Name: NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 평면 패치 클램프 칩을 이용한 신경세포 배양 및 전기생리학 기록 방법입니다. 이 기술은 이온 채널 기능과 신경망 활동을 연구하며 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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저자는 어셈블리와 도움을 패치 - 클램프 CPFC에서 칩, 그리고 색조 트란, 탁구 조 및 마태복음 Shiu의 제조를 위해 알렉세이 Bogdanov을 인정하고 싶습니다. Naweed 셰야드는 보건 연구 (CIHR) 교부금의 캐나다 학회에 의해 지원되었다. 콜린 도르바은 NSERC과 의학 연구 (AHFMR) studentships 대한 알버타 헤리티지 재단의 수상자이다.

1. 칩 제조 3 μm의 두께 셀프 스탠딩 필름, 낮은 1 Mohm 접속 저항과 셀 9 친밀한 인감을 용이하게 매끈한 표면 깔대기 모양의 개구에서 6 결과에 설명된 과정은 그림 2를 참조하십시오. 칩은 지하 채널에 칩을 연결하는 구멍을 마주 조리개와 singulated와 플렉시 글라스 패키지에 접착된다. gluing은 공칭 17 PF에 션트 커패시턴스를 최소화하는 방향으로 적절합니다. 패키지는 두 1.5 밀리미터 직경 및 유체 포트가 6mm 긴 유리 튜브 (그림 3)가 장착되어있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. NRCC 패치 - 클램프 칩의 중심 이온 빔 섹션의 전자 현미경 스캐닝은 부드러운 이산화 규소 표면과 친밀한 세포 연락처를 하시더군요 퍼널 형상, 그리고 낮은 액세스 resistanc위한 차지하고있는 얕은 구멍을 보여줍니다전자. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 3. 칩은 지하 fluidics와 유리 튜브를 들으며 플렉시 글라스 패키지에 문화 유리병의 하단에 붙어있다. 2. 살균, 프라이밍 및 테스트 다음 단계는 조리개의 오염이나 도전을 방지하기 위해 생물 안전 캐비넷에서 수행해야합니다. <ul type="disc"><li> 18 W. 기타 에어 플라즈마 시스템의 최대 전력 15 분 0.1-0.3 mbar 잔류 공기 압력으로 Harrick 기본적인 플라즈마 클리너 (www.harrickplasma.com)에 칩을 소독은 비교 출력 밀도 (24 MW로 사용할 수 있습니다 / cm 3)와 전력 밀도와 시간의 제품이 일정한 유지. 플라즈마 처리는 마중물을 용이하게하는 칩이 친수성 ​​렌더링. </li><li> 멸균 Silastic 연구실 실리콘 튜브, 1mm 아이디 X 2mm OD (콜 Parmer와 유리 튜브를 장착고양이. 한쪽엔 # 96115-08), 3inch, 반대쪽에 1 인치. </li><li> 아무런 거품이 갇혀되지 확인하고, 무균 여과 표준 인산염 완충 용액 (PBS)와 튜브를 통해 fluidics를 채웁니다. </li><li> 한 현금 지급기에서 짧은 측면에서 PBS를 pressurizing 동안 긴 실리콘 튜브를 고정. 조리개를 통해 들어와서 PBS의 수영장 유리병에서 볼 수 있습니다. PBS의 가압 공급을 클립하고 해당 공급 장치에서 짧은 실리콘 튜브를 분리합니다. </li><li> PBS는 주사기를 사용하여 필터링으로 병을 채우십시오. </li><li> 망할 CIA의 짧은 튜브 전극과 유리병에 반대 전극 : 자세 / 자세 젖어. 임피던스 미터 접속 저항이 있는지 확인하는 데 사용됩니다 300kohm 및 3Mohm 및 션트 커패시턴스 10pF 및 25pF 사이 사이입니다. 낮은 저항과 칩 누출이있을 가능성이 있으며, 그것이 세포의 전기 생리학 6 빠른 역학을 캡처하지 않을 수로 높은 용량을 사용하기 위해 부적절하게 간주됩니다. 