴 정맥에. </li><li> 염료가 제대 정맥에서 볼 때, 바늘을 제거하고 all​​antoic 스토킹 (제대 동맥과 정맥)에서 배아를 구분한다. </li><li> 주사 다음, 배아는 염료가 배아를 통해 순환되도록 2~3분에 대한 실온에서 PBS에 남아있을 수 있습니다. </li></ol> 2. 피부 vasculature 전체 마운트 분석 <ol><li> 염료는 배아에 걸쳐 순환 수 있도록 후, 다시, 사지의 지역에서 피부 샘플을 제거하고 복부 등 8,9. </li><li> 차가운 PBS의 피부 샘플을 씻고, 그리고 이시간 8,9에 대한 4% PFA / PBS에 수정. 십분 2mL 차가운 PBS로 4mL 명확 약병에 각각에 대해 3 번 씻으십시오. </li><li> 현미경에 놓습니다 스킨 샘플 100 각 슬라이드에 미디어를 장착의 μl와 커버 유리 슬라이드 및 추가합니다. </li><li> 슬라이드는 어두운 저장 영역에서 건조하도록 허용합니다. </li><li> 2 '이미지 수집'섹션 단계로 진행합니다. </li></ol> 3. thymus와 심장 vasculature 및 cryosections에 대한 perivascular 세포의 멀티 컬러 라벨은 (제 1, 7 단계에서 계속) <ol><li> 액체 질소에서 '플래시 프리즈'전체 배아. 공룡의 태아가되며 -80 ° C에서 분석까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 또는, thymus을 해부하다 4 ° C PBS로 씻어, 2 시간 동안 2mL 4 % Paraformaldehyde (PFA) / PBS에 수정. -80에서 사용 ° C. 때까지 차가운 PBS, 10에서 개최 thymi하고, 동결 및 상점에서 10 분 동안 3 번 씻으십시오 </li><li> cryosectioning 들어, 섹션에서 '블록'에 OCT를 확산하고 sectioning에 대한 배아 또는 해부 기관 / 티슈를 탑재합니다. </li><li> 10 μm의 두께는 섹션으로 냉동 조직을 잘라 슬라이드에 수집합니다. </li><li> 50~10분위한 아세톤의 섹션을 수정. 추운 TBS에서 3 번 씻으십시오. </li><li> 실온에서 습도 챔버에서 10 % 당나귀 혈청 / TBS에 차단합니다. </li><li> 4 습도 챔버의 주요 항체 100 μl 1 1 시간 하루에 대한 섹션을 품어 ° C : 예제에서, 우리는 쥐의 반 마우스 CD31 (1:100) 라벨 내피하고, 염소 반 마우스 PDGFR - β를 사용하여 (1:100) perivascular 세포를 분류합니다. 이것은 항체가 균일 섹션에 걸쳐 확산되도록하기 위해 개별적으로 절단 Parafilm 스트립과 함께 슬라이드를 커버하는 데 유용합니다. </li><li> 주요 항체와 부화 다음, 차가운 TBS에서 섹션에게 3 회 씻는다. 최소 30 분 적절한 보조 항체의 100 μl로 품어. </li><li> 추운 TBS에서 3 번 씻으십시오. 100 각 슬라이드에 미디어를 장착의 μl와 덮개 유리를 추가합니다. </li><li> 슬라이드는 어두운 저장 영역에서 건조하도록 허용합니다. </li><li> '이미지 수집'섹션을 참조하십시오. </li></ol> 4. thymus vasculature 및 vibratome 섹션에 대한 perivascular 세포의 멀티 컬러 라벨은 (제 1, 7 단계에서 계속) <ol><li> 배아로부터 thymus 엽 (叶)을 해부하다 차가운 PBS로 린스. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 4% PFA / PBS에 thymus을 수정. </li><li> 용융 낮은 4%의 작은 플라스틱 카트리지와 잠수함의 PBS - 트리톤 X (0.15 %) 3 시간, 10 분 장소 thymi에 씻으 아가로 오스 / PBS (~ 4 ° C). thymus은 카트리지의 하단에 접촉해야합니다. </li><li> 아가로 오스는 얼음 (3~5분)에 응고 수 있습니다. 초과 아가로 오스를 잘라하기 위해 면도날을 사용합니다. vibratome 블록에 접착제를 추가하고 차단하는 샘플을 준수합니다. </li><li> 샘플 및 블레이드가 포장되어 때까지 vibratome 물을 욕조에 차가운 PBS를 추가합니다. </li><li> 속도와 진폭을 (높은 진폭과 낮은 중간 속도 소프트 thymus 섹션에 이상적입니다) 설정합니다. 섹션 초과 교반으로 인해 헤어질 경우 진폭은 감소한다. </li><li> 50 음 섹션을 잘라 버릴거야. </li><li> 붓을를 사용 차가운 PBS에 24 잘 microplate에 섹션을 수집합니다. </li><li> 30 분 동안 PBS - 트리톤 X에서 10 % 당나귀 혈청 (0.15 %) 500 μl의 블록 섹션. </li><li> 같은 차 항체와 함께 하루를 8 시간에 대해 품어 섹션 안티 CD31 및 안티 - PDGFR - β, 대상 24 잘 microplate 인치 </li><li> 4 8 시간 총 ° C.