Name: CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases(ZFNs)를 활용한 정밀 게놈 편집 방법입니다. 이 기술은 특정 유전자 좌위에 파괴적 돌연변이를 도입하여 녹아웃 세포주를 생성하며, 다양한 세포계에서 높은 편집 효율성을 제공합니다.

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1. 사용자 정의 ZFN 디자인 프로세스 <ol><li> ZFN 설계 과정을 신속히 진행하기 위해 탐정을 제공한다 : </li><ul><li> 이러한 유전자 이름, 종 및 유전자 주석 / 식별 번호로 대상 유전자에 관한 정보. </li><li> 실험 명확하게 명시 이상 - 모든 목적 (예 : 마네 또는 쫓고) </li><li> 비정형 유전자 구조, 유전자 현장에 연루 특별 생물학, 또는 다른 게놈의 모든 동종 지역을 포함한 유전자 표적의 특정 요소. </li><li> 아연 손가락 DNA 시퀀스의 특정 범위를 대상으로 nucleases. </li></ul><li> 시그마 생물 정보학 팀은 초기 아연 손가락 타겟 사이트를 개발하기 위해 silico ZFN 설계에서 수행하고있다. </li><li> 초기 ZFN 대상 사이트는 ZFN 과학 기술 컨설턴트로 제공됩니다. 더 기술적으로 복잡한 프로젝트의 경우이 시그마 과학자는 프로젝트 전략을 수립하기 위해 수사관과 함께 작동합니다. </li><li silico zfn snp><li> 생물 정보학 검토를 위해 탐정으로 가기 ZFN 대상 사이트를 제공합니다. 잠재적인 ZFN 대상 사이트의 승인되면이 정보는 ZFN 제조 과정을 시작하려면 ZFN 생산 팀에 제공됩니다. </li></ol> 2. 사용자 정의 ZFN 생산 <ol><li> 아연 손가락 모듈의 시그마 아카이브는 승인된 ZFN 디자인을 조립하는 데 사용됩니다. </li><li> 각 ZFN 디자인은 조립 순서는 높은 처리량 복제 플랫폼에 확인됩니다. </li><li> 모든 ZFN 디자인 생산은 모든 ZFN을 완료하면이 유효성 검사로 전송됩니다. </li></ol> 3. 사용자 정의 ZFNs의 유효성 검사 <ol><li> 의 ZFN 프로젝트인간, 마우스, 쥐 또는 CHO 수종은 각 종족에 대한 잘 특징인 세포 라인에서 검증되고, 효모 기반의 분석은 다른 유기체 또는 세포 유형에 사용됩니다. </li><li> ZFN 구조는 nucleofection하여 적절한 세포주에 전달되고 ZFNs가 표현됩니다. </li><li> DNA가 ZFN transfected 세포 수영장에서 수확과 관심의 영역은 PCR 증폭입니다. </li><li> Cel-1 검정 그러면 PCR 제품에 실시됩니다. 젤 전기 영동은 확인 ZFN 활동에 Cel-1 검정에서 실행됩니다. </li><li> Cel-1 분석으로 확인 등의 높은 활동 ZFN 설계 그런 다음 고객에게 제공됩니다. ZFNs는 긍정적인 컨트롤로 Cel-1 분석 및 게놈 DNA에 대한 PCR의 primers와 함께 mRNA와 플라스미드 DNA에 전달됩니다. </li></ol> 4. Nucleofection에서 유효성을 검사할 ZFNs의 납품 <ol><li> 2x10 5 셀 / ML nucleofection 전날의 밀도의 씨앗 세포를. </li><li> nucleofection의 날,셀 라인 Nucleofector 키트 V를 꺼내 실온으로 따뜻하게하자. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 Nucleofection 솔루션 V로 보충을 추가합니다. </li><li> 세포를 세어보세요. 