이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

이 실험 절차의 전반적인 목적은 살아있는 조직 내의 신경세포 하위 집단 또는 개별 신경세포에 대해 칼슘 이미징 실험을 수행하기 위해 생쥐의 RO 비강 기관 또는 VNO의 급성 조직 절편 표본을 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생쥐의 코에서 VNO를 추출한 후, 저온의 A CSF 내에서 해부 현미경을 사용하여 연골 캡슐로부터 미세 해부하여 분리합니다. 그다음, 분리된 VNO를 한천 블록에 수직으로 배치하고 마이크로톰을 사용하여 급성 관상면 조직 절편을 제작함으로써 조직의 무결성을 확인합니다.

공초점 현미경을 통해 면역조직화학 염색 후 몇 개의 절편을 관찰합니다. 다른 절편들에는 칼슘 민감성 염료를 주입한 다음, 추정 페로몬 리간드를 관류시켜 칼슘 이미징을 통해 신경세포 활성화를 관찰합니다. 이 방법은 후각 분야의 핵심적인 문제들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 로모 비강 기관(romo nasal organ)에는 수백 개의 페로몬 수용체가 발현되지만, 그중 리간드가 확인된 수용체는 극소수입니다. 페로몬 수용체는 이종 시스템에서 발현시키기가 매우 어렵습니다. 따라서 특정 페로몬을 특정 수용체에 할당하기 위해 효율적인 in vivo 분석법을 개발할 필요가 있었습니다.

특정 뉴런 하위 집단이 미지의 수용체를 발현하며 GFP 발현을 통해 식별 가능한 tact 마우스를 사용할 수 있습니다. 또한, 이 분석법을 통해 Fairmont 신호 전달 폭포에 관여하는 이온 통로와 효소를 약리학적으로 조사하여 해당 절차를 입증할 수 있습니다. 해부를 시작하기에 앞서, 저희 실험실의 연구원인 Julian과 Fabian 두 분을 소개하겠습니다.

염화칼슘을 제외한 모든 성분을 혼합하여 신선하고 차가운 인공 뇌척수액(A CSF)을 준비합니다. oxy carb를 직접 버블링하여 용액을 포화시킵니다. 그 다음 염화칼슘을 첨가하고 2회 증류수로 희석하여 원하는 부피로 맞춥니다.

A CSF 용액을 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 성체 마우스를 안락사시키고 참수한 후, 차갑고 지속적으로 산소화 및 탄산화된 A CSF가 담긴 페트리 접시를 준비합니다. 하악골을 제거한 후, 마우스의 머리를 페트리 접시에 넣으십시오.

구개부를 시각화하기 위해 마우스의 머리를 해부 현미경 아래에 위치시킵니다. 다음으로, 미세 가위를 사용하여 구개부 상단에 수평으로 절개선을 만들고, 미세 해부 핀셋으로 구개막을 제거합니다. 노출된 강을 A CSF로 수분 공급 및 세척합니다.

비중격의 상단과 하단 부위를 절개합니다. 그런 다음 VNO가 포함된 비중격을 조심스럽게 추출하여 깨끗한 A CSF에 수직으로 직접 넣습니다. 미세 해부용 포셉을 사용하여 VNO의 두 부분을 분리합니다.

VNO의 연골 캡슐을 확인한 후, 모든 연골 조각이 제거되도록 주의하며 조심스럽게 제거합니다. 분리된 VNO, 연골 조각 및 해부되지 않은 VNO가 여기에 표시되어 있습니다. 먼저 3% 저융점 agarose를 준비하고 필요한 도구들로 작업 공간을 구성합니다. 임베딩 몰드에 agarose를 채우고, 해부된 VNO를 담그기 전에 온도가 41°C 미만인지 확인합니다. 관상면 절편을 얻기 위해 조직을 수직으로 배치합니다.

오거(auger)가 응고될 때까지 임베딩 몰드를 얼음 위에 1분 동안 둡니다. 1분 후, 오거 블록을 제거하고 아가(agar)를 파라메탈(parametal) 모양으로 자른 다음, 마이크로톰 지지대에 접착합니다. 차가운 CSF 상태에서 0.5 millimeters per second의 속도, 0.7 millimeters의 진폭, 100 micrometers의 두께로 VNO의 관상면(coronal) 절편을 마이크로톰으로 절단합니다.

