Name: 이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 학습하세요 마우스 비강기관(VNO) 급성 조직 슬라이스 준비 및 칼슘 이미징을 통한 페로몬 감지 신경 활동 관찰 방법을. 이 기법은 수컷 마우스의 화학수용체-리간드 상호작용 연구에 활용됩니다.

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우리는 그의 과학적인 조언과 현미경 장비에 UNIL의 이미징 CIF 플랫폼에 특히 모니크 Nenniger 그녀의 뛰어난 기술 지원 Tosato뿐만 아니라 장 - 이브 Chatton 감사드립니다. 자금은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 제공되었다.

1. 마우스 VNO의 해부 <ol><li> 성인 마우스를 사용합니다. 페로몬 감지가 multimodalities에 연루되어 마찬가지로, 변종, genotypes, 성별과 연령 사이의주의 구별은 중요하고 결과에 영향을 미칠 것이다. 여기, 우리는 이전 페로몬 - 수용체 쌍 (2 heptanone - V1rb2) 31 (그림 1A)의 식별에 사용되는 성인 VG 마우스 30을 선택합니다. </li><li> NaCl 118 MM, NaHCO 3 25 MM, D - 포도당 10 MM, KCl이 MM, MgCl 2 2 MM, 아니 2 PO 4 1.2 MM, CaCl 2 2, 절개를 시작하기 전에 (ACSF 신선한 차가운 인공 세리 브로 - 척골 액을 준비 MM; oxycarbon (95% O 2 포화 산도 7.4) : 5 % CO 2). 그, CaCl 2를 제외한 모든 ACSF 구성 요소를 섞는다. 직접 oxycarbon로 버블링하여 솔루션을 포화. 결국, CaCl 2를 추가하고 원하는 볼륨 ddH 2 0로 조정합니다. U 때까지 얼음 ACSF 솔루션을 유지SE. </li><li> 마우스의 안락사는 우선적으로 막 실험을하기 전에 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입에 의해 수행되어야합니다. </li><li> 마우스 머리를 자르고. 지속 oxycarbonated 추운 ACSF에서 해부 현미경으로 그것을 놓으십시오. </li><li> 아래턱을 잘라 미각 (그림 1B)를 시각화하기 위해 머리를 위치. </li><li> 마이크로 가위로 미각의 위쪽 부분 (그림의 1B)에 수평 절개를 만들고 마이크로 해부 포셉과 미각 막를 제거합니다. 하이드 레이트와 ACSF (그림 1C)로 노출된 구멍을 청소하십시오. </li><li> 상부를 잘라 비강 심장 (그림 1C)의 하단 부분입니다. 정교한 VNO가 들어있는 비강 심장을 추출하고 얼음 (그림의 1D)에 ACSF에 직접 넣습니다. </li><li> 수직으로 미세 해부 집게를 사용하여 VNO의 두 부분을 분리하고 정교한 VNO의 연골 캡슐 (를 제거그림. 1E). 모든 연골 조각이 제거되었는지 확인합니다. </li></ol> 2. VNO 조직 슬라이스 준비 이 섹션 2)에 설명되어있는 VNO 조직 슬라이스 준비는 주로 칼슘 이미징 조사입니다. VNO 슬라이스 또한 조직의 구조적 무결성을 프로토콜 (섹션 3 참조하시기 바랍니다)) 확인 떠있는 조각에 immunohistostainings 사용할 수 있습니다. <ol><li> 낮은 용융 한천 (표준 PBS 3 %)하고 작업 장소를 준비합니다. 당신은 금형을 포함, ACSF, 마이크로톰 및 지원, 마이크로 해부 집게가 필요합니다 (22 X 22 X 20mm), 정밀 잎사귀, 붓, 조직 문화 접시, cyanacrylat 접착제, 얼음과 온도계. </li><li> 3퍼센트 낮은 용해 한천로 포함 금형을 입력합니다. 온도가 41 이상되어 있지 않은지 확인합니다 ° C 수직 코로나 조각을 얻을 수 있도록 곧 닦아 VNO (그림 2A)를 배치하기 전에. </li><li> 얼음에 포함 금형을 소다음 1 분 및 응고까지에 대한 한천 블록에서 분리. 피라미드 모양의 한천 블록을 잘라 마이크로톰 지원 (그림 2B)에 접착제로 놓으십시오. </li><li> 0.5 mm / s의, 0.7 mm의 진폭과 차가운 ACSF 100 μm의의 두께의 속도로, 마이크로톰와 코로나 VNO의 조각을 잘라 차가운 가득한 조직 문화 판에서 그들을 배치하기 전에 브러시로 조직 조각을 수집 ACSF. </li><li> 당신의 조각이 GFP 같은 내생 형광을 (유전자 타겟 뉴런에서)이 포함되어있다면 당신은 형광 stereomicroscope (그림 2C)에서 그들을 선택할 수 있습니다. </li></ol> 3. VNO 떠있는 조각에 Immunohistochemistry 이 절차의 목적은 제 2에서 얻어진 VNO 조직 슬라이스)의 무결성을 확인하는 것입니다. Acetylated - tubulin은 VNO 감각 뉴런의 dendrites과 microvilli로 표현 미세 소관 / cytoskeleton 마커입니다. 