세포 밀도는 2.5-5x10 5 셀 / ML 사이 여야합니다. </li><li> 이전 nucleofection에 최소한 20 분 동안 37 ° C에서 CO 2 배양기에서 각 잘하고 미리 따뜻한 관련 매체의 2ml와 6 잘 접시를 채우십시오. </li><li> 5 분 200xg에 transfection 회 2x10 6 셀 (8x10과 총)을 원심 분리기. </li><li> 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 20 ML로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 실험 튜브를 준비 : (정의 ZFN 기술 게시판에서 테이블을 참조) </li><li> 인큐베이터에서 단계 (6.5)에서 미디어를 포함한 6 잘 플레이트를 제거합니다. </li><li> Nucleofection 솔루션 400 μl (100 μl / 반응)에 세포를 Resuspend V. </li><li> 한 번에 한 반응은, 각각의 DNA 또는 mRNA 함유 튜브에 세포를 100 μl를 추가합니다. Transf해당 프로그램 Nucleofector에 2mm electroporation cuvette 및 nucleofect에 요기 혼합물. </li><li> 즉시 각 시료의 nucleofection 후, cuvette에 단계에서 6 잘 플레이트 (6.9)에서 prewarmed 매체 ~ 500 μl를 추가할 전송 피펫을 사용합니다. 다음 6 잘 판에 남아있는 prewarmed 매체로 cuvette의 세포는 신중을 전송. </li><li> 모든 반응을 종료하고 37 ° C.에 CO 2 배양기로 6 잘 플레이트를 반환 </li></ol> 5. ZFNs의 납품 후 게놈 DNA를 수확 <ol><li> 6 - 잘 판 - 풀링된 세포를 모두 수확하지 않습니다. 그것은 당신이 Cel-1 소화 제품이 있는지 확인 후 단세포 희석 클론의 세포를 위해서는 문화를 유지하는 것이 중요합니다. 한 ~ 3 일 nucleofection 후 GenElute 포유류의 게놈의 DNA Miniprep 키트를 사용하여 염색체 DNA를 준비하는 세포를 수집합니다. </li></ol> 6. Cel-1 검정 <li> PCR은 제공된 primers를 사용하여 ZFN transfected 샘플 키트에 제공된 긍정적인 제어 게놈의 DNA에서 게놈 DNA를 증폭. (사용자 정의 ZFN 기술 게시판의 테이블 참조) : PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 설정되었습니다. </li><li> PCR의 homoduplexes에서 heteroduplexes를 생성하기 위해서는 각 ZFN 취급 샘플 플러스 컨트롤에서 PCR 반응의 10 μl를 타고 thermocycler에서 다음 프로그램을 사용 : 95 ° C 10 분 95 ° C 85 ° C, -2 ° C / 초 85 ° C 25 ° C, -0.1 ° C / 초 4 ° C, 무기한으로 </li><li> 42에서 각각의 반응과 부화 ° C ~ 20~40분위한에 향상제 1 μl와 Nuclease S 1 μl를 (Transgenomic 카탈로그 번호 706025에서) 추가합니다. </li><li> 이러한 DirectLoad WideRange의 DNA 사다리 (카탈로그 번호 D7058)와 같은 적절한 마커 (정의 ZFN 기술 게시판에 결과를 볼 수)에 10 % PAGE-TBE 겔에 dig​​estions를 실행합니다. </li><li> 에CE 긍정적인 신호가 cel-I 분석하여 ZFN - 처리 인구에서 발견되었습니다, clonal 분리 및 특성을 참조하십시오. </li> 7. Clonal 분리 및 특성화 <ol><li> FACS 및 희석 복제를 포함하여 표준 방법에 의한 단일 세포 클론이 ZFN - 대우 샘플. </li><li> 클론들이 줄지어 늘어 놓다 소재로 나머지를 다시 냉동, 게놈 DNA의 수확을 위해 세포의 일부 비율을 분할 후, 충분히 확장하도록 허용합니다. </li><li> Cel-I primers를 사용하여 클론으로부터 게놈 DNA를 증폭하고 Cel-I 분석 (에서 마약을 WT DNA를 가진 사람과없는)의 amplicon을 분석하거나, 또는 genotyping에 직접 진행하는이 amplicon을 사용합니다. </li><li> 유전자형 후보 클론 선호하는 방법으로 편집한 대립 유전자가있는 것으로 밝혀졌습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 전체 CompoZr ZFN 워크플로우의 예제는 그림 2에 표시됩니다. ZFNs이 전달됩니다그들은 이중 좌초된 휴식 (DSB)를 만들어 적절한 DNA 시퀀스를 바인딩하고 분열 세포 있습니다. 