브러시로 조직 절편을 수집하여 차가운 A CSF가 채워진 조직 배양 플레이트에 옮깁니다. 이는 수집된 조직 절편의 구조적 무결성을 검증하기 위함이며, 이후 고정 과정을 거쳐 세포골격 성분이나 기타 관심 단백질에 대해 면역 염색을 수행할 수 있습니다. 여기서는 보라색으로 나타난 acetylated tubulin에 대한 면역 염색을 통해 조직 절편의 구조적 무결성을 보여줍니다. 또한, 특정 페로몬 수용체가 GFP로 태깅된 특정 신경세포 군집을 관찰함으로써 보존된 신경 세포 형태를 확인할 수 있습니다. 암실에서 관찰하면 작은 타원형의 세포체와 루멘 표면까지 뻗어 미세융모로 끝나는 긴 수지상 돌기를 가진 신경세포들을 관찰할 수 있습니다.

7 µM URA 2:00 AM과 0.1% onic이 포함된 차가운 A CSF 로딩 용액에서 VNO 슬라이스를 37 °C로 1시간 동안 배양하십시오. 1시간 후, 로딩된 슬라이스를 사용 전까지 oxy carbonation과 함께 얼음 위에 보관하십시오. 페인트 브러시를 사용하여 로딩된 슬라이드를 A CSF가 담긴 관류 챔버에 배치하고 조직 슬라이스 고정 장치(tissue slice anchor)로 슬라이드를 고정하십시오.

칼슘 이미징 설정의 현미경 스테이지 위에 관류 챔버를 놓고, 실온에서 산소-탄산화된 A CSF를 지속적으로 관류합니다. 염료에 해당하는 형광 파장(4O 2:00 AM의 경우 340~380 nm)을 사용하여 로딩된 VNO 슬라이스를 관찰합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 세포 내 칼슘 비율 변화를 기록합니다. 화학적 자극을 유도하기 위해서는 관류 시스템이 필요합니다.

여기서는 V1R2 페로몬 수용체를 발현하는 뉴런 하위 집단이 GFP도 함께 발현하는 마우스 vno 조직의 관상면 절편이 보라색으로 표시된 아세틸화 튜불린(acetylated tubulin) 단백질에 대해 면역 염색된 모습입니다. 절편의 고배율 영상은 조직의 무결성이 유지되고 있음을 보여줍니다. 긴 수지상 돌기를 가진 뉴런들이 루멘(lumen) 표면에 도달하는 모습이 나타나며, 칼슘 이미징을 위한 수지상 돌기 결절(dendritic knobs)과 미세융모에서 구조 단백질의 발현을 확인할 수 있습니다.

FU가 적재된 조직 절편을 먼저 Hoffman 위상차 현미경으로 관찰하여 관심 영역을 찾습니다. 첫 번째 흰색 화살표로 표시된 혈관에서 시작하여, 관찰자는 천천히 두 번째 흰색 화살표인 루멘(lumen)과 신경 상피 영역으로 이동합니다. RO 비강 뉴런의 타원형 세포체는 길고 가느다란 돌기를 통해 세 번째 흰색 화살표로 식별할 수 있습니다.

루멘으로 뻗어 있는 네 번째 흰색 화살표는 신경세포의 수지상 돌기 결절(dendritic knob)을 나타냅니다. 다섯 번째 흰색 화살표는 페로몬 RA가 적재된 세포와 접촉하고 있는 미세융모를 가리키며, 여기서는 380 nm로 순차적으로 조명된 후 340 nm와 380 nm로 조명되었고, 이 형광 파장 비율은 선택된 신경세포(검은색, 빨간색, 파란색 원)의 세포 내 칼슘 변화에 해당합니다. 신경세포의 생존력을 결정하기 위해 ATP가 사용되었습니다.

선택된 세 개의 뉴런에서 나타나는 칼슘 반응의 범위와, 빨간색 원으로 표시된 2번 뉴런은 TP에 반응하지 않아 이후 분석에서 제외될 것이라는 점에 주목하십시오. 그다음, 조직 절편의 깊은 곳을 관찰하며 소변과 마우스 페로몬 혼합물을 모두 사용하여 화학적 자극을 줍니다. GFP와 V1RRB2 수용체를 모두 발현하는 뉴런의 하위 집단을 국소화할 수 있습니다.

여기 GFP와 V1RB2 수용체를 모두 발현하는 뉴런이 V1RB2를 발현하지 않는 뉴런과 함께 제시되어 있습니다. 두 세포 모두 URA-2 AM으로 로딩되었으며, V1RB2 발현 뉴런은 수용체의 리간드인 2-heptanone의 관류에 반응하여 칼슘 스파이크를 보여줍니다. 흥미롭게도, V1RB2를 발현하지 않는 뉴런 또한 2-heptanone에 반응하여 VNO 내 페로몬 코딩의 복잡성을 입증합니다.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 급성 조직 절편 제작을 위해 마우스의 마르 세포 기관(mar cell organ)을 추출하고 미세 절제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 프로토콜은 다른 칼슘 염료 및 현미경 설정을 이용한 생리학적 연구에도 적용 가능합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.