Name: 전기 펄스 응용 프로그램에는 방향과 전기장의 방향을 변경하면 플라스미드 유전자 전송을 향상 체외에서 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: 배우세요 전기장 방향을 변경한 전기 펄스를 이용한 CHO 세포의 플라스미드 유전자 전송법입니다. 이 방법은 전송 효율을 두 배 향상시키면서도 세포 생존율을 유지하여 유전자 치료 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 슬로베니아어 연구기구 (프로젝트 J2 - 9770, infrastructural 센터 IP - 0510 및 프로그램 P2 - 0249)에 의해 지원되었다. 이 비디오는 &quot;Electroporation 기반 기술 및 트리 트먼트&quot;류블랴나, 슬로베니아 대학 전기 공학부 주최 과학 워크샵 및 대학원 과정에 대한 보충 자료를 나타냅니다. 저자는 친절 플라스미드 DNA를 제공하고 또한 Duša 홋직 감사합니다.

1. 세포 배양, 플라스미드 및 실험을위한 버퍼 준비 <ol><li> 본 실험 중국 햄스터 난소 세포는 (CHO - K1) 사용됩니다. 셀 2 MM L - 글루타민 10 % 태아 소 혈청, 400 μl / L gentamicin (시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, Deisenhofen, 독일에서), 그리고 1 보충 영양 혼합 햄 - F12 (PAA)에 재배 ML / 리터 crystacilin (Pliva, 자그레브, 크로아티아). 전지는 37 24에 대한 보육의 humidified 5 % CO 2 분위기 ° C에 보관됩니다. </li><li> 확대 플라스미드 pEGFP - N1 (Clontech Laboratories의 주식, 마운틴 뷰, CA, 미국) 대장균 DH5α의 변형에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩 및 HiSpeed​​ 플라스미드 맥시 키트 (Qiagen, 힐든, 독일)로 분리. 플라스미드 DNA의 농도는 (TE 버퍼에 용해 플라스미드) spectrophotometrically 260 nm의에서 결정하여 겔 전기 영동으로 확인한다. </li><li> isoosmolar 나트륨 인산 버퍼 (10 MM 나 2 HPO 4, 10 MM 아니 2 PO 4, 1 ㎜ MgCl 2, 250 MM의 자당, 산도 7.4) 준비합니다. </li><li> 실험 당일 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (시그마 - 알드리치 케미 GmbH를, Deisenhofen, 독일)과 trypsinization하여 세포 현탁액을 준비합니다. 4 1,000 RPM (180 XG)에서 5 분 원심 분리기 세포 ° C (시그마, 독일)와 5 세포 밀도 × 10 6 세포 / ML에 isoosmolar 인산 나트륨 버퍼에 resuspend 세포 펠릿. </li></ol> 2. 하드웨어 장비 <ol><li> 전지는 높은 전압 프로토 타입 발전기에 연결된 통합 전극과 피펫 팁의 전기장 (그림 1)에 노출되어 있습니다. 팁 및 전극 기하학은 비교적 균일한 전기장의 응용 프로그램을 허용하고 발전기가 다른 방향으로 전기 펄스의 전달을 허용합니다. 팁 및 발전기는 Biocybernetics의 연구소, 전기 공학부, 류블랴나 1 대학에서 개발되었다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 수직 및 수평 (A) 단면 및 사진 (b)는 통합 전극과 피펫 팁의. 단면 회색 색상의 전극에 대한 플라스틱 하우징 및 검정에 사용됩니다. 통합 전극과 피펫 팁 네 원통형 막대 전극으로 구성되어 있습니다. 전극은 스테인리스 스틸로 만들어진, 자신의 직경은 인접한 전극의 간격 1mm이며, 반대 전극의 간격 2mm 있으며, 1.4 mm이다. 전극은 병렬로 플라스틱 끝에 접착하고 해당 길이는 30mm 2입니다. 3. 진 electrotransfer 프로토콜 <ol><li> 농도 10 μg / ML에 세포 현탁액에 플라스미드 pEGFP - N1을 추가합니다. </li><li> 전기 펄스를 적용하기 전에, 상온에서 2~3분에 대한 혼합물을 품어. </li><li> 통합 전극과 피펫 팁에 세포 현탁액의 바램이 100 μl. </li><li> 최고의 유전자 electrotransfer의 효율을 달성하고 세포 생존을 유지하기 위해 전기 펄스의 최적의 매개 변수를 사용해야합니다. 이 실험에 8 직사각형 펄스 (각 1 Hz에서 반복 주파수 1 MS, 진폭 225 V의 기간과)의 기차는 고전압 프로토 타입 생성기를 사용하여 각 샘플에 적용됩니다. 두 개의 서로 다른 전기장 프로토콜은 (그림 2) 사용 : 두 번째 프로토콜 펄스에서 또는 전기장의 방향과 방향을 변경하여 전달됩니다 반면 첫 번째 프로토콜의 모든 펄스는 같은 방향으로 전달됩니다. 두 번째 프로토콜은 서로 다른 방향으로 전기 펄스의 응용 프로그램을 허용 적절한 펄스 발생기와 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> 펄스 응용 프로그램은 6 자 플레이트에 피펫 팁의 세포를 전송 및 태아 송아지 혈청 (FCS - 시그마, 미국) (샘플 볼륨의 25 %) 추가 직후. </li><li> 37 5 분 세포를 품어 ° C 세포막의 resealing 수 있습니다. </li><li> 물론 6 각 샘플에 햄 - F12 2 ML를 추가하고 인큐베이터에 humidified 5 % CO 2 분위기에서 37 24 시간을위한 세포 ° C를 품어. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> . 그림 2 전기장 프로토콜 : (A) 모든 펄스가 같은 방향으로 전달됩니다은 (B) 펄스가 또는 전기장의 방향과 방향을 변경하여 전달됩니다. 4. 