여 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오 </li><li> 30 분 동안 PBS - 트리톤 X에서 10 % 당나귀 혈청 (0.15 %)에서 블록 섹션. </li><li> 4 ° C와 함께 적절한 보조 항체에 하루에 8 시간 섹션을 품어. </li><li> 4 8 시간 총 ° C.여 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오 </li><li> 다시 수정 샘플 4%에 PFA / 얼음에 30 분 PBS. </li><li> 얼음 30 분 이상의 PBS - 트리톤 X 3 회 (0.15 %)를 씻으십시오. </li><li> 25% MeOH, 50 % MeOH, 75 % MeOH, 각 단계를위한 10 분 100 % MeOH : 등급 MeOH / PBS - 트리톤 X 시리즈를 통해 샘플을 탈수. 십분 후에 신선한 MeOH로 100 % MeOH를 교체하고 실온에서 1 시간 품어. </li><li> 유리 용기에서 혼합 BABB (벤질 알코올 : 벤질 벤조 산) 1시 2분 비율 인치 50 % BABB와 50 % MeOH의 최종 농도에 대한 MeOH와 BABB을 결합합니다. 10-15분에 대한 MeOH : BABB에서 샘플을 품어. </li><li> 상온에서, 10-15 분 또는 정리 할때까지 백퍼센트 BABB과 부화로 유리 용기 샘플을 전송합니다. </li><li> 측면으로 신선한 100 % BABB 및 전송 샘플과 우울증 슬라이드 (0.7mm 깊이)를 입력합니다. 매니큐어로부터 2-3 코트와 유리 (제 1.5) 및 인감을 커버 추가합니다. 상온에서 어둠의 강화 매니큐어가 손톱 허용 후 4 샘플을 저장 ° C. 참고 : 슬라이드가 완전히 공촛점 이미지 수집하기 전에 봉인해야합니다. 형광 염료가 BABB에 페이드 수있는 이미지는 12~24시간 이내에 취득해야합니다. </li><li> '이미지 수집'섹션을 참조하십시오. </li></ol> 5. 이미지 수집 <ol><li> 이미지 10 488과 계획 - 고차 색지움 20X/0.8 목표를 (512 X 512 픽셀)를 사용 공촛점 현미경으로 μm의 냉동 섹션 - (FITC-dextran/GSL 1 - B 사 isolectin), 543 -, 그리고 633 - NM 레이저 라인. </li><li> 공촛점 취득 전체 마운트 피부 및 50 μm의 488과 계획 - 고차 색지움 10X/0.4 목표를 (512 X 512 픽셀)를 사용하여 아가로 오스 - 임베디드 섹션의 Z - 섹션 - (FITC-dextran/GSL 1 - B 사 isolectin), 543 - 와 633 - nm의 레이저 라인. 시리얼 Z - 부분은 각 각 채널에 대해 1 미크론에서 순차적으로 수령해야합니다. </li><li> 자이스 혈구 Axiovision 4.6이나 기타 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 Z - 섹션을 직렬 재구성. </li></ol> 6. 대표 결과 : 배아 vasculature의 효율적인 라벨링은 배아 생쥐에서 혈관 결함을 평가하기위한 중요합니다. 그림 1은 각각 좌우 심실의 얼룩 (1E - F) 이외에 E16.5 thymus 혈관 (1A - B)와 CD31 (1B)와 함께 공동 상표, 특정 라벨을 보여줍니다. GSL I - isolectin B와 같은 섹션 1, 3, 5에 설명된 cryosections 4 프로토콜은 이러한 실험에 사용되었다. 전체 마운트 E16.5 생쥐의 피부 혈관 네트워크의 레이블, 섹션 1, 2에서 설명된 프로토콜을 사용하여, 5은 그림 1C - D에 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> 한 전설을 그림. FITC GSL I - E16.5 마우스 배아에 isolectin B 네 얼굴 정맥 주사. 배아 피부 vasculature 다음 주입의 주입 다음 배아 thymus의 A.의 Cryosection. isolectin B 4 CD31 공동 상표의 B. 병합합니다. C.와 D. 전체 마운트. E. 및 배아 심장의 E. F.의 Cryosection (오른쪽 뇌실) F. (뇌실 왼쪽) 다음과 같은 분사.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