자연 복구 프로세스가 아닌 동종 (NHEJ) 수리에게 DSB 입사 종료. 삭제, 삽입 또는 세포핵의 치환에서 일부 인스턴스 탈선 NHEJ 결과. 변성 / PCR 반응의 어닐링 단계 이후 야생의 종류와 수정된 amplicons 사이 heteroduplex 형성에 수확 게놈 DNA 검사 결과의 PCR 증폭. 어떤 heteroduplex 분자의 절단에 Cel-1 효소 결과의 추가. Cel-1 결과는 ZFN 절단을 확인하기 위해 페이지 분석에 의해 해결된다. 그림 3은 Cel-1 분석 및 예상되는 결과의 도식을 제공합니다. 대표 Cel-1 결과는 그림 4와 5에 포함된 그림 4는 K562 세포에서 ZFNs 매우 적극적인 쌍 (21 %)의 결과가 포함되어 있습니다;. 그림 5에서 ZFNs의 덜 적극적인 쌍 (2.4 %)의 결과를 포함을K562 세포. ZFN 활동이 부모 PCR 조각 밑에 두 PCR 파편의 존재에 의해 두 수치로 확인된다. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 1 그림. 바운드 아연 손가락 nucleases의 표현. ZFNs는 FokI 제한 endonuclease의 절단 도메인 융합의 DNA 결합 도메인 아연 손가락으로 구성된 단백질을 꾀하고있다. heterodimer로 바인딩되면 ZFNs는 사용자가 특정의 DNA 시퀀스에서 더블 좌초된 휴식을 만듭니다. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 사용자 정의 ZFN 서비스 워크플로의 개략도. CompoZr의 ZFNs를 사용하여 유전자 변형 세포 라인을 생성하는 작업 흐름의 그래픽 표현. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. Cel-1 분석 및 결과의 개략도.) ZFN 플라스미드 O R이 mRNA는 세포에 전달됩니다. B) ZFNs의 바인딩을 표현하고 세포의 일부에서 더블 좌초된 휴식 (DSB)를 만드는 그들의 목표 시퀀스를 했네요. C) 이외의 동종에 의해 일부 DSBs의 탈선 수리 염기 삽입 또는 삭제의 결과에 합류 종료. D) 게놈의 DNA가 세포 transfected 풀에서 수확과 관심의 현장에서 증폭된다. EF) PCR 제품은 변성이며 야생 유형 및 수정할 amplicons 사이 heteroduplex 형성을 만들고 다시 annealed. 사) heteroduplex 분자의 절단에 Cel-1 불일치 endonuclease 분석 결과. H) Cel-1 효소는 소화가 PAGE에 의해 해결된다. ImageJ 소프트웨어에 의해 결정 비경 밴드를 절단 제품의 관찰된 비율은 분수 인하와 ZFNs의 효율을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 4 그림. 21% 활성 ZFNs에서 Cel-1 결과 ImageJ 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. :_blank "&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 2.4 % 활성 ZFNs에서 Cel-1 결과 ImageJ 소프트웨어에서보실 수 있습니다. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