칼슘 이미징 실험, direc 가지tly에 대한 프로토콜 섹션 4). 부동 VNO 슬라이스에 immunohistostaining 방법은 관심의 단백질의 표현의 평가에 적용할 수 있습니다. 이런 목적을 위해, 우리는 4 1H에 대한 VNO 당신을 고칠 것을 ° C를 정착액 솔루션 (PBS, pH를 7.6에서 paraformaldehyde 4 %) 포인트 1.7 이후)이 시점 PBS에서 프로토콜과 사용 산도 7.6에서보다는 좋습니다 ACSF 솔루션입니다. <ol><li> 조직 문화 판에서는 정착액 솔루션에 대한 관심의 조각 (PBS, pH를 7.6에서 paraformaldehyde 4 %) 4 1H ° C. 문제를 해결 </li><li> 0.5 %에서 NGS (혈청 정상 염소) 10 % 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS 용액에 4 박 귀하의 조직 조각 ° C를 차단합니다. </li><li> 0.25 %에서 NGS 5% 그리고 Triton X - 100을 포함하는 PBS 용액에 실온 (RT)에서 16h에 대한 기본 항체와 조각 (안티 acetylated - tubulin, 마우스, 1:2000) 품다. </li><li> NGS 2 % 포함하는 PBS 용액 5 분 동안 3 번 씻으십시오. </li><li> seco와 함께 어둠 속에 품어RT에서 1 시간을위한 NGS에게 2 % 포함하는 PBS 용액에 ndary 항체 (Cy5 - 복합 염소 안티 - 마우스, 1:200). </li><li> NGS에게 2 % 포함하는 PBS로 5 분 3 번 씻어, PBS가 1 %만을 PBS를 NGS. </li><li> 소수성 구분된 지역 (소수성 펜을 사용)의 중심에서 그들을 배치하여 형광등 설치 미디어 (DAPI을 포함하거나하지 않음)에 슬라이스를 마운트하고 coverslips로 조각 커버. </li><li> 공촛점 현미경 및 3D reconstructions (그림 2D - F)를 허용하는 소프트웨어와 함께 관찰과 인수를 확인하십시오. </li></ol> 4. VNO 슬라이스에 칼슘 이미징 <ol><li> 다음 절차는 어둠 속에서 자리를 취할 것입니다. 37 상반기 대한 품어 VNO 슬라이스 ° Fura - 오전 2시 (7 μm의, DMSO 1 mm의 재고 솔루션)와 추위 ACSF 구성된로드 솔루션에 C와 pluronic 0.1 % (W / V, ddH 2에서 20 %의 재고 솔루션 O). </li><li> 사용까지 oxycarbonation와 얼음로드 슬라이스 보관하십시오. 로드된 조각은 보관 수 있습니다3 4h. </li><li> ACSF을 포함하는 재관류 챔버에서 브러쉬와 함께 로드된 조각 장소 및 조직 슬라이스 앵커 (그림 3A)과 슬라이스를 유지합니다. </li><li> 칼슘 이미징 현미경 (그림 3B)의 무대에서 재관류 챔버를 놓고 지속적으로 RT에서 oxycarbonated ACSF와 perfuse. 온도는 바이폴라 온도 컨트롤러의 사용으로 적용할 수 있습니다. </li><li> 로드 VNO의 조각 (그림 3C - E)의 관측은 25x 63x 또는 객관적이고 시원한 SNAP - HQ 카메라로, 거꾸로 형광 현미경으로 수행됩니다. 조명 polychromator 악기와 함께 (380분의 340 NM) 순차적으로 행해지며 5Hz의 속도로 기록됩니다. 필터링 방출은 510 nm의에서 이루어집니다. 세포 내 칼슘 비율 변경 (ΔF = 340 nm/380 NM)는 적절한 소프트웨어를 모니터링하고 있습니다. </li><li> Chemostimulation는 자신의 실험 목적에 따라 선택해야합니다. 여기 ACSF의 perfusions는 페로몬 m을 포함하는IX (isobutylamine, 2 heptanone, 4 heptanone, 2 heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β - farnesene, 10 -6 M), 2 heptanone (10 -6 M) 또는 갓 (남성과 여성의 1 수집 : 1) 마우스 소변 (1:100)는 32 수행됩니다. ATP (125 μm의)의 재관류는 실험의 끝에 생존 능력 테스트로 사용됩니다 (그림 3 층) 및 약 80 % 가능한 뉴런의 비율을 나타내는 것입니다. 이러한 조건에서 조각 2 시간까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 감각 뉴런의 GFP - 태그 subpopulations는 특정 조명 (여기서 V1rb2 표현 뉴런)에 의해 시각 있으며 (그림 3G - I) 정확하게 분석할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 다중 형질 도입 마우스 VNO에서 일어나고, 또는 새 페로몬 - 수용체 쌍을 식별하는 경로를 조사하기 위해 기능 분석을 설정하려면, 우리는 VG 마우스 라인 (그림 1A의 활용 (그림 1E)의 추출 및 해부 후, 우리는 급성 VNO의 조각 (그림 2C)를 준비합니다. 