이미지 수집 및 유전자 electrotransfer의 효능의 결정 <ol><li> 유전자 electrotransfer의 효능은 펄스 신청 후 GFP 24 시간을 표현 세포의 비율로 결​​정됩니다. </li><li> 세포는 단색 시스템 (색채 IV, Visitron, 독일)와 배출이 507 nm의에서 감지로 생성된 488 NM에서 여기 광과 (우리의 경우에는 자이스 혈구 200 Axiovert, ZR 독일) 형광 현미경을 사용하여 관찰하고 있습니다. 이미지는 이미징 시스템 (MetaMorph 이미징 시스템, Visitr을 사용하여 기록됩니다에, 독일),하지만, 다른 유사한 수집 소프트웨어도 사용할 수 있습니다. </li><li> 20x 객관적인 확대에 적어도 다섯 이미지 (위상 콘트라스트와 녹색 형광) 취득. </li><li> 위상 콘트라스트 이미지와 녹색 형광 이미지에서 GFP를 표현 아르 세포에서 세포를 계산합니다. 각각의 해당 이미지의 모든 세포의 수를 (그림 3)과 GFP를 표현 아르 세포의 수를 나누어 유전자 electrotransfer의 효험의 백분율을 결정합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/3309/3309fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 모든 펄스가 같은 방향으로 전달되며 펄스가 또는 전기장의 방향을 변경하고 방향을 제시하여 전달됩니다되었을 때 GFP를 표현하는 세포의 비율입니다. 전지는 진폭 225 V, 기간 1 MS 1 Hz의 반복 주파수의 8 펄스의 기차에 노출되었습니다. 결과는 형광 현미경에 의해 취득되었다. 그래프의 각 값은 세 가지 독립적인 실험 ± 표준 편차의 의미를 나타냅니다. 전기장의 방향과 방향 GFP 증가를 표현 세포의 비율을 변경하여.

<ol><li>Rebersek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporator+with+automatic+change+of+electric+field+direction+improves+gene+electrotransfer+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro.</a> Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).</li>
<li>Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip+electrode+chamber+for+small+volume+electroporation%2C+electrofusion%2C+and+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection.</a> 18, (2006).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-841 (1982).</li>
<li>Daud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+trial+of+interleukin-12+plasmid+electroporation+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).</li>
<li>Pavlin, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+conductivity+of+a+suspension+of+permeabilized+cells%3A+a+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis.</a> Biophys J. 85, 719-729 (2003).</li>
<li>Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+mechanisms+of+electric+field-induced+DNA+transfection.+IV.+Effects+of+DNA+topology+on+cell+uptake+and+transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency.</a> Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).</li>
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<li>Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+electrophoresis+in+gene+electrotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of electrophoresis in gene electrotransfer.</a> J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).</li>
<li>Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+electrode+orientation+improves+the+efficacy+of+electrochemotherapy+of+solid+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).</li>
<li>Faurie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-mediated+gene+transfer+and+expression+are+controlled+by+the+life-time+of+DNA%2Fmembrane+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation.</a> J Gene Med. 12, 117-125 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