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</ol>

연구원 표준 연구 라이센스 계약하에 공동으로 ZFN 수정된 세포 또는 동물을 제공할 수 있습니다. 이 상황에서는 시그마는 물질 전달 계약은 시그마, ZFN 고객과 공동 작업자 사이에 위치에 넣어되어 있는지 묻습니다. : 연구 라이센스에서 볼 수 있습니다 <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . ZFN 수정된 세포 시그마를 사용하여 상업용 응용 프로그램에 대한 가능성이있다면 상업용 라이선스가 제자리에 넣어되어 있는지 묻습니다. 이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스가 시그마 주식 회사가 후원합니다

일단 ZFN으로 수정한 세포들은 영구가와 DNA를 변형 물려 전할 수있는 격리됩니다. 연구를 원하는 유전 수정을 안정적으로 수정된 세포 라인이나 번식 동물을 생성하는 능력이 발생합니다. CompoZr 맞춤 ZFNs가 게놈이 세포 유형의 다양한 편집을위한 강력한 방법을 제공합니다. ZFNs의 편집 성공적인 게놈의 간행물을 작성하는 기능을 포함하지만, 인간의 세포 라인, 마우스, 쥐, zebrafish, 개구리, 돼지의 및 CHO 연구 모델에 국한되지 않습니다. 3,4,5,6,7,8,9 ZFNs가 제대로 셀로 전송되면 특정 세포 유형에서 원하는 대상 사이트에서 이중 좌초된 휴식이 보장됩니다. 그것은 세포 내에서 하나 이상의 유전자 조작을하기 위해 감방으로 연속 아연 손가락 수정을 수행할 수도 있습니다. 10 특정 대상 순서를 선택하고 해당 특정 현장이 여러 개를 만들 수있는 능력에 대한 주요 원인이 수정할 수있는 능력 modifi양이온. 분석의 CompoZr 정의 ZFN 인증서 따라서 키트의 모든 구성 요소가 철저하게 고객의 성공을위한 검증되었다는 확보 키트에 제공된 매우 시약으로 생성됩니다. 처음부터 끝까지 흐름의 중요한 단계는 아래에 제공됩니다 : 세포 클로닝 주어진 세포주를 분리하고 확장하는 능력은 어떤 ZFN 실험을 시작하기 전에 테스트해야합니다. 단일 세포 분리 clonally 파생 인구가 가능하도록 확장되어야합니다. 일부 세포 라인이 문제에 고집 불통이며, 그러한 시설이 미디어에서 편집한 클론을위한 농축이나 문화와 같은 트릭은 이러한 도전을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 배달 효율 전송 효율의 최적화 ZFNs 배달하기 전에해야합니다. 많은 방법은 지질 기반 transfection, electroporation, 그리고 nucleofecti 포함하여 사용할 수 있습니다에. 이상적인 전달 방법은 배달 효율성과 세포 생존의 가장 최적의 조화를 affords 하나 구성되어 있습니다. 이러한 효율성을 Quantitating 것은 육안 검사 또는 FACS 24-48 이후의 전달에 의한 GFP 컨트롤이 플라스미드와 quantitating 제공함으로써 추정 수 있습니다. Cel-I 분석 그것은 Cel-I 분석은 PCR, 소화하고, 전기 영동 매개 변수 ZFN 실험의 해석을 방해하지 않도록 적절한 컨트롤로 병렬로 수행되는 것이 필수적입니다. 각 키트는 분석 증명서에 Cel-I 이미지를 만드는 데 사용되는 컨트롤 게놈 DNA를 포함하고 있습니다. Cel-I 분석 다음에 제공 primers와 제어 DNA의 증폭은 사용자가 분석 증명서 (CofA) 이미지에서 제공 그걸로 결과를 비교할 수 있도록하고, 실험의 측면에서 잠재적인 비효율을 분리할 것이다. 이러한 모의하거나, GFP 등 적절한 제외어 제어는 세포를 치료샘플도 아닌 특정 절단 제품의 해설을 허용하기 위해 포함되어야합니다. 단일 세포 클론의 정량 / 정성 분석 ZFN 처리와 단일 세포 복제 후 세포의 인구는 방법을 번호별로 관심이 현장에서 편집 상영됩니다. Cel-I 분석은 더욱 genotyping을위한 후보 클론을 식별하기위한 목적으로 클론으로부터 게놈 DNA를 실시 수 있습니다. 