우리는 acetylated - tubulin 단백질 (그림 2D - F)에 대한 immunohistostainings를 수행하여 준비 tissular 무결성을 확인하고 검증하기 위해, 그들의 일부를 수정. 조각의 다른 분수는 칼슘 이미징 실험에 사용됩니다. 그 내용은 슬라이스는 Fura - 오전 2시 (그림 3C - E)와로드하고 각 신경 세포의 세포 내 칼슘 수준은 ΔF 비율 (그림 3 층)로 모니터합니다. 뉴런의 생존은 ΔF 비율의 신속하고 일시적 증가 (그림 3 층) 예상되는 이후 ATP (125 μm의)의 재관류에 의해 평가됩니다. 페로몬의 주요 원천되고 소변, 신선한의 재관류니 수집 마우스 소변 (1:100)는 내생 컨트롤로 사용됩니다. 그것은 기록된 뉴런 (세포 1과 2, 그림. 층)의 약 50 %의 칼슘 과도를 트리거합니다. GFP 조명 아래 V1Rb2 긍정적인 뉴런이 관찰하며, 알려진 pheromonal 리간드, 2 heptanone의 재관류는 세포 활성화 (셀 1, 그림. 3I)을 시작하고 있습니다. 흥미롭게도, 정품 인증의 연결도 VNO에 페로몬 코딩의 복잡성을 보여주는, V1Rb2 수용체 (GFP 부정적인 뉴런) (세포 2, 그림. 3I)를 표현하지 뉴런의 일부에서 관찰됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 마우스 vomeronasal 기관의 해부. VG 라인에서 (A) 마우스. (B) 마우스 안락사 후, 미각을 시각화하기 위해 전체 머리가 쌍안경 현미경으로 배치하고 아래턱이 제거됩니다. 작은 가로 절개가 이루어집니다(검은 점선). (C) 미각의 제거 후, ​​VNO 줄지어 비강 심장은 위쪽에서 절단하고 아래쪽 부분 (흰색 점선 라인) VNO 추출을 촉진하기. (D) VNO는 ACSF 솔루션에 위치하고 (삽입 : 두 부품의 높은 전력보기) 구분합니다. (E) VNO의 연골이 캡슐은 정교한 제거하며, 연골 캡슐없이 VNO는 실험의 나머지 부분에 사용됩니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 BE, 1mm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 마우스 vomeronasal 급성 슬라이스 준비와 tissular 무결성. (A) 마우스 VNO는 수직으로 한천 3 % 용액에 모두 담겨있다. 한천의 온도가 41 ° C.보다 낮은되어야합니다 (B) 한천 블록은 피라미드 모양으로 절단과 100 μm의 VNO 섹션이 (검은 점선) ACSF에서 생성됩니다. (C) VNO의 조각은 특정을 시각화하기 위해 형광 stereomicroscope에 따라 선택하실 수 있습니다태그 감각 뉴런의 인구. (DF) Tissular 무결성 acetylated - tubulin 단백질, 준비의 완벽한 보존을 보여주 V1rb2 유전자 타겟 뉴런의 높은 전력보기에 대한 immunohistostainings로 평가할 수 있습니다. 오랜 dendrites는 루멘 (E)뿐만 아니라 돌기 손잡이와 microvilli의 구조 단백질의 표현의 표면에 도달과 함께 뉴런은 (F) 볼 수 있습니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 B, 5mm, C, 60 μm의, D, 40 μm의, EF, 20 μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 칼슘 이미징 및 vomeronasal 급성 조직 조각에서 페로몬 탐지. (A) Fura - 오전 2시 로딩 단계 후, VNO 슬라이스는 재관류 챔버에 배치하고 적응 앵커 (고전력보기)로 유지됩니다. (B) 실험이 어둡고 VNO 조각으로 수행하는가 지속적으로 진공 시스템과 RT에서 ACSF와 perfused 있습니다. 온도가 chos 수 있습니다양극성 Pelletier 요소와 열 프로브로 구성된 온도 컨트롤러 시스템을 사용 ko 페이지를 참조하십시오. 이 특별한 실험 RT에서 수행되었다. (CE) VNO 슬라이스는 (D)와의 연결을 활성화 (E, 여기서 ATP)를하는 동안 전에 호프만 위상 콘트라스트 (C, HV) 또는 Fura 380 NM 조명 아래에서 관찰할 수 있습니다. (F)의 연결 가능성은 ATP (125 μm의)의 재관류로 평가됩니다. 여기 chemostimulation는 소변 (소변, 1:100) 또는 165 ML / H.의 일정한 흐름 속도로 마우스 페로몬을 혼합 (믹스 산도., 10 -6 M)로 이루어집니다 세포 내 칼슘 수준 (ΔF)은 (셀 1-3) 각 셀에 대해 개별적으로 녹음하실 수 있습니다. (G) V1Rb2의 신경 세포가 GFP 조명 (1) 아래에서 시각입니다. (H)이 신경 세포 (1)뿐만 아니라 비 V1rb2 표현 뉴런 (2)의로드가 표시됩니다. (I) V1rb2의 뉴런은 세포 내 칼슘 증가와 함께 2 heptanone에 응답할 수 있습니다. 