섹션에서 전체 마운트 및 PECAM - 1 (CD31) 얼룩은 배아 생쥐에서 vasculature을 라벨에 대한 종래의 방법입니다. 이 방법은 직접 및 / 또는 간접 immunofluorescence와 마우스 조직을 permeabilize하기 위해 세제의 사용을 필요로합니다. 이것은 다소 적시에 처리하는 증명한다. 여기, 우리는 FITC - dextran 또는 isolectin B 사 안면 정맥 주사 직접함으로써 항체 라벨 단계에 대한 요구를 제거, 배아 vasculature 레이블을 고용했습니다. &#39;새는&#39;phenotypes이 방법으로하지만 기존의 항체 얼룩 방법으로 공개 될 것이다 또한이 방법은 vasculature의 기능 상태를 평가하실 수 있습니다. 우리는 배아 thymus의 섹션을 분석하고, 마음뿐만 아니라, 곧 얼굴 정맥 주사 후 피부 vasculature 전체 마운트하여이 기술의 효율성을 검증했습니다. 또한, 우리는 CD31 다음 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> FITC - dextran </td><td> 시그마 </td><td> FD150S - 1G </td></tr><tr><td> isolectin B 4 - 플루오레신는 GSL 1 분류 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> FL - 1201 </td></tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 195,178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76,240 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> 최적의 절삭 온도 컴파 운드 (OCT </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> 당나귀 세럼 </td><td> 잭슨 </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> 쥐 방지 마우스 CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558,736 </td></tr><tr><td> 염소 안티 마우스 PDGFR - β </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> 당나귀 안티 쥐 CD31 알렉사 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102,516 </td></tr><tr><td> 당나귀 안티 염소 알렉사 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> 트리톤 X -100 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> X - 100 </td></tr><tr><td> 낮은 용융 아가로 오스 / PBS </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A9414 - 25G </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A413 - 4 </td></tr><tr><td> 벤질 알코올 </td><td> Acros 과학 </td><td> 148,390,010 </td></tr><tr><td> 벤질 벤조 산 </td><td> Acros 과학 </td><td> 105,860,010 </td></tr><tr><td> 우울증 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> 커버 유리 (22X22) -1.5 </td><td> 써모 과학 </td><td> 152,222 </td></tr><tr><td> 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 해부 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS - 5135 </td></tr><tr><td> Parafilm 번호 OM992 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 24 잘 microplates </td><td> 에버그린 과학 </td><td> 222-8044 - 01F </td></tr><tr><td> Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL 맑은 튜브 </td><td> 국립 과학 </td><td> B7800 - 2 </td></tr></tbody></table>

배아 마우스에 vasculature을 라벨링하는 방법

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