진 electrotransfer 짧은, 고전압 전기 펄스 3 적용을 통해 세포로 DNA의 전송을 가능하게하고 안전성, 효능 및 응용 프로그램의 용이성으로 인해 바이러스 벡터에 대한 안전한 대안을 대표하는 다양한 생명 공학 기술입니다. 오늘날 유전자 electrotransfer 널리 4보고되었습니다이 방법을 사용하여 셀 및 첫 단계의 모든 종류의 I 임상 시험을 transfect하는 데 사용되지만, 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 그것은 세포에 충분한 강도의 전기 펄스의 응용 프로그램이 막 불안정 5 유도 transmembrane 잠재력에 증가를 일으키는 것을 알려져 있습니다. 세포막의 투과성이 증가하고 그렇지 않으면 nonpermeant 분자는 세포를 입력합니다. 많은 매개 변수는 더 나은 유전자 전송 10-12를 활성화하는 공부했다 유전자 electrotransfer 다른 펄스 파라미터 특히 응용 프로그램의 효능에 영향을 미치는 어...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 햄 - F12 </td><td> PAA </td><td> E15 - 016 </td><td> 문화 매체 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td><td></td></tr><tr><td> gentamicin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G1397 </td><td> 항생 물질 </td></tr><tr><td> crystacilin </td><td> Pliva </td><td> 625110 </td><td> 항생 물질 </td></tr><tr><td> pEGFP - N1 </td><td> Clontech Laboratories의 </td><td> 6085-1 </td><td> 플라스미드 DNA </td></tr><tr><td> HiSpeed​​ 플라스미드 맥시 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 12,662 </td><td></td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td> 머크 </td><td> F640786 933 </td><td></td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 </td><td> TKI Hrastnik </td><td> 0795 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M - 8266 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 16,104 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T4174 </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 팁 </td><td> 사용자가 만든 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전기 펄스 발생기 </td><td> 사용자가 만든 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 웰 플레이트 </td><td> TPP </td><td> 92,406 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML의 원심 분리기 튜브 </td><td> TPP </td><td> 91,015 </td><td></td></tr><tr><td> 75cm 두 문화 술병 </td><td> TPP </td><td> 90,076 </td><td></td></tr></tbody></table>

전기 펄스 응용 프로그램에는 방향과 전기장의 방향을 변경하면 플라스미드 유전자 전송을 향상 체외에서</em

Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro

진 electrotransfer 작은 분자로 그 침투성하고, 세포막의 불안정의 원인이 짧고 강렬한 전기 펄스의 응용 프로그램에 의해 세포에 유전자를 전달하기 위해 사용하는 물리적 방법이고 이러한 DNA와 같은 큰 분자의 전송을 허용합니다. 이것은 안전성, 효능 및 응용 프로그램의 용이성으로 인해 바이러스 벡터에 대한 대안을 나타냅니다. 유전자 electrotransfer에 대해 다른 전기 펄스 프로토콜은 그 중 하나가 펄스 전송 중에 전기장 방향과 방향을 변화, 최대 유전자 transfection을 달성하기 위해 사용됩니다. 전기장 방향과 방향을 변경하면 세포에 DNA 항목에 대한 관할 멤브레인 영역을 향상시킬 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 모든 펄스가 같은 방향으로 전달되며 펄스가 또는 전기장의 방향과 방향을 변경하여 전달하는 경우 유전자 electrotransfer의 효율에 차이를 보여줍니다. 통합 전극과 전기 펄스 응용 프로그램을하는 동안 다른 방향으로 전기장의 변화를 수있는 고전압 프로토 타입 생성기,이 목적 팁 경우, 사용되었습니다. 진 electrotransfer의 효험은 모든 세포의 숫자로 나눈 녹색 형광 단백질을 표현 세포의 숫자와 같은 펄스 신청 후 24 시간 결정됩니다. 결과는 전기 펄스 전송 중에 전기장의 방향이 바뀌면 유전자 transfection이 증가는 것을 보여줍니다.