이 특정되지 않은 V1rb2 표현 신경 세포는 또한 2 heptanone (셀 2)에 응답합니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 CE, 20 μm의, GH,15 μm의; ΔF = 340 NM / NM 380. (F와 I) 자극 응용 프로그램의 기간은 각 추적 아래에 막대로 표시됩니다. 임의의 색상 규모는 형광 강도를 나타냅니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 칼슘 이미징 방법은, 급성 슬라이스 준비, 마우스 VNO의 뉴런의 반응을 기록 pheromonal 수 있습니다. 이 방법으로 vomeronasal 뉴런에 대한 동물의 해부는 연습과 함께, 쉽게 달성되고 오랫동안 살아있는 조직 준비를 제공합니다. 그것은 약리 조사 또는 pheromonal 코딩의 연구와 같은 시간이 많이 소요 실험을 수 있습니다. 이 생리적 기법으로, 큰 인구뿐만 아니라 정확 subpopulations의 연결은 특히 분석하실 수 있습니다. 또한,이 방법은 쉽게 다른 칼슘 염료에 따라 immunohistochemical 접근이나 실험에 적용할 수 있습니다. 이러한 조합 방법의 사용은 반드시 마우스 vomeronasal 기관 표현 수많은 고아 chemoreceptors에 대한 새로운 pheromonal 리간드의 신분을하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 아데노신 5&#39; - triphosphate 나트륨 소금 용액 (ATP) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A6559 - 25UMO </td><td></td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A7002 - 100G </td><td> 우선적으로 immunohistochemistry을 위해 </td></tr><tr><td> 한천 (낮은 용융) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A0701 - 25G </td><td> 우선적으로 칼슘 이미징을위한 </td></tr><tr><td> CL - 100 바이폴라 온도 컨트롤러 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> W64 - 0352 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 - AffiniPure 염소 안티 - 마우스 IgG </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> 빛과 보호 </td></tr><tr><td> DMSO (디메틸 Sulfoxide) </td><td> 머크 </td><td> 317275 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> 금형을 포함, 껍질 - A - 웨이 </td><td> Polysciences </td><td> 18646A - 1 </td><td> 22 X 22 X 20mm </td></tr><tr><td> 형광등 설치 미디어 (DAPI로 Vectashield, 10 ML) </td><td> Rectolab </td><td> H - 1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA - 오전 2시 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> 빛과 보호 </td></tr><tr><td> Glisseal N (진공 그리스, 60g) </td><td> 보어의 케미 </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> 대형 욕조 기록 챔버 (RC - 26G) </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (칼슘 이미징 소프트웨어, v.7.6.5.0) </td><td> Visitron 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단클론 방지 Tubulin, acetylateD 마우스 항체 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T6793 - .2ML </td><td></td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 (NGS, 10 ML) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> 야근에 대한 플랫폼 (P - 1) </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F - 127, 2g </td><td> Invitrogen </td><td> P - 6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (먹이지 병, 