기능성 혈관 네트워크의 설립 organogenesis의 필수적인 부분이며, 최적의 장기의 기능이 필요합니다. 예를 들어, thymus 적절한 vasculature 형성과 patterning에있는 기관 및 주변에 성숙한 T 세포 출구로 thymocyte 입학 필수적입니다. thymus에서 혈관의 공간적 배열은 로컬 microenvironment의 신호, 즉 상피 세포 thymic (TEC)에 의존적일 수 밖에 없습니다. 몇 가지 최근의 보고서는 thymus 혈관 결함 1,2에서 이러한 신호 결과의 중단을 제안한다. 이전 연구는 신생아와 성인의 thymus vasculature 1,2 레이블을하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 우리는 여기서 배아 thymus에서 혈관을 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 방법은 FITC - dextran 또는 Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 I (GSL 1 - isolectin B 4)의 사용을 결합한 얼굴 정맥 주사 및 CD31 항체 얼룩 thymus 혈관 구조와 thymic perivascular mesenchyme 3-5 라벨 PDGFR - β를 식별할 수 있습니다. cryosections 또는 vibratome 섹션을 사용할 수있는 옵션도 제공됩니다. 이 프로토콜은 thymus 혈관 형성에 TEC - 파생 분자의 역할을 정의하는 것이 중요합니다 thymus 혈관 결함을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 전체 vasculature를 레이블로, 그것은 또한 피부와 마음 60-10 포함한 배아에 걸쳐 여러 기관과 조직에 혈관 네트워크를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

기능적인 혈관 네트워크의 구축은 기관 형성의 필수적인 부분이며, 최적의 기관 기능을 위해 반드시 필요합니다. 예를 들어, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 유전자 변이가 혈관 발달 및 구조에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이를 위해 배아와 배외 조직을 함께 해부하여 주입에 적합한 샘플을 준비합니다. 그다음, 안면 정맥에 형광 염료를 주입하여 온전한 혈관계를 표지합니다.그 후 분석을 위해 배아를 준비합니다. 마지막으로, 전체 마운트 또는 표지된 혈관 절편을 제작하며, 전체 마운트 또는 조직 절편의 면역형광 현미경 관찰을 통해 정상 혈관의 3차원 구조를 보여주는 이미지를 얻습니다. 저는 처음 혈관 신생을 통해 말초 혈관이 흉선과 연결되는 발생 시점을 결정하는 데 관심을 가졌을 때 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.FXI dextran 또는 GS L one I selectin B four를 준비하려면, 1.5 mL eppendorf 튜브에 담긴 PBS에 stock 1.25 mM fast green PBS를 FXI dextran에는 100 µL, GS L one I select B four에는 180 µL를 첨가하여 용액이 육안으로 파란색으로 보이게 합니다. 다음으로, 튜브를 37 °C로 가온합니다.E 14.5에서 E 18.5 단계의 배아와 난황낭을 함께 해부하되, 알란토이스 줄기(Allantoic stalk)는 그대로 둡니다. 배아를 새 페트리 접시로 옮기고 실온의 PBS에 담급니다. 그다음, 얼굴의 시상면이 보이도록 배아의 위치를 잡습니다.그 후 미세 해부용 핀셋을 사용하여 배아의 머리 부분을 부드럽게 잡습니다. 30게이지 바늘을 사용하여 FXI dextran 또는 GS L one I selectin B four 50 µL를 안면 정맥에 주입하며, 이때 바늘 끝을 머리 뒤쪽으로 향하게 합니다. 염료가 제대 정맥에서 보이면 바늘을 제거하고 배아를 lan에서 분리합니다.염색약이 배아 전체에 순환될 수 있도록 배아를 상온의 PBS에 2~3분 동안 둡니다. 염색약이 배아 전체에 순환된 후, 사지, 등 및 복부 부위에서 피부 샘플을 채취합니다.피부 샘플을 차가운 PBS로 세척하고 4% paraldehyde PBS에서 2시간 동안 고정합니다. 그다음 2mL의 차가운 PBS가 담긴 4mL 투명 바이알을 사용하여 10분씩 3회 세척합니다. 피부 샘플을 현미경 슬라이드 위에 올리고, 각 슬라이드에 마운팅 용액 100µL를 첨가한 후 커버슬립을 덮습니다.슬라이드를 암실에서 건조시킨 후 BABB를 이용한 투명화 과정을 거쳐 이미징을 수행하며, 이후 피부 혈관의 고해상도 이미지를 얻기 위해 공초점 이미징을 수행할 수 있습니다. 동결 절편 제작을 위해 조직을 준비하려면, 전체 배아를 액체 질소에 급속 냉동하십시오. 섹션 블록에 OCT를 도포하고 배아를 고정합니다.냉동 조직을 10 micron 두께로 절편하여 슬라이드에 수집합니다. 절편을 아세톤으로 5~10분 동안 고정한 후, 습도 챔버 내에서 차가운 TBS로 3회 세척하고 TBS에 10% Donkey serum을 첨가하여 블로킹합니다. 실온에서 각 절편에 1차 항체 100 microliters를 첨가합니다.본 예시에서는 혈관 내피를 표지하기 위해 rat anti-US CD 31을 사용하고, 혈관 주위 세포를 표지하기 위해 goat anti-US P-D-G-F-R beta를 사용하여 항체가 절편 전체에 균일하게 도포되도록 합니다. 