낮은 커패시턴스와 칩이상의 저항은 그것이 거품이 구멍에 갇혀있는 것을 간단하게있을 수 있지만, 전원 연결로 간주됩니다. 일부 칩은 상반기 이후 다시 테스트 및 올바른 전기 임피던스를 갖고 찾을 수 있습니다. </li><li> 멸균 탈이온수있는 유체 채널을 소독하고, 맨 병을 비우 같은 두 번이나로 린스. </li><li> 멸균 탈이온수 가득 무균 용기에 다른 칩을로드 후 30 분 동안 신선한 멸균 탈이온수의 튜브와 패키지 칩을 젖어. 이 칩은 친수성과 오염으로부터 보호 남아 있도록합니다. </li></ul> 3. 세포 생물 실험실에 칩 준비 다음 단계는 무균 기술을 사용하여 HEPA 여과 층류 후드에서 수행되며,이 절차에서 사용되는 모든 솔루션은 0.22μm 필터를 사용하여 사용하기 전에 소독을 필터링해야합니다. <ul type="disc"><li> HEPA 필터 층류 후드 아래에 칩을 컨테이너를 열고 conta에서 칩을 제거iner 맨 위로 유리병에 가능한 떠다니는 오염 물질을 떠서 피하기 위해 아래로 직면하고 있습니다. </li><li> 칩 표면에서 잔여 부스러기를 제거하는 신선하게 여과 멸균 탈이온수와 칩 2X의 유리병 상단을 씻어. </li><li> 상단 유리병 밖 멸균 탈이온수을 기음. </li><li> 멸균 여과 탈이온수를 포함하는 가압 주사기로 유체 채널에 부착된 silastic 튜브의 한쪽 끝을 연결합니다. 우리의 시스템에서 솔루션으로 가득 주사기는 20psi로 설정된 압축 공기 탱크에 연결하여 가압 수 있습니다. 불임을 보장하기 위해 공기 주사기 입국 이전 (0.22 μm의 필터) 필터링 및 시스템은 필요할 때 우리에게 압력을 중지하거나 적용할 수있는 켜기 / 끄기 밸브를 가지고있다. </li><li> hemostat 이용하여 튜브의 출력 끝을 클램프. </li><li> 솔루션의 기압을에서 / 밸브 오프 엽니다. </li><li> 신선한 멸균 탈이온수로 칩의 subterranen 유체를 헹굴하려면 튜빙의 출력 끝을 unclamp. </li><li> 하기위한조리개를 통해 CE가 물 위로, hemostat로 튜빙의 출력 끝을 클램프. </li><li> 물 배수를 방지하려면 hemostats로 튜빙의 입력 및 출력 끝을 클램프와에 / 밸브 해제 닫습니다. </li><li> 주사기의 튜브의 입력 엔드를 분리합니다. </li><li> 튜브의 양쪽에 유리 플러그를 삽입하고 hemostats를 제거합니다. </li><li> 필터 steriled 탈이온수로 가기 병을 채우십시오. </li><li> 100mm 멸균 요리의 기본으로 35mm 멸균 접시의 뚜껑을 놓으십시오 </li><li> 100mm 접시 덮개와 35mm의 뚜껑 및 덮개 위에 장소 칩. </li><li> 이미지 칩은 칩 막과 조리개는 부스러기 및 / 또는 기포 무료임을 보장합니다. 우리가 실험실에서 우리가 직립 현미경과 20x 긴 작동 거리 목표를 사용합니다. </li><li> 잔해 및 / 또는 공기 방울이있는 경우, 반복적으로 유체 채널과 최고의 병을 플러시. 잔해 및 / 또는 공기 거품이 제거되지 않을 경우 칩은 삭제됩니다. </li><li> 칩은 일단군데, 층류 후드로 돌아가서 튜브의 양쪽을 뽑습니다. </li><li> 생리 미디어를 포함하는 가압 주사기에 튜브의 한쪽 끝을 연결합니다. </li><li> hemostat로 튜빙의 출력 끝을 고정 </li><li> 압력 밸브를 열고 fluidics의 출력 끝에서 hemostat를 제거하고 생리적 매체와 유체 채널을 플러시 </li><li> 생리적 매체와 지하 유체를 헹굴하려면에서 / 밸브 오프 열고 튜브의 출력 끝에서 hemostat를 제거합니다. </li><li> 조리개를 통해 생리 미디어를 강제하려면 hemostat로 튜빙의 출력 끝을 클램프. </li><li> hemostat로 튜브의 입력 끝을 고정하고에 / 밸브 해제 