Name: 선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 Target ID 라이브러리를 활용한 miRNA 표적 유전자 전체 스크리닝 방법입니다. 안정적인 세포주 확립과 감시클로비어 선택을 통해 microRNA 상호작용을 분석하고 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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우리는 그녀의 지원과 결실 문제 해결 논의에 참여하기 위해 전체 시그마 생명 과학 미션 대상 아이디 라이브러리 개발팀, 특히 기술을 발견하고 라이센스 조항을 협상에 대한 케빈 Gutshall 및 헤더 Holemon 감사드립니다. 우리는 또한 자유롭게 그것이 복제지고에 큰 cDNA의 배치와 그의 지속성을 준비를 위해 게시되지 않은 결과 제안 및 RxBiosciences의 Qazi 하미드을 공유 킹스 칼리지 런던의 박사 줍 Gäken 감사드립니다. 우리는 cDNA 배열과 데이터 분석을 수행하기 위해 SAFC에서 할머니 린 스콧 Bahr을 인정하고 싶습니다. 목표는 시그마 - 올드 리치 생명 공학 LP의 등록 상표입니다

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

저자는 제출한 작품에 관심을 가지고 상업적 주체와 재정 관계를 선언합니다.

microRNAs는 억제 mRNA의 번역에 의해 사후 transcriptionally 유전자 발현을 조절하고, 자주, 타겟 mRNA를 ([6]에서 검토) 약화 20-24 염기 RNAs 있습니다. 단일 miRNA는 개발과 환경 신호에 대한 세포의 반응을 제어하기 위해 수백 mRNAs을 조절할 수 있습니다. 식별 및 대상 mRNAs을 확인하면 해당 경로에서 miRNA의 역할과 기능을 결정하는 것이 필수적입니다. 동물에 miRNAs과 타겟 사이트가 완전히 보완하지 않습니다, 때문에, 표적 식별은 간단하지 않습니다. &quot;종자&quot;지역, miRNA의 5&#39; 엔드에서 7을 통해 2 기준으로, 보통의 목표를 보완합니다. 그러나 거기에 씨앗 규칙에 여러 예외이며,베이스 - 페어링 하류는 불완전한 씨앗 경기 보정할 수 있습니다. 컴퓨터 알고리즘의 숫자는 종자 매칭 및 다운 스트림 보상, 대상 구조를 기반 miRNA 목표를 예측하기 위해 개발되었습니다D 위치, 순서 보존, 그리고 실험적으로 검증 대상 ([7]에서 검토)에 대한 관찰되어 여러 가지 다른 매개 변수. 예측이 편리하고 식별 많은 유효 miRNA 목표를 silico에있는 동안 대부분의 유전자는 실험적인 검증 테스트에 실패, 많은 실제 대상이 예측되지 않는 예측했다. 컴퓨터 알고리즘은 이전에 결정된 목표 기능을 기반으로하고 있기 때문에 또한, 그들은 이미 잘 알려져 있습니다 무엇 이탈 표적의 발견을 허용하지 않습니다. 실험 시스템의 숫자는 살아있는 세포의 기능적인 miRNA 목표를 식별하거나 발견하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 글로벌 심사 방법은 microarrays와 RNA 시퀀싱, RNA 공동 immunoprecipitation (RIP) 및 세포 배양에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨링 (SILAC), proteomic 방법 ([7]에서 검토)가 있습니다. 각 방법은 장점과 단점이 있습니다. 타겟팅 miRNA는 종종 mRNA를 destabilizes과 열화, 분실 O로 연결하기 때문에miRNA는 각각 모방하거나 억제제를 도입 후 mRN​​A 수준에서 R 게인은 miRNA 목표를 식별할 수 있습니다. mRNA의이 손실이나 이득은 쉽게 microarray 또는 크게 시퀀싱에 의해 감지된다. mRNA 검출 방법은 간단하고 단백질 검출 방법보다 더 민감한 반면, mRNA 탐지가 타락되지 않은 miRNA 목표를 놓칠 것이다. SILAC에서 이들과 함께 RNA 검출에서 miRNA 목표 결과를 비교 Bartell 연구소의 최근 보고서 [8] 또는 ribosome 파일링 [9] 포유 동물 miRNAs는 주로 타겟 mRNA 수준을 줄임으로써 행동을 나타냅니다. 그러나 개별 miRNA 목표와 협력 많은 다른 연구진이 단백질의 변화하지만 mRNA 수준에는 변화를 감지했습니다. 