수행하기 전에 그것은 1:1의 비율로 샘플 amplicons에 스파이크 WT PCR의 amplicon에 중요 Cel - 전 homozygous 돌연변이 클론은 균일한 분자를 포함하므로 소화, 따라서 부정적인 Cel - 전 분석 결과를 전달. 이 후보 클론을 분석해위한 다른 방법은 직접 ZFN 대상 사이트에 한쪽 PCR 프라이머의 방문을 설계하는 것입니다. 제어 primers 중 하나와 함께 사용, 부정적인 분석 결과는 WT 시퀀스의 손실을 나타냅니다. 적어도 하나의 WT allele를 포함하는 heterozygous 클론이 Y됩니다ield PCR 신호지만,이 SYBR qPCR의 맥락에서 PCR을 수행하여 완벽하게 WT 클론에서 인종 차별을 수 있습니다. 후보 클론은 위의 방법으로 확인되었습니다되면, 그들은 표준 pyrosequencing 깊은 시퀀싱 또는 기타 시퀀싱 방법으로 genotyped 수 있습니다. 모든 시퀀싱 방법은 clonal 게놈의 DNA에서 생성된 amplicon이 생성되어야합니다. 전통 pyrosequencing의 대립 유전자의 경우는 TA - 복제 PCR 제품으로 인종 차별, 그리고 개별 식민지를 시퀀싱 수 있습니다. 이러한 깊은이 단계를 순서와 같은 방식의 경우 필요하지 않습니다. 상동 감독 수리 (HDR) 이 프로토콜은 NHEJ 통해 ZFN 매개 유전자 녹아웃을위한 방법을 제공합니다. transgenes의 통합도 측면은 ZFN 인하 사이트 11.이 시나리오에서는이 ZFN 두 번 좌초된 휴식은 HDR 대신 NHEJ에 의해 수리되어 만든 상동의 팔을 가진 플라스미드 기증자의 도입에 의해 실시됩니다. HDR 내가 감독transgenes의 ntegration이 프로토콜에 걸쳐 제공되는 절차와 비슷한 방법을 사용하여 확인할 수 있습니다. 문제 해결 ZFNs의 납품 ZFN 전달 및 표현 배달은 GFP 또는 기타 시각화 및 / 또는 quantitation를위한 플라스미드 등.의 전달에 의해 제어할 수 있습니다 관심 세포 유형 모터 비호환으로 인해 낮은 표현은 m​​RNA 형식 ZFNs의 전달에 의해 극복할 수있다. 또한 차가운 충격 메소드는 더 이상 세포의 ZFNs의 효능을 높이기 위해 활용됩니다. 12 mRNA를 사용하는 경우 그것이 세포가 모든 혈청 파생 Rnases가 제거되었을 수 있도록 인도하기 전에 세차하는 필수적입니다. 그것은 얼음의 mRNA를 해동하고, 열화에 대한 가능성을 최소화하기 위해 매우 마지막 순간에 세포에 그것을 추가하는 것도 신중한입니다. Cel-I 분석 Cel-I assa의 기초y는 관심있는 현장의 구체적이고 충분한 증폭이다. 불특정 증폭 제품이 관찰하는 경우에는 이러한 템플릿 금액의 최적화, 프라이머 농도, 그리고 사이클링 매개 변수로 특이성을 높이기 위해 표준 PCR 문제 해결 절차를 사용하십시오. 후자의 방법은 적절한 해상도와 감도를 제공하지 않으므로 표준 아가로 오스 전기 영동 반대로 페이지 분석을 수행합니다. 더 소화 제품이나 과도한 번짐가 관찰되지 않을 경우 Cel-I 다이제스트 조건도 최적화할 수 있습니다. Cel-1 nuclease 및 / 또는 소화 시간의 길이 금액의 적정 이러한 측면을 개선하기 위해 titrated 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Nuclease S (Cel-1 효소) </td><td> Transgenomic </td><td> 706,025 </td></tr><tr><td> 하이 피델리티 PCR System을 확장 </td><td> 로슈 </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> 셀 라인 Nucleofector 키트 V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP 내독소 - 무료 플라스미드 Maxiprep 키트 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