닫습니다. </li><li> glas 플러그와 튜브의 양쪽 주사기 및 플러그에서 튜빙의 입력 끝을 제거합니다. </li><li> hemostats를 제거합니다. </li><li> 상단 유리병에서 물을 제거합니다. </li><li> 필터 멸균 생리 미디어 맨 병을 채우십시오. </li><li>100mm 배양 접시에 칩 돌려 놓으십시오. </li><li> 100 밀리미터 그릇에 35 밀리미터 접시의 기반을 놓고와 습도를 풍부하게하기 위해 필터 소독 탈이온수로 채운다. </li><li> 그것이 도금 시간까지 요리를 커버 </li></ul> 4. 달팽이 뉴런의 세포 도금 패치 - 클램프 칩은 준비 다양한 적합 있습니다. 현재 포유류의 기본 피질 뉴런으로 우리 칩을 테스트하고 있으며 살균 프로토콜 적합함을 나타냅니다하며 칩은 장기적인 문화에 세포 독성 않다는 것을 십사일 7 일 동안 배양해 세포와 예비 결과를 획득했습니다. 그들의 연결을 전기 생리학 11을 공부하는 간단하지만 잘 창업 모델을 대표하고, 우리가 날짜를 10 ~ 가장 중요한 결과를 얻은 것으로 그 세포로하기 때문에이 프로토콜의 목적, 달팽이 뉴런이 선정되었습니다. 상세 전지 격리와 문화 절차도이전에 12, 13을 설명되었습니다. <ul type="disc"><li> 10 % Listerine를 포함 Lymnaea 염분의 무딘 포셉 및 마취 동물 2-3개월 오래된 Lymnaea의 stagnalis에서 바깥쪽을 제거합니다. 모든 후속 단계는 실온에서 소독을 해부 장비 및 솔루션 판상 공기 후드 내에서 무균 수행했습니다. </li><li> Eppendorf 피펫을 사용하여 적절한 녹화 솔루션 fluidics의 생리 미디어를 교체합니다. Lymnaea의 뉴런의 경우 솔루션이 포함되어 있습니다 (㎜에서) : 50 KCl, 5 MgCl 2, 5 ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic 산 (EGTA) 및 5 4 - (2 - 히드록시 에틸)-1-piperazineethanesulfonic 산성 (HEPES, pH는 7.4 ; 130 mOsm) 14 </li><li> Lymnaea 식염수로 가득 Sylgard 그릇에 달팽이를 핀과 이전 13 설명된대로 전체 뇌를 제거 </li><li> isolat을 치료15 분 동안 DM와 트립신 억제제의 치료 (시그마, 콩, 카탈로그 # T-9003)에 의해 다음 18분위한 트립신 효소와 정의 미디어 에드 두뇌 (DM) (0.2 % 솔루션, 시그마, 카탈로그 # T-9201). </li><li> (-; 20 ML DM으로 1M 포도당 용액 750 μL 포도당이 추가로 DM HODM) 미디어를 정의 높은 osmolarity 가득한 작은 Sylgard 요리로 머리 핀. </li><li> 미세 포셉 및 해부 가위 사용하여 뉴런을 노출, 관심있는 신경의 바깥쪽과 안쪽 껍질을 제거하십시오. </li><li> 신경 세포는 두뇌에서 분리하고 피펫으로 정지 때까지 관심 (왼쪽 페달의 지느러미 1) 세포 가까운 부드러운 흡입을 적용 HODM 가득한과 microsyringe에 부착된 화재 광택 유리 피펫을 사용하여. </li><li> 유리 피펫 그런 다음 이사 microsyringe에서 부드러운 퇴학는 뉴런이 부드럽게 피펫에서 밀쳐 및 칩에 대한 개별 패치 구멍 위에 놓여 수 있습니다 개별 neurochips로 감소된다.