개별적으로 자른 파라필름 스트립으로 슬라이드를 덮습니다. 4 °C의 습도 챔버에서 슬라이드를 1시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음으로, 절편을 차가운 TBS로 3회 세척합니다. 적절한 2차 항체 100 µL를 처리하여 최소 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 차가운 TBS로 3회 세척한 후 각 슬라이드에 마운팅 용액 100 µL를 추가하고 커버글라스를 덮습니다.슬라이드를 암소에서 건조시킵니다. 진동 절편 제작(vibram sectioning)을 위해, 배아에서 흉선 엽을 분리하여 차가운 PBS로 헹굽니다. 조직을 실온의 4% paraformaldehyde PBS에 2시간 동안 고정합니다.샘플을 PBS Triton X로 세척한 후, 4% low melt agarose PBS로 작은 플라스틱 카트리지를 채웁니다. 샘플을 agarose PBS에 담그고, 조직이 카트리지 바닥에 닿아 있는지 확인합니다. 얼음 위에서 agarose를 응고시킵니다.그런 다음 면도날을 사용하여 과도한 아가로스를 잘라냅니다. VIBRAM 블록에 접착제를 바르고 샘플을 블록에 부착합니다. 샘플과 날이 잠길 때까지 Vibram 워터 배스에 차가운 PBS를 붓습니다.속도와 진폭을 설정하십시오. 진폭은 낮추어야 합니다. 과도한 교반으로 인해 절편이 찢어지는 경우, 조직을 50개 절편으로 자르십시오.그 다음 핀셋을 사용하여 절편들을 24-웰 마이크로플레이트의 차가운 PBS로 옮깁니다. PBS Triton X에 희석된 10% donkey serum 500 µL에서 절편들을 30분 동안 블로킹합니다. anti CD 31 및 anti P-D-G-F-R beta와 같은 1차 항체를 첨가한 후, 덮개가 덮인 마이크로플레이트에서 4 °C로 8시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로 4 °C에서 총 8시간에 걸쳐 PBS Triton X로 3회 세척합니다.절편을 다시 블로킹하고 2차 항체에서 배양한 후, 4°C에서 총 8시간 동안 PBS Triton X로 샘플을 3회 세척합니다. 그다음 4% paraformaldehyde PBS에서 30분 동안 얼음 위에서 샘플을 재고정하고, 다시 얼음 위에서 30분 동안 PBS Triton X로 3회 더 세척합니다. 각 단계당 10분씩 단계별 methanol PBS Triton X 시리즈를 통해 샘플을 탈수합니다.그 후 100% methanol을 신선한 methanol로 교체하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 유리 오목 슬라이드에 놓고 BABB와 methanol의 1:1 혼합 용액으로 샘플을 덮습니다. 샘플을 10~15분 동안 배양합니다.다음으로, 용액을 100% BABB로 교체하고 실온에서 10~15분 동안 또는 투명해질 때까지 배양합니다. 커버 글라스를 덮고 매니큐어를 두세 번 덧발라 밀봉합니다. 실온의 어두운 곳에서 매니큐어를 경화시킵니다.시료는 4°C에서 보관할 수 있으나, 12~24시간 이내에 이미지를 촬영해야 합니다. Plan-Apochromat 20x 0.8 대물렌즈와 633, 488, 543 nm 레이저 라인을 사용하는 공초점 현미경으로 10 µm 동결 절편을 촬영하십시오. Plan-Apochromat 10x 0.4 대물렌즈와 488, 543, 633 nm 레이저 라인을 사용하여 50 µm OCT 임베딩 절편의 1 µm 공초점 Z-섹션을 획득하십시오. Zeiss AIA vision 4.6 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 연속 Z-섹션을 재구성하십시오. 배아 혈관계의 효율적인 라벨링은 배아 생쥐의 혈관 결함을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 도표들은 E16.5 흉선 혈관의 특이적 라벨링과 GS L1 및 I-selectin의 공동 라벨링을 보여줍니다.CD 31을 주입한 B four 배아와 우심실 및 좌심실의 염색 결과입니다. 이 실험들에서는 cryo sections를 위한 GSL one I selectin B four 프로토콜이 사용되었습니다. 이 절차를 따른 E 16.5 마우스 피부 혈관 네트워크의 hole mount 라벨링 결과가 여기에 표시되어 있습니다.혈관과 함께 기질 세포 및 혈액 세포를 공동 라벨링하는 것과 같은 다른 방법들을 사용하여, 정상 및 병리적 조건 모두에서 생쥐 배아의 혈액 세포와 기질 세포가 혈관과 어떻게 상호작용하는가와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

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