노 감지 mRNA의 손실과 translational 규제하는 것으로 보이는 보고서는 다음과 같습니다 미르-10B HOXD10에 [10] p27kip1에서 miR221/222 [11] Pd​​cd4에서 미르-21 [12] 미르-126 p85β에 [13] , SIRT1의 미르-34 [14] PTEN [15] 미르-302d Arid4b에 [16] 미르-200c JAG1에 [17], 그리고 미르-299, 297, 567,에, 미르-21VEGFA에 ND 609 [18]. 또한, 클랜 외 [19] 최근 가주-7 대상 사이트를 포함하는 각각의 mRNA의 isoforms이 선택적으로 발견되었을 때 가주-7에 의해 translational 규제에만 발견되었다고 보도했다. 모든 mRNA의 isoforms 하나의 mRNA로 감지되면 그것은, -로 - 많은 microarray 및 시퀀스 분석으로 얻은 후자는 최소한 어떤 경우에는, translational 규제가​​ 복합 프로파일에 간과할 수있다,하는 것이 좋습니다. argonaute (보통 ago2) 또는 다른 관련된 단백질 (RNA immunoprecipitation, 또는 RIP)를 통해 miRNA-mRNA의 단지의 공동 immunoprecipitation에 관계없이 규제 메커니즘의 miRNA 목표를 분리합니다. 또한, RIP는 상호 작용을 내생, 그리고 아마도 생물학적으로 관련성이 감지합니다. 그러나, 그것은 모든 miRNA-mRNA의 상호 작용 기능이며, RIP 만 transiently 연결하거나 급속하게 저하에있다는 mRNA 목표를 놓칠 것인 지 알 수 없습니다. 또한, 특정 miRNA-mRNA 파트너는 bioinformati에게 유추되어야합니다모든 miRNA-mRNA 쌍 함께 공동 시켰던 캘리 때문입니다. 마지막으로, SILAC 직접 miRNA 조절, 단백질 자체의 최종 제품을 식별하지만, 구별이므로 희귀 단백질 및 단백질 수준의 작은 배 변화를 그리워합니다. 현재 miRNA 목표 식별 방법과 한계에 비추어, 우리는 다른 메커니즘에 의해 기능적인 miRNA 목표를 식별하기위한 추가적인 글로벌 분석이 필요했다 느꼈다. 이러한 필요성을 충족하기 위해 줍 Gaken와 킹스 칼리지 런던의 Azim Mohamedali에 의해 발명 기술을 허가. 그들의 발명은 이중 선택 융합 단백질이며, 특히, thymidine 키나제-zeocin 융합, 그 3&#39;UTR의 잠재적인 miRNA 목표 시퀀스의 cDNA 라이브러리에 의해 규제. 그림 2에서 그림과 같이 안정적으로 TKzeo-cDNA 구조와 함께 표현 transfected 세포는 zeocin으로 선택할 수 있습니다. 관심 miRNA을 표현하면, 그 miRNA의 목표 이래 선택할 수 있습니다일 ganciclovir와 같은 그림 3 그림. Ganciclovir는 모든 세포의 관심 miRNA에 대한 목표를 부족한 TKzeo-cDNA 표출하는 thymidine의 키나제를 표현하는 세포를 죽이는. 타겟 cDNA는 측면 cDNA와 PCR 제품은 목표를 식별하기 위해 순서가 수 ganciclovir 사용 primers를 생존 세포에서 DNA의 PCR 증폭에 의해 격리 수 있습니다. 선교 대상 아이디 도서관 - 저희 기능성 인간 miRNA 목표의 글로벌 식별 및 검색을위한 새로운 도구에 국왕의 대학 기술을 개발했습니다. 대상 아이디 라이브러리를 통해 사용자는 포유 동물 세포 배양 transfection과 약물 선택 일련의 단계에 의해 miRNA 목표를 분리할 수 있습니다. 도서관은 포괄적이며, 인간 유전자의 66-79%가 포함되어 있습니다. 초기 결과는 모두 이전에 발견뿐만 아니라 새로운 목표는 선교 대상 ID를 도서관에서 격리 수 있음을 나타냅니다. 프로토콜은 몇 가지 길이 있지만포유 동물 세포 배양, transfection, 약물 선택, PCR 및 시퀀싱 - - 타겟 ID 라이브러리의 사용은 표준 분자 실험 기법을 필요로하므로, 대부분의 생물학 자의 수단 내에서 잘해야합니다. 우리는 충분한주의가 문화 환경을 최적화, 적절한 실험 설계에 납부하고, 가장 중요한 목표 아이디 라이브러리 성공을 보장하는 선택 단계 (죽이기-커브)에 대한 최적의 약물 수준을 결정하기 위해 각각의 새로운 세포 유형을 미리 테스트하는 것이 좋습니다. 모든 miRNA 목표 식별 방법과 마찬가지로, 그것은 높은 대상 아이디 도서관을 분석해 식별 대상이 같은 microarray, qRT-PCR, 기자 분석 (즉, 루시페라제) 또는 서양 분석과 같은 두 번째 방법과 함께 확인하는 것이 좋습니다.