</li><li> 세포가 조리개를 둘러싼 칩 표면에 그들의 부착을 촉진하기 위해 상온에서 2 시간의 최소한 그대로 앉아 허용합니다. </li></ul> 5. Electrophysiological 녹음 (우리의 경우 Multiclamp 700B 증폭기, 분자 디바이스, 포스터 시티, CA, 미국) 앰프 칩을를 연결하려면 <ul type="disc"><li> 지하 유체와 적절한 녹음 솔루션과 칩 유리병의 솔루션을 교체합니다. Lymnaea의 뉴런의 경우, 상위 문화 실이 (㎜보기 : 51.3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCl2 및 MgCl2 1.5) Lymnaea 식염수 가득은 HEPES와 산도 7.9로 버퍼링된 14. </li><li> 안정성 들어, 접착제 유리 슬라이드를 향해 칩 및 현미경으로 그것을 놓으십시오. </li><li> 앰프 (우리의 경우 Multiclamp 700B 증폭기, 분자 디바이스, 포스터 시티, CA, 미국)에 칩을 연결하려면 튜브의 한쪽 끝을 잘라 silve를 삽입R 와이어있는가 머리 단계에 연결되어 있습니다. </li><li> 칩 상단 유리병의 기준 전극을 배치합니다. </li><li> 칩은 이제 레코딩을위한 준비가되었습니다. </li><li> ; 전체 셀 (RT는 = 50-100 MΩ 플러스 용량성 과도, 지표 (R t&gt; 1 GΩ) 셀 - 첨부 : 총 저항을 측정 (R T)와 뉴런의 구성을 결정하기 위해 앰프와 5 MV 단계를 적용 아니오로 밀봉 (MΩ R T &lt;5), 멤브레인 조리개여 파열)의. 실험 10 마지막 세트에서, 세포의 58% %의 높은 저항 바다표범을했고, 그 때문에 세포의 80 %가 고르기가 응답을 보여주었다. </li></ul> 6. 대표 결과 <ul type="disc"><li> 신경 세포 (이 경우 LPeD1)로 전류 펄스를 (20 PA 증가) depolarizing 적용합니다. </li><li> 그 휴식 잠재적으로 VM 가까운 (- 60 MV ~)에서 신경 세포를 잡아. </li><li> 이러한 depolarizing 펄스에 반응을 관찰. Overshooting 작업 잠재력해야신경 세포가 가능한 경우에는 관찰한다. </li><li> 그림 4는 14, 15 년 세부에서 설명하는 대표적인 결과를 보여줍니다. </li></ul><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 세포내 전류 펄스 (아래)의 등급 시리즈 LPeD1 신경 세포의 그림 4. 전압 응답 (상단). 60mV - 전류 펄스는 VM =에 적용되었다. 문제 해결 <ul type="disc"><li> 막과 조리개 조각이 자유롭고 도금에 적합한 경우에 도금하기 전에 이미지 칩은 결정합니다. 우리는 직립 현미경과 20x 긴 작동 거리 목표를 사용합니다. 실험 1의 마지막 세트에서 칩을 67 % %가 성공적으로 그 방식으로 끝났다되었다. </li><li> 잔해 및 / 또는 기포가 있으면 칩을를 버리고 다른 하나를 시도해보십시오. </li><li> 각종 표면 처리 (혈장) 또는 코팅은 (PDL, PEI 등) 재판을받을 수 있지만 성공은 세포 유형에 따라 크게 의존있을 수 있습니다사용됩니다. </li><li> 기가 - 도장과 전체 세포의 형성에 중요의 유체 ( "피펫") 솔루션의 구성. osmolarity, 산도, 그리고 이온 메이크업에 신경을 쓰는, 솔루션을 조정합니다. </li><li> 장기 문화, 부드러운 중력 수사관 재관류 (~ 0.5 ML / 분)을 통해 녹음하기 전에 솔루션을 피펫로 전환 후, microfluidic 채널의 미디어와 함께 시작합니다. </li></ul>

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