10g) </td><td> 칼 로스 </td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC - 20 듀얼 인라인 솔루션 히터 / 쿨러 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> W64 - 0353 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이스 앵커 (SHD - 26GKIT) </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> 슈퍼 PAP 펜 (소수성펜) </td><td> Pelco 국제 </td><td> 22,309 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> Fluka </td><td> 93420 - 250ML </td><td></td></tr><tr><td> 진동 블레이드 마이크로톰 VT 1200S </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome 고속 polychromator 시스템 </td><td> Visitron 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D 데이터 시각화 (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane 과학 소프트웨어 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 페로몬은 마우스 vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

피터 Karlson과 마틴 Lüscher는 내부 종 (species) 통신에 사용되는 화학 물질을 설명하기 위해 1959 1 처음 용어 페로몬를 사용합니다. 페로몬은 휘발성 또는 비휘발성 수명이 짧은 분자이 분비 및 / 또는 소변, 페로몬 3 주 원본으로 알려진 액체로 생물 학적 체액 3,4에 포함되어 있습니다. Pheromonal 통신 등 가족과 상호 작용 5,6, 계층적 조직 3 성적 상호 작용 7,8 등 주요 동물 modalities 다양한 연루되고 결과적으로 직접 주어진 종 9,10,11의 생존과 상관 있습니다. 마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO) 10,12, 비강의 기지에 위치한 이점 구조에 의해 중재되며, 연골 캡슐에 동봉. 각 VNO는 외부와 접촉을 허용 루멘 13,14와 관 모양을 가지고화학의 세계. 감각 neuroepithelium은 주로 vomeronasal 바이폴라 감각 뉴런 (VSNs) 15로 구성되어 있습니다. 각 VSN 화학 감지 16 연루 100 microvilli 최대 베어링 큰 돌기 손잡이로 끝나는 루멘에 하나의 dendrite를 확장합니다. VSNs 수많은 subpopulations이 흐릅니다. 그들은 그들이 17,18을 인식 리간드 (들)에 의해 가능하게함으로써 표현하고 chemoreceptor으로 구분됩니다. 두 가지 주요 vomeronasal 수용체 가족, V1Rs 및 V2Rs 19,20,21,22은 240 23 120 24 회원 각각 구성되어 있으며, neuroepithelium 별도의 레이어에 표현됩니다. 후각 수용체 (ORs) 25 메티오닌 펩타이드 수용체는 (FPRs) 26,27도 VSNs로 표현됩니다. 이들의 연결 subpopulations가 감지 페로몬에 동일한 스트림 신호 경로를 사용 여부에 상관없이 알 수 있습니다. 칼슘 투과 채널 (에 의해 연주 중요한 역할에도 불구하고성숙한 뉴런 28 TRPC2 독립 전달 채널의 microvilli에 존재 TRPC2)는 6,29 제안되었습니다. 의 연결을 subpopulations의 높은 번호와 오르간의 독특한 형태로 인해, VNO에있는 신호 요소의 약리 및 생리 조사가 복잡하고 있습니다. 여기, 우리는 칼슘 이미징 조사를 수행하기위한 마우스 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비를 제시한다. 이것은 생리적 접근은 이전 Fura - 오전 2시, 칼슘 색소를로드 VSNs의 일반 또는 개별 subpopulations의 살아있는 조직의 자연 환경에서 관찰하실 수 있습니다. 이 방법은 GFP - 태그 페로몬 수용체를 공부 또한 편리합니다 그리고 다른 형광 칼슘 프로브의 사용에 대한 적응이다. 예를 들어, 우리는 여기 페로몬 V1rb2 수용체의 번역이 polycistronic 전략에 의한 GFP의 표현에 연결되어있는 VG 마우스 라인 30 사용합니다. </p&gt;

마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Peter Karlson과 Martin Lüscher는 1959년에 종 내 통신에 사용되는 화학 물질을 설명하기 위해 페로몬(pheromone)이라는 용어를 처음으로 사용하였습니다. ...