<table border="1" ><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Jumpstart를 REDTaq ReadyMix </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> 포유류의 게놈 DNA를 Miniprep 키트 GenElute </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 특정 Nucleofection의 K그것 </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> 대상 ID를 도서관 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 mirna 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

대상 아이디 라이브러리는 microRNA의 발견 및 식별 (miRNA) 목표를 지원하도록 설계되었습니다. 대상 아이디 도서관은 이중 선택 융합 단백질, thymidine 키나제-zeocin (TKzeo)에서 3&#39;UTR의 하류에 복제된 플라스미드 기반의 게놈 전체 cDNA 라이브러리입니다. 선택의 첫 번째 라운드는 안정 transformants에 대한 관심이 miRNA의 도입에 따라, 그리고 마지막으로, miRNA의 목표를 포함하는 cDNAs을위한 선택입니다. 선택된 cDNAs은 시퀀싱 (대상 아이디 라이브러리 워크플로우 및 자세한 내용은 그림 1-3 참조)에 의해 식별됩니다. 인간의 transcriptome의 광범위한 적용 범위를 보장하기 위해 대상 ID가 도서관 cDNAs은 여러 사람의 조직 및 세포 라인에서 준비한 총 RNA의 수영장을 사용하여 oligo-DT의 마중물을 통해 생성되었습니다. 1.2 킬로바이트의 평균 크기, 0.5에서 4 KB로 cDNA 범위를 결과 및 (플라스미드지도 그림 4 참조) p3TKzeo 이중 선택 플라스미드로 복제되었다. 리로 표현 유전자 표적brary는 시그마 - 올드 리치 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다. Illumina 시퀀싱 (표 3)의 결과가 도서관 UCSC RefGene에서 21,518 고유한 유전자 16,922 (79 %), 또는 10 또는 읽습 이상 (66 %)로 14,000의 유전자를 포함 것을 보여줍니다.

대상 아이디 라이브러리 miRNA 목표를 식별하는 데 사용 복제된 cDNA의 플라스미드 기반의 게놈 전체 모음입니다. 여기는 이용 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

Target ID Library는 마이크로RNA(miRNA) 표적의 발견 및 식별을 돕기 위해 설계되었습니다. Target ID Library는 플라스미드 기반의...