NRCC의 패치 - 클램프 칩 심문 플랫폼은 높은 정보량 제약 assays를위한 잠재적으로 강력한 도구이며, 질병의 체외 모델에서 조사를. 유리 pipettes에 비해 그것의 장점은 대형 세포를 알아내기 위해 장점은 낮은 접속 저항이며, 약간 더 큰 정전 용량에도 불구하고 작은 세포에 대한 비교 역학집니다. 개구 물개의 자연 세포는 정기적으로 취득했으며, 전체 셀 항목은 자발적인 14 것으로 관찰되었습니다. 칩 및 유리 피펫 방법 사이의 명확한 차이는 프로브는 세포 배양 접시의 일부이며 수동으로 세포막과 접촉 가져되지 않는다는 사실입니다. Culturing 세포, 기능적 네트워크의 가능성이 일부 질병 모델로서보다 생물학적으로 관련성이 높은 모델 결과와 바다표범 16을 알아내기 위해 높은 셀 보안을위한 다른 메커니즘. 그러나, 세포 현탁액과 대조적으로 흡인 cannoT는 프로브의 셀을 배치하는 데 사용됩니다. 달팽이 뉴런은 다른 대형 세포로 프로브의 꼭대기에서 수동 위치 결정 의무가 있습니다. 에서 세포의 이상 문화 시간을 필요로하는 작은 세포 들어, 우리는 어떠한 조작에 대한 필요성을 obviated와 프로브 위에 세포를 배치하는 프로브 위에 patterning의 유착 polypeptides에 의해 도장을 얻기의 높은 확률을 유지하고, 증명 배치 프로브 17,18. NRCC 또한 유리 피펫의 비교 용량으로 microfluidic 패치 - 클램프 칩 19 polyimide 개발하고있다. 그 프로젝트의 궁극적인 목적은 허용 개별 이온 채널 14 해상도에서 네트워크 행동에 종사하는 여러 뉴런의 electrophysiological 활동의 동시 모니터링.에게 여러 프로브 패치 - 클램프 칩입니다 이 방법은 다중 전극 배열 20 ~ 고해상도 보완적인 방법입니다.

nrcc 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 culturing 및 전기 생리학

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

그 섬세한 감성과 이온 채널의 레벨에서 각각의 세포를 모니터하고 제어할 수있는 능력으로 인해, 패치 - 고정은 전기 생리학의 황금 표준 모두 한 질병 모델과 제약 화면에 적용됩니다. 방법은 전통적으로 부드럽게 그 정점이 아래 멤브레인의 패치를 분리하기 위해 생리적 용액으로 채워진 유리 피펫으로 세포에 문의하는 것입니다. 피펫에 삽입 전극은 전체 세포를 위해 파열 멤브레인 패치하거나 내에서 이온 채널의 활동을 캡처합니다. 지난 10 년, 패치 - 클램프 칩은 대안 3, 4로 제안되었습니다 정지 필름 배지에서 생리 매체를 분리하고, 영화 microfabricated 조리개는 피펫의 꼭대기를 대체합니다. 패치 - 클램프 칩은 자동화 시스템에 통합과 높은 처리량 검사 5 상용화되었습니다. incr하기처리량을 완화, 그들은 휴대 프로브 바다표범를 검색하고 전체 세포 모드로 들어가는 유체 정지에서 세포의 전달, 흡입에 의한 조리개에서 자신의 위치, 그리고 자동화된 루틴을 포함합니다. 우리는 최적화된 임피던스와 교양 달팽이 뉴런의 행동 잠재력 6 고품질 녹음을 허용하는 오리피스 형태로 실리콘 패치 - 클램프 칩의 제조에보고에 따르면, 최근에, 우리는 또한 포유류의 뉴런에게 7 심문으로 진행 상황을보고했습니다. 저희 패치 - 클램프 칩은 캐나다 Photonics 제작 센터 8, 상용 공장에 가공, 대형 시리즈에서 사용할 수 있습니다. 우리는 서로 다른 모델 NRCC 기술의 사용을 확인할 electrophysiologists와 협력에 종사하는 열망입니다. 칩은 그림 1에 나타나 일반적인 방식에 따라 사용됩니다 : 실리콘 칩은 플렉시 글라스 문화 유리병와 조리개의 뒷면 하단의 것은 지하 chann에 연결되어엘은 패키지의 양쪽 끝에 튜브가 장착되어. 전지는 유리병에 배양해되며 프로브 위에 세포는 유체 포트가 세포에 최소한의 방해와 솔루션 교류를 촉진 밖 channel.The 두​​ 삽입 측정 전극에 의해 모니터링되고,이 세포 내 용 유리 pipettes에 비해 장점이다 재관류. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. NRCC 패치 - 클램프 칩을 사용하여 측정의 원리 여기서 우리는 세부 소독 및 주요 칩, 세포와 매체, 판 그들과 함께 그들을로드하고, 마지막으로 electrophysiological 음반들을 위해 사용하는 프로토콜.