compozr 맞춤 아연 손가락 nucleases와 게놈 편집 (zfns)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

게놈 편집 유전자 기능과 질병의 유전적 기초를 명료하게하다하는 데 사용할 수있는 강력한 기술입니다. 이러한 DNA 시퀀스의 화학 기반의 돌연변이 유발 또는 임의의 통합과 같은 방법을 수정하는 전통적인 유전자는 전체 비효율적인 방법으로 무차별 유전자 변화를 부여하고 바람직하지 합성 시퀀스의 결합을 필요로하거나 잠재적으로 생물학 연구를 혼동하고, 탈선 문화 조건을 사용하지 않습니다. 반대로 세포에서 일시적 ZFN 표현은 정확한 촉진 수있는 합성 transgenes의 화학 물질이나 통합 관리를위한 필요없이 고효율 방식으로 유전자 편집을 물려 전할 수있는. 아연 손가락 nucleases (ZFNs)는 이중 좌초된 DNA (dsDNA)의 서로 다른 시퀀스를 바인딩하고 절단 효소입니다. 기능성 CompoZr ZFN 유닛은 약 15-18 세포핵의 DNA를 &quot;반 사이트를 &#39;바인딩이 개별 monomeric 단백질 (그림 1 참조)으로 구성되어 있습니다. 둘이 언제 ZFN 모노DNA-절단 도메인 dimerize과 DNA의 이중 가닥 브레이크 (DSB). 게놈의 ZFN - 중재 DSBs 1 소개 고효율 게놈 편집을위한 토대를 낳는를 만드는 그들의 인접 타겟 사이트에 mers &quot;홈&quot;. 비 동종 최종 합류 (NHEJ)의 DNA 복구 경로를 통해 세포의 DSBs의 불완전 복구가 작고 삽입 및 삭제 (indels)이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 유전자 녹아웃을 만들 ZFNs의 사용, transgenes의 통합을 설명하는 동안 세포의 유전자 코딩 순서 이내 indels의 창조도를 통해 실시됩니다 frameshift 및 높은 효율의 유전자 현장 2.의 후속 기능 녹아웃이 발생할 수 ZFN 인하 사이트에서 상동 - 감독 수리. CompoZr 정의 ZFN 서비스 ZFN 기술 과학 지역 사회를위한 타겟 유전자 편집으로, 체계적인 종합적이고 및 잘 특성화 접근 방식을 나타냅니다. 시그마 과학자) 1 수사관과 긴밀히 perfo 작동프로젝트의 목표, 2에 따라 관련 유전자의 구조, 생물학, 및 모델 시스템의 분석)를 포함하여 RM 실사 분석 후 설계, 구축하고, 기능적으로 관련에서 활동 ZFNs을 검증) 소리 타겟팅 전략, 3을 개발하기 위해이 지식을 적용 세포주. 조사는 긍정적인 제어 게놈의 DNA와 primers를 받게하고, 플라스미드 DNA를 모두와 인 - 체외 베꼈는데 mRNA 형식으로 제공된 ZFN 시약을 준비 - 사용하기. 이 시약은 다음 탐정의 세포주 또는 선택한 셀 타입에 과도 표현을 위해 제공됩니다. 샘플 그때 PCR 증폭, 효소 다이제스트 및 전기 영동을 포함한 표준 분자 생물학 기법에 의한 관심의 현장에서 유전자 편집 테스트됩니다. 유전자 편집을위한 긍정적인 신호가 초기 인구가 감지되면 세포 복제 단일 셀 및 돌연변이 클론 / 대립 유전자의 식별을 위해 genotyped 있습니다.