다음 실험의 전반적인 목표는 target ID 라이브러리를 사용하여 마이크로 RNA 표적에 대한 고처리량 전장 유전체 스크리닝을 수행하는 것입니다. 이는 라이브러리 플라스미드를 세포에 형질전환함으로써 달성됩니다. 클로닝된 cDNA의 전장 유전체 컬렉션을 형질전환한 후, 안정적 세포주를 선택하는 과정을 거칩니다.그 다음, 구축된 라이브러리 세포에 micro RNA 발현 컨스트럭트를 형질전환하여 micro RNA 표적과 thymidine kinase가 공동 발현되도록 합니다. 이 시점에서 ganciclovir를 사용하여 thymidine kinase 발현 세포를 제거함으로써 특정 micro RNA 표적을 발현하는 세포를 선택합니다. 이후 micro RNA 표적 부위를 포함하는 CD NA를 표적 ID 증폭 프라이머로 PCR 증폭하여 micro RNA 라이브러리 표적을 시퀀싱하고 확인합니다.최종적으로, 심층 시퀀싱 분석을 기반으로 세포 내 특정 micro RNA 표적을 식별하는 결과를 얻습니다. 미션 표적 ID 라이브러리는 micro RNA의 유전자 표적 발견 및 식별을 돕기 위해 설계되었습니다. 여기서는 해당 라이브러리의 사용법과 응용 방법을 설명합니다.본 프로토콜을 시작하기 전에, 관심 있는 IRA를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포주를 선택하여 배양하고, 80% 합류도(confluency)에서 약 2×10⁷개의 세포를 얻을 때까지 증식시킵니다. 트립신 처리 후, 세포를 15 mL 멸균 스크류 캡 튜브로 옮겨 200×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 배지를 제거한 후 세포 펠릿을 재현탁하여 세척하고, 다시 원심분리하며, 이 세척 과정을 두 번째로 반복합니다.그동안 각 튜브에 2 µg의 표적 ID 라이브러리를 첨가하여 형질전환 횟수에 맞춰 충분한 양의 0.5 mL 튜브를 준비합니다. 이제 형질전환 1회당 600 µL의 maxim Nucle affection solution을 사용하여 15 mL 튜브 내의 세포 펠렛을 재현탁합니다. 이때 반응은 한 번에 하나씩 진행합니다.알리쿼트에 100 µL의 세포와 2 µg의 플라스미드를 넣고 피펫 팁으로 혼합합니다. 각 혼합물을 핵 효과기 cuvette에 옮깁니다. cuvette 하나를 핵 효과기 기기에 삽입하고 해당 세포주에 적합하게 최적화된 프로그램을 실행합니다.다음으로, 미리 데워둔 배지를 트랜스퍼 피펫에 채웁니다. 동일한 피펫으로 형질전환된 세포를 흡입하여 이전에 준비한 6-well 플레이트의 단일 웰에 옮깁니다. NU 핵 처리(NU nuclear affection)에 따라 각 NU 핵 처리에 대해 이 과정을 반복합니다.세포를 배양실로 옮겨 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 배지를 교체하고 세포가 3~5일 동안 회복되도록 둡니다. 세포가 회복되면 배지를 제거하고, TKZO 융합 단백질의 안정적인 통합 및 발현을 선택하기 위해 적절한 수준의 eosin이 포함된 완전 배지를 추가합니다.에오신 농도는 본문에 기술된 대로 사전에 결정할 수 있습니다. 세포 생존율을 통해 에오신 선택 과정 중의 세포 상태를 모니터링하십시오. 2~3일마다 배지를 새로운 에오신 함유 배지로 교체하십시오.6-웰 플레이트에서 세포가 합류되면, 세포를 계대 배양하여 더 큰 플라스크로 확장합니다. 연구에 사용되는 선택 시약의 최소 치사량을 설정하기 위해 킬 커브(kill curve) 분석을 수행합니다. 원치 않는 표현형 반응을 방지하기 위해, 킬 커브를 수행하기 전날 먼저 120 µL의 신선한 배지가 담긴 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포를 분주합니다.선택된 웰에 약물을 첨가합니다. miRNA 발현 컨스트럭트의 통합을 선택하기 위해 항생제 G 418 또는 puromycin을 사용하며, thymidine kinase 발현을 억제하기 위해 acyclovir를 사용합니다. 배양 기간 동안 이틀마다 각 약물 농도별 세포 생존력을 확인합니다. 선택 시약이 포함된 배지는 3일마다 교체합니다.약물 농도가 결정된 후, 해당 세포 유형 및 실험에 대해 원하는 시간 후에 완전한 세포 사멸을 유도하는 선택 시약의 최소 농도를 사용해야 합니다. 2 × 10⁷개의 세포를 확보할 수 있도록 표적 ID 라이브러리 세포를 배양 및 확장하여 MI transfection을 준비하십시오. 세포의 합류도(confluency)가 80% 이상일 때 trypsin 처리하십시오.