우리는 세포와 도금 매체로 읽어 좋았 냐고 물어 봤어, 캐나다의 국립 연구 협의회 소독하고,,,,에서 가공 및 electrophysiological 녹음에 사용하는 방법 평면 패치 - 클램프 칩 보여줍니다.

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

패치 클램핑(patch-clamping)은 매우 정밀한 민감도와 이온 채널 수준에서 개별 세포를 모니터링하고 제어할 수 있는 능력 덕분에 금본위제(gold standard)로...

다음 실험의 전반적인 목적은 평면 패치 클램프 칩을 통해 배양된 세포의 전기생리학적 활성을 기록하는 것입니다. 이는 패치 클램프 칩을 멸균, 프라이밍 및 테스트하여 세포 배양을 가능하게 하고, 이후 전기생리학적 활성을 모니터링함으로써 달성됩니다. 테스트를 마친 칩은 세포 생물학 실험실에서 다시 프라이밍할 때까지 보관할 수 있습니다.다음 단계로, 사지와 꼬리에서 뉴런을 추출하여 칩 위에 배양합니다. 마지막으로, 세포의 전기생리학적 활성을 모니터링하기 위해 칩을 패치 클램프 증폭기에 연결합니다. 기존의 평면 패치 클램프 칩과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 배양된 뉴런에 사용하기 적합하여, 신경망 내에서 시냅스로 소통하는 뉴런들의 상호작용을 분석할 수 있다는 점입니다.본 방법과 접근 방식은 정상 및 병리적 조건 모두에서 신경망 내에 포함된 흥분성 세포의 이온 채널 기능을 더 잘 이해할 수 있게 해줄 것입니다. 이 방법의 함의는 약리학 분야로 확장되어, 이온 채널 및 수용체 단백질에 대해 중간 처리량의 고정보 함유량 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용될 수 있습니다. 본 연구에서는 쉽게 배치하고 배양할 수 있는 달팽이 신경세포를 사용하여 이 방법을 입증하기로 하였습니다.또한, 이러한 뉴런들은 배양 시 네트워크를 재형성하므로 변형 연구를 위한 훌륭한 모델이 됩니다. 더 중요한 점은, 이러한 칩들이 심장 세포나 암 세포와 같은 다른 세포 시스템에도 사용될 수 있다는 것입니다. 평면 패치 클램프 칩 사용 시의 주요 과제는 깨끗한 개구부를 가진 칩을 확보하고, 세포를 도말 및 배양하는 것입니다.연결되지 않은 칩은 비효율적이므로, 모든 칩은 사용 전 테스트를 거칩니다. 전기생리학적 평가에서 가장 중요한 지점은 세포 배양이 완료된 후입니다. 이는 세포막과 칩 상단 두 개의 림(rim) 사이에 기가씰(giga seal)을 형성하는 단계입니다.제작된 모든 planar 패치 클램프 칩은 현탁액 상태의 분리된 세포를 사용하며, 흡입력을 이용해 세포를 구멍으로 끌어당겨 기가실(giga seal)을 형성합니다. GigE 형성 과정이 당사의 칩을 사용하면 자발적으로 일어납니다.뉴런이 배양 중이며 흡입 과정에 의존하지 않는 동안, 칩 멸균 및 스크리닝 단계를 시연하겠습니다. Tanya가 세포 생물학 실험실에서의 로딩 과정을 설명하고, Colin이 세포 준비 및 플레이팅 과정을 보여줄 것입니다. 마지막으로 Marcia가 기록 측정 방법을 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 0.1에서 0.3 millibars의 잔류 공기압 조건에서 최대 전력 18 watts로 15분 동안 헤릭 기본 플라즈마 세척기(heric basic plasma cleaner)를 사용하여 칩을 멸균하십시오.플라즈마 처리는 칩을 친수성으로 만들어 프라이밍을 용이하게 합니다. 