CompoZr 정의 아연 핑거 Nuclease (ZFN) 서비스는 사용자가 정의한 모든 현장에서 모든 유기체 또는 세포 라인의 정밀 게놈 수정을 가능하게합니다. 이 문서 CompoZr 정의 ZFN 서비스의 설계, 제조, 검증 및 구현을위한 프로세스를 설명합니다.

CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs)

유전체 편집은 유전자 기능과 질병의 유전적 기반을 규명하는 데 사용할 수 있는 강력한 기술입니다. 기존의 유전자 편집 방법인...

본 절차의 전체적인 목표는 맞춤 설계된 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN)를 사용하여 특정 유전자 자리에 파괴적 돌연변이를 도입함으로써 최종적으로 넉아웃(knockout) 세포주를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 composer 알고리즘을 통해 표적 유전자의 DNA 서열을 분석하여 in silico ZFN 설계를 생성함으로써 수행됩니다. 이후 ZFN을 조립하여 핵 transfection(nuclear transfection) 방식으로 세포에 전달하고, 각 표적 유전자 부위에서의 활성도를 스크리닝하여 넉아웃 세포주를 생성합니다.먼저 관심 있는 세포 유형을 활성 ZFN으로 처리합니다. 그 다음, 이 세포 집단을 단일 세포로 분리합니다. 마지막으로, 이러한 클론 집단을 확장하여 추가적인 유전자형 특성 분석을 수행합니다. 표적 부위에서 비상동 말단 결합(non-homologous end joining)에 의한 파괴적 이벤트가 발생한 클론은 기능적 유전자 넉아웃 관점에서 추가로 연구될 수 있습니다.최종적으로, ZFN 매개 유전자 변형의 결과로 관찰된 세포 표현형의 변화를 확인하기 위해서는 세포 기반 분석 및 DNA 시퀀싱을 포함한 유전적 특성 분석이 필요합니다. 전통적인 상동 재조합과 같은 기존 방법과 비교하여 징크 핑거 뉴클레아제의 주요 장점은 ZFN을 통해 가능해진 유전자 편집으로 연구자가 선택 과정 없이 특이적이고 예측 가능한 유전자 변형을 유도할 수 있다는 점입니다.여기에는 유전자 녹아웃, 유전자 변형 및 유전자 통합이 포함됩니다. ZFN 설계 과정은 단순화된 생물정보학 연구로 시작되며, 이는 유전자 녹아웃을 수행하기에 적합한 충분한 수와 품질의 zinc finger 결합 모티프를 포함하는 고유한 서열 영역을 식별하는 데 집중합니다. 명확하게 정의된 실험 전략은 이 과정을 크게 촉진하며, 비정형 유전자 구조, 유전자 궤적과 관련된 특수한 생물학적 특성, 게놈 내 다른 곳에 존재하는 동종 영역과 같은 표적 유전자에 대한 정보 또한 도움이 됩니다.더욱 복잡한 프로젝트의 경우, sigma 과학자가 연구자와 긴밀히 협력합니다. Z fn은 인 실리코(in silico)로 설계되며, 전장 유전체의 오프 타겟(off-target) 부위가 예측됩니다. 또한 각 잠재적 ZFN 표적 부위에 대해 반복 서열 마스킹 및 스닙(snip) 분석이 수행됩니다.ZFN 제작 전 최적의 ZFN 표적 부위를 검토합니다. 연구자들은 흔히 자신의 프로젝트에 ZFN이 효과적일지 문의합니다. 이 질문에 가장 정확하게 답하기 위해서는 몇 가지 핵심 고려 사항을 검토해야 합니다.관심 있는 세포 유형에 일반적인 발현 카세트를 효율적으로 전달하고 발현시킬 수 있습니까? 단일 세포 클론을 분리하고 이후에 확장 배양할 수 있습니까? 마지막으로, 관심 유전자를 녹아웃(knock-out)한 결과로 세포 성장이나 세포 생존능에 해로운 영향이 있습니까?이러한 질문들에 대한 답변이 프로젝트의 실현 가능성을 엄격하게 결정짓지는 않을 수도 있습니다. 하지만 이를 통해 특정 프로젝트의 난이도를 가늠할 수 있으며, 성공에 결정적인 워크플로우의 특정 측면을 파악할 수 있습니다. Sigma는 승인된 ZFN 설계를 조립하기 위해 아연 집게(zinc finger) 모듈 아카이브를 사용합니다.각 ZFN 설계는 고처리량 클로닝 플랫폼에서 조립되고 서열이 검증됩니다. 그 후, ZF NS가 플라스미드 DNA 형태로 특성이 잘 정의된 해당 세포주에 전달되며, 24~48시간 이내에 충분히 발현됩니다. 그런 다음 ZFN 처리된 각 세포 풀에서 게놈 DNA를 수확하고, 이어서 ZFN 표적 부위를 PCR로 증폭합니다.PCR 산물을 대상으로 셀 원(cell one) 분석을 수행하고, 젤 전기영동을 통해 ZFN 활성을 평가합니다. 가장 활성이 높은 ZFN 디자인이 제공됩니다. 또한, 분석 증명서에 제시된 결과를 재현할 수 있도록 PCR 프라이머와 함께 양성 대조군 게놈 DNA가 제공됩니다.ZFN 실험을 시작하려면, 핵 transfection 전날 세포를 ml당 200,000 cells의 밀도로 분주하십시오. 다음 날 세포 수를 측정합니다. 세포 밀도가 ml당 250,000에서 500,000 cells 사이라면, 제조사의 프로토콜에 따라 사용 중인 세포주에 맞는 핵 transfection 용액 V를 준비하십시오.이제 6-웰 플레이트의 각 웰에 2 mL의 배지를 채우고, 인큐베이터에서 최소 20분 동안 플레이트를 가온합니다. 핵 transfection당 200만 개의 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 10 mL의 HBSS에 조심스럽게 재현탁합니다. 