전기장의 방향이 펄스 응용 프로그램 중에 변경되면 electroporation에 의해 유전자 transfection이 약 두 배 향상이며, 동시에 세포 생존 능력은 영향을받지 않습니다. 유전자 transfection의 증가는 세포로 DNA의 항목에 대해 관할 만들어 막 면적의 증가로 인해 발생할 수 있습니다.

유전자 전기전달(Gene electrotransfer)은 짧고 강한 전기 펄스를 가하여 유전자를 세포 내로 전달하는 물리적 방법으로, 이는 ...을 유발합니다.

유전자 전기천공법은 짧고 강한 전기 펄스를 가하여 유전자를 세포 내로 전달하는 물리적 방법입니다. 성공적인 유전자 전기천공법에는 DNA와 세포막 사이의 복합체 형성, 천공된 막을 통한 DNA의 전이, 세포질에서 핵으로의 DNA 이동, 그리고 유전자 발현의 단계가 포함됩니다. 최대의 유전자 형질전환 효율을 달성하기 위해 다양한 전기 펄스 프로토콜이 사용됩니다.그중 하나는 펄스 전달 중에 전기장 방향을 변경하는 것입니다. 본 영상에서는 모든 펄스를 동일한 방향으로 전달했을 때와 펄스 방향을 변경하여 전달했을 때의 유전자 전극 전달 효율 차이를 보여줍니다. 전기장 방향을 변경하는 실험은 중국 햄스터 난소 세포인 CHOK1을 사용하여 수행되었습니다.다음 단계에 따라, 배양 플라스크에 담긴 세포를 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 실험 당일, 0.25% trips in EDTA 용액이 포함된 트립신으로 세포 현탁액을 준비하고 세포 수를 측정합니다. 4 °C에서 1000 rpm으로 5분간 세포를 원심분리하고, 세포 펠릿을 ISO OSM Miller 인산나트륨 완충액에 재현탁하여 세포 밀도를 5 million cells/mL로 맞춥니다. 그 후 샘플을 적절한 디쉬로 옮깁니다. 세포는 고전압 프로토타입 발생기에 연결된 통합 전극이 내장된 파이펫 팁 내에서 전기장에 노출됩니다.이 전극들은 서로 다른 방향으로 비교적 균일한 전기장을 인가할 수 있게 해줍니다. 팁과 발생기는 전기공학부 바이오사이버네틱스 연구실에서 개발되었습니다. Luana 대학교의 세포 현탁액에 10 µg/mL 농도의 plasmid E-G-F-P-N one을 첨가하십시오.전기 펄스를 가하기 전, 세포와 플라스미드 DNA를 충분히 혼합하고 상온에서 2~3분 동안 배양하십시오. 전극이 통합된 피펫 팁으로 세포 현탁액 100 µL를 흡입하십시오. 본 실험에서는 고전압 프로토타입 발생기를 사용하여 8개의 직사각형 펄스 열을 가하며, 첫 번째 프로토타입에서는 서로 다른 전기장 프로토콜이 사용됩니다.모든 펄스는 동일한 방향으로 전달되는 반면, 두 번째 프로토콜에서는 전기장 방향을 변경하여 펄스를 전달합니다. 두 번째 프로토콜은 서로 다른 방향으로 전기 펄스를 인가할 수 있는 적절한 펄스 발생기가 있을 때만 사용할 수 있습니다. 펄스 인가 직후, 파이펫 팁에서 세포를 6-웰 플레이트로 옮기고 소태아혈청을 추가합니다.샘플 부피의 25%를 37 °C에서 5분 동안 배양합니

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고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

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고전압 전기천공법을 이용한 박테리아의 제조 및 형질전환

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우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

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연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템

플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 형질주입 및 mRNA 핵 박션을 사용하여 인간 세포주에서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 후성유전체 편집 방법을 설명합니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

방법은 생쥐에서 인간의 retinoblastoma 종양을 전파하기 위해 설명되어 있습니다. 종양 세포에 직접 면역 결함 생쥐의 눈을에 주입하고 있습니다. 이차 종양이 성공적으로 직접적으로 인간의 종양과 교양 tumorspheres에서 수확을 모두 세포를 사용하여 설립되었습니다.

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