다음으로, 한쪽 끝은 3인치, 다른 쪽 끝은 1인치 길이의 멸균된 cel elastic 실험실용 실리콘 튜브를 유리관에 장착합니다. 그 다음, 기포가 생기지 않도록 주의하며 튜브를 멸균된 표준 인산 완충액으로 채웁니다.PBS를 짧은 쪽 끝에서 1 atm으로 가압하는 동안 긴 실리콘 튜브를 집게로 집습니다. 그런 다음 유체 채널 내의 압력을 해제합니다. 이후 주사기를 사용하여 바이알을 PBS로 채웁니다.은/염화은 전극을 바이알에 담그고, 상대 전극을 짧은 튜브에 넣습니다. 임피던스 측정기를 사용하여 접속 저항이 300 kilo ohms에서 3 mega ohms 사이이며, 션트 커패시턴스가 10 pico ferriday에서 25 pico ferriday 사이인지 확인합니다. 다음으로, 유체 채널을 멸균 탈이온수로 세척합니다.상단 바이알을 비우고 헹굼 과정을 두 번 반복합니다. 이어서 튜브가 포함된 칩 패키지를 신선한 멸균 탈이온수에 30분 동안 담가둡니다. 그런 다음 멸균 탈이온수로 채워진 멸균 용기에 다른 칩들을 넣습니다.이는 칩이 친수성 상태를 유지하고 오염으로부터 보호되도록 합니다. HEPA 필터가 장착된 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 칩 컨테이너를 열고, 수면에 떠 있는 포장 잔해로 인한 오염을 방지하기 위해 상단 바이알이 아래를 향하도록 하여 칩을 꺼냅니다. 칩 표면의 잔류 잔해를 제거하려면 상단 바이알을 여과된 멸균 탈이온수로 두 번 헹굽니다. 유체 채널에 연결된 탄성 튜브의 한쪽 끝을 멸균 여과된 탈이온수가 담긴 가압 시린지에 연결합니다.본 시스템에서는 주사기 내의 물이 1기압으로 설정된 압축 공기 탱크에 의해 가압되며, 주사기로 진입하기 전 공기가 여과되어 무균 상태가 유지되도록 합니다. 또한, 이 시스템에는 필요 시 압력을 조절할 수 있는 두 개의 온-오프 밸브가 장착되어 있습니다. 지혈鉗(hemostat)를 사용하여 유체 경로의 출력단을 고정하십시오.다음으로, 압축 공기 탱크 밸브를 열어 용액에 압력을 가합니다. 그런 다음 유체 경로 출력단에 있는 지혈겸자를 열어 칩 내부를 신선한 멸균 탈이온수로 세척합니다. 유체 경로의 출력단을 지혈겸자로 집어 물이 구멍을 통해 위로 강제로 밀려 올라가게 합니다.배수되는 것을 방지하기 위해 헤모스탯으로 유체 입력부를 고정하고 온-오프 밸브를 닫습니다. 그런 다음 튜빙의 입력단 부분을 시린지에서 분리하십시오. 튜빙의 양끝을 막고 헤모스탯을 제거합니다.상단 바이알을 여과된 멸균 탈이온수로 채웁니다. 다음으로, 35 mm 멸균 디쉬의 뚜껑을 100 mm 멸균 디쉬의 바닥 위에 놓습니다. 이어서, 35 mm 뚜껑 위에 칩을 올리고 100 mm 디쉬 뚜껑으로 덮습니다.칩의 막과 구멍에 이물질이나 공기 방울이 없는지 확인하기 위해 칩을 이미징합니다. 이물질이나 공기 방울이 발견될 경우, 유체 채널과 상단 바이알을 멸균수로 반복해서 세척합니다.이물질이나 기포를 제거할 수 없는 경우 해당 칩은 폐기합니다. 칩의 이미지 촬영이 완료되면 칩을 다시 층류 후드로 가져옵니다. 튜브 양 끝의 연결부를 분리합니다.생리적 배지가 들어 있는 가압 시린지에 튜브의 한쪽 끝을 연결하고, 지혈鉗子(hemostat)로 튜브의 출력단 끝을 고정하여 지하 유체 경로를 생리적 배지로 세척합니다. 온-오프 밸브를 열고 튜브 출력단 끝에서 지혈鉗子를 제거하여 생리적 배지가 개구부를 통해 강제로 올라가게 한 다음, 지혈鉗子로 튜브의 출력단 끝과 입력단 끝을 각각 고정하고 온-오프 밸브를 닫습니다. 그다음, 시린지에서 튜브의 입력단 끝을 분리하고 튜브의 양 끝을 유리 플러그로 막습니다.그 다음 지혈鉗子(hemostats)를 제거합니다. 