그런 다음 세척 과정을 한두 번 더 반복합니다. mRNA 형태로 전달된 ZFN은 일반적으로 플라스미드 DNA 형태로 전달된 동일한 ZFN보다 더 높은 유전자 편집 효율을 나타냅니다.하지만 ZF NS를 mRNA 형태로 전달하려면 분해를 방지하기 위해 몇 가지 추가 주의 사항이 필요합니다. 먼저, 혈청 유래 RNA를 제거하기 위해 PBS 또는 HBSS를 사용하여 세포를 2~3회 충분히 세척하십시오. 또한, 실험 전 과정 동안 mRNA를 항상 얼음 위에 보관하십시오.마지막으로, mRNA의 분해를 방지하기 위해 가능한 한 가장 마지막 순간에 세포에 mRNA를 첨가하십시오. 다음으로, 맞춤형 ZFN 기술 게시판의 표에 따라 실험 튜브를 준비하십시오. 각 transfection을 위해, 세포를 100 µL의 nuclear affection solution V에 재부유시키십시오. 반응은 한 번에 하나씩 준비합니다.각 DNA 또는 mRNA가 포함된 튜브에 100 µL의 세포를 추가합니다. 그런 다음 각 혼합물을 2 mm 전기천공 큐벳으로 옮깁니다. 각 샘플의 핵전이(nucleofection) 직후에 적절한 프로그램으로 세포에 전기천공을 실시합니다.트랜스퍼 피펫을 사용하여 준비된 6-웰 플레이트의 웰에서 가온된 배지 0.5 mL를 추가합니다. 세포를 qve에서 남은 배지로 조심스럽게 옮깁니다. 해당 웰에서 모든 반응을 완료하고 플레이트를 인큐베이터에 넣은 뒤 1~3일 동안 배양합니다.핵 제거 후, 모든 통합 세포를 수확하지 않고 genal loop mammalian genomic DNA mini prep kit을 사용하여 게놈 DNA를 분리합니다. 다음으로, 제공된 프라이머를 사용하여 ZFN이 형질전환된 시료와 키트에 포함된 양성 대조군 게놈 DNA로부터 게놈 DNA를 PCR 증폭합니다.각 PCR 생성물에 1 µL의 enhancer와 1 µL의 nuclease s를 넣어 소화시킵니다. 이를 42 °C에서 20~40분 동안 배양합니다. 그 후, ZFN 처리된 샘플을 단일 세포 클로닝하고 클론이 충분히 증식하도록 한 다음, direct load wide range DNA ladder와 같은 적절한 마커를 사용하여 10% TBE 겔에서 전기영동을 수행합니다.게놈 DNA 추출을 위해 세포의 일부를 수확하고, 나머지 세포는 계속 배양하거나 보관용 재료로 동결 보관합니다. cell one 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시키고, 야생형 앰플리콘을 1:1 비율로 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 나누어 cell one 분석법으로 생성물을 분석합니다. 또는, 이 앰플리콘을 사용하여 시퀀싱이나 다른 선호되는 방법으로 후보 클론의 유전자형 분석을 직접 진행할 수 있습니다.이 예시에서는 Cell One 어세이를 사용하여 한 쌍의 ZF NS 및 K 5 62 세포의 활성을 추정하였습니다. glan은 양성 대조군을 나타내며, Z 레인은 절단 산물을 보여줍니다. 이 데이터로부터 미스매치된 PCR 단편의 빈도를 추정하였으며, ZF N 활성 추정치는 매우 높은 수치인 21%로 나타났습니다. 여기서는 다른 한 쌍의 Z fns의 활성을 보여줍니다.이 ZFN 쌍은 다른 쌍보다 활성이 현저히 낮았으나 여전히 효과적이었습니다. 세포 집단의 2.4%에서 인델(indel)을 생성한 것으로 추정됩니다. ZF X 작업과 관련된 주요 매개변수 중 일부로는 사용 중인 세포 유형에서의 전달 및 발현 최적화가 포함됩니다.이러한 매개변수들을 최적화함으로써, 유전자 녹아웃(gene knockout)을 분리하는 데 필요한 시간과 노력을 상당히 줄일 수 있습니다. Clone Z fns는 올바른 상황과 적절한 맥락에서 사용될 때 매우 정밀한 표적 게놈 편집 도구가 됩니다. 이는 과학자들에게 거의 모든 유전자 산물이나 경로의 생물학적 특성을 연구할 수 있는 매우 빠르고 효율적인 수단을 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 아연-핑거 뉴클레아제 기반 게놈 편집 기술을 보여줍니다. hPSC는 잠재적으로 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 기술은 환자 맞춤형 방식으로 체외 병리학 및 약리학 연구에 도움이 됩니다.

Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

리포터 세포주 시각화 추적 이종 집단의 관심의 세포를 분리 할 수​​있는 수단을 제공한다. 그러나, 유전자 - 표적 인간 배아 줄기 세포에서 종래의 상동 재조합을 사용하여 매우 비효율적이다. 여기서, 우리는 아연 핑거 클레아 향상된 상동 재조합을 사용하여 EGFP CNS 중뇌 특정 전사 인자 PITX3 궤적 타겟팅 기술한다.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

배우세요 CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases(ZFNs)를 활용한 정밀 게놈 편집 방법입니다. 이 기술은 특정 유전자 좌위에 파괴적 돌연변이를 도입하여 녹아웃 세포주를 생성하며, 다양한 세포계에서 높은 편집 효율성을 제공합니다.

CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs)

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