세포를 15 mL 멸균 스크류 캡 튜브로 옮기고 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 배지를 제거하고 이전과 같이 세포 펠렛을 두 번 세척합니다. 다음으로, 각 형질전환을 위해 0.5 mL 튜브에 2 µg의 MIRA 발현 플라스미드를 추가합니다.표적 ID 라이브러리 전이에 사용된 것과 동일한 방법으로 라이브러리 세포에 mRNA의 NU 핵 도입을 수행합니다. 세포를 3~5일 동안 회복시킨 후, 킬 커브(kill curve) 테스트에서 결정된 적절한 농도의 항생제가 포함된 완전 배지로 교체합니다.항생제 선택을 위해 세포를 모니터링하며, 2~3일마다 항생제가 포함된 배지로 교체하십시오. 6-웰 플레이트에서 세포가 합류(confluent)되면, 풀(pool)을 계대 배양하여 더 큰 플라스크로 세포를 확장하십시오. 이전과 마찬가지로, 적절한 농도의 GCV와 항생제가 포함된 신선한 배지로 교체하십시오.세포 생존율을 통해 thymidine kinase 발현 및 mRNA 발현을 모니터링하고, GCV와 항생제가 존재하는 환경에서 생존한 세포를 배양합니다. 다음으로, GCV로 선택된 세포로부터 genomic DNA를 준비합니다. 키트 프라이머를 사용하여 선택된 라이브러리 인서트를 PCR로 증폭시키고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 서브클로닝합니다.그 후 증폭 프라이머를 사용하여 시퀀싱 반응을 수행할 수 있습니다. 마지막 단계로, 알려진 전사체는 인간 전사체와, 새로운 전사체는 인간 게놈과의 blast 정렬을 통해 표적 유전자를 식별합니다. mere 3 73 발현 컨스트럭트를 MC seven 라이브러리에 안정적으로 형질전환하고, ganciclovir 함유 배지에서 선택하여 mere 3 73 표적을 발현하는 세포를 농축하였습니다.GCV는 라이브러리가 없는 MCF seven 세포에서는 thymidine kinase를 발현하지 않으므로 아무런 영향을 미치지 않습니다. 반면, C seven 라이브러리 세포는 thymidine kinase를 발현하지만, brilliant blue를 흡수하는 살아있는 세포들에서 나타나듯 8 또는 16 µM의 ganciclovir 처리 시 완전히 사멸하지는 않습니다. 하지만 배지 내 phenol red 염료의 색상으로 확인되는 바와 같이, 라이브러리 세포는 GCV 존재 하에서 성장이 정지됩니다.정지된 세포들은 배지를 산성화하지 않으며 색상은 붉은색으로 유지됩니다. 오렌지색으로 변하는 대신, 생존한 세포로부터 노란색 표적 서열을 분리하였습니다. PCR로 증폭한 후 서열을 분석하였습니다.약 12,000개의 고유 유전자에 매핑되는 약 1,200 million 건의 cDNA 리드를 얻었습니다. 이러한 고유 유전자 중 234개는 히트 빈도에 따라 신뢰할 수 있는 히트로 간주되었으며, mere 3 73에 특이적이었습니다. 초기 비교 결과, 타겟 ID 라이브러리로 확인된 고유 유전자 중 10개가 TarBase에서 이전에 확인된 mere 3 73 타겟 목록에도 포함되어 있음을 발견했습니다.따라서, 이 10가지 후보는 mere 3 73의 유효한 표적일 가능성이 높으며, 현재 선택된 히트(hit)들을 실험적으로 검증하기 위해 특성 분석을 진행하고 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 mission target ID 라이브러리를 사용하여 마이크로 RNA 유전자 표적에 대한 고효율 전장 유전체 스크리닝을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

여기에서는 1) 알려진 miRNA와 새로운 miRNA를 보다 정확하게 식별할 수 있고 2) 완전히 자동화되어 자유롭게 사용할 수 있는 새롭고 완전히 자동화된 miRNA 파이프라인인 mirMachine을 제시합니다. 이제 사용자는 간단한 제출 스크립트를 실행하여 완전히 자동화된 mirMachine 파이프라인을 실행할 수 있습니다.

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악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

학습하세요 Target ID 라이브러리를 활용한 miRNA 표적 유전자 전체 스크리닝 방법입니다. 안정적인 세포주 확립과 감시클로비어 선택을 통해 microRNA 상호작용을 분석하고 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

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