이어서 상단 바이알에서 물을 제거합니다. 상단 바이알을 여과 멸균된 배지로 채웁니다.칩을 다시 100 millimeter 배양 접시에 넣습니다. 그 후, 35 millimeter 배양 접시의 바닥 부분을 100 millimeter 배양 접시에 넣고 습도를 높이기 위해 여과된 멸균 탈이온수를 채웁니다. 그런 다음 플레이팅 전까지 접시를 덮어 둡니다.이 절차를 시작하려면 무딘 포셉을 사용하여 2~3개월 된 li sags의 외각을 제거합니다. 그런 다음 층류 후드 내에서 10% Listerine이 포함된 limba saline으로 동물을 마취시킵니다. 달팽이를 limba saline이 채워진 셀 가드 디쉬에 고정하고 뇌 전체를 제거합니다.다음으로, 분리된 뇌를 정해진 배지에서 트립신 효소로 18분 동안 처리합니다. 그 후, 정해진 배지와 트립신 억제제를 사용하여 처리합니다. 미세 핀셋과 해부 가위를 사용하여, 고삼투압 정해진 배지가 채워진 작은 셀 가드 디시에 뇌를 15분 동안 고정합니다.관심 대상인 신경절의 외초와 내초를 제거하여 뉴런을 노출시킵니다. 다음으로, 고삼투압 정의 배지가 채워진 화염 연마 유리 피펫을 마이크로 시린지에 연결하고, 대상 세포 근처에서 뉴런이 뇌에서 분리되어 피펫 내에 부유할 때까지 조심스럽게 흡입합니다. 뉴로 칩의 유체 시스템 내 배지를 적절한 기록 용액으로 교체한 후, 유리 피펫을 배양 바이알에 기울여 칩의 개구부 위에 뉴런을 조심스럽게 노출시킵니다.세포가 구멍 주변의 칩 표면에 잘 부착될 수 있도록 실온에서 최소 2시간 동안 그대로 둡니다. 안정성을 위해 배양 접시의 용액을 적절한 기록용 용액으로 교체합니다. 칩을 유리 슬라이드에 접착하고 현미경 아래에 놓아 칩을 증폭기에 연결합니다.튜브의 긴 끝부분을 자르고 헤드 스테이지에 연결된 은선을 삽입합니다. 다음으로 참조 전극을 칩 배양 접시에 배치합니다. 이제 칩에서 기록할 준비가 되었습니다.여기 단계별 세포 내 전류 펄스 시리즈에 대한 좌측 페달 등쪽 1번 뉴런의 전압 반응 예시가 제시되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 평면 패치 클램프 칩을 사용하여 배양 세포의 전기생리학적 활성을 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 첫 번째 단계에서 우리는 세포를 도말하는 데 사용되지 않은 부분의 Ture biology 사용자 칩에 막힘이 없는지 확인하기 위해 칩을 스크리닝한다는 점을 기억하십시오. 일반적으로 로딩 단계부터 시작하며, 매 배치마다 여전히 몇 개의 막힌 칩이 발견되곤 합니다.이 새로운 방법은 in vitro 신경망을 전례 없는 수준의 해상도로 분석할 수 있는 저렴한 기술을 개발하는 데 있어 중요한 돌파구를 마련했습니다. 이 기술은 치료 표적 식별, 약물 개발 및 진단 평가를 위한 고급 분석법으로 이어질 수 있습니다. 이 기술의 추가적인 발전은 보건 연구자들이 신경계 질환이나 장애에 대한 새로운 치료법을 탐구할 수 있는 새로운 수단을 제공할 것입니다.그 잠재력은 심장 세포, 암, 그리고 전기 발생 특성이나 그와 유사한 성질을 가진 다른 세포들로 확장됩니다.

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연구

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NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

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