본 실험 과정의 전반적인 목적은 생체 조직 내의 신경세포 하위 집단 또는 개별 신경세포를 대상으로 칼슘 이미징 실험을 수행하기 위해, 생쥐의 RO 비기관 또는 VNO의 급성 조직 절편 표본을 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생쥐의 코에서 VNO를 추출한 다음, 냉각된 A CSF 내에서 해부 현미경을 사용하여 연골 캡슐로부터 미세 절제합니다. 그 후, 분리된 VNO를 아가 블록에 수직으로 고정시키고 마이크로톰을 사용하여 급성 관상 조직 절편을 제작함으로써 조직의 무결성을 확인합니다.면역조직화학 염색 후 공초점 현미경을 통해 몇 개의 절편을 관찰합니다. 다른 절편들에는 칼슘 민감성 염료를 주입한 다음, 페로몬 후보 리간드를 관류시켜 칼슘 이미징으로 신경 활성화를 관찰합니다. 이 방법은 후각 분야의 주요 문제들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 로모 비강 기관(romo nasal organ)에는 수백 개의 페로몬 수용체가 발현되지만, 그중 리간드가 확인된 것은 매우 적습니다. 페로몬 수용체는 이종 시스템에서 발현시키기가 매우 어렵습니다. 따라서 특정 페로몬을 특정 수용체에 할당하기 위해 효율적인 in vivo 분석법을 개발해야 했습니다.특정 뉴런 하위 집단이 미지의 수용체를 발현하며 GFP 발현을 통해 식별될 수 있는 형질전환 마우스를 사용할 수 있습니다. 또한, 본 분석법을 사용하여 Fairmont 신호 전달 폭포에 관여하는 이온 채널과 효소를 약리학적으로 조사함으로써 해당 절차를 입증할 수 있습니다. 해부를 시작하기에 앞서, 저희 실험실의 연구원인 Julian과 Fabian을 소개하겠습니다.염화칼슘을 제외한 모든 성분을 혼합하여 신선하고 차가운 인공 뇌척수액(A CSF)을 준비하고, 이를 oxy carb로 포화시킵니다. 용액에 oxy carb를 직접 버블링하여 포화시킨 후, 염화칼슘을 첨가하고 이중 증류수를 사용하여 원하는 부피로 조정합니다.A CSF 용액을 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 성체 마우스의 안락사 및 참수 후, 차갑고 지속적으로 산소 및 이산화탄소가 공급되는 A CSF가 담긴 페트리 접시를 준비합니다. 하악골을 제거한 후, 마우스의 머리를 페트리 접시에 넣습니다.구개부를 시각화하기 위해 마우스의 머리를 해부 현미경 아래에 위치시킵니다. 그다음, 미세 가위로 구개부 상단을 수평으로 절개한 후, 미세 해부 핀셋으로 구개 막을 제거합니다. 노출된 공동을 A CSF로 수분 공급 및 세척합니다.비중격의 상단과 하단을 절단합니다. 그 다음, VNO가 포함된 비중격을 조심스럽게 추출하여 깨끗한 A CSF에 수직으로 직접 넣습니다. 미세 해부 핀셋을 사용하여 VNO의 두 부분을 분리합니다.VNO의 연골 캡슐을 확인한 후, 모든 연골 조각이 제거되었는지 확인하며 조심스럽게 제거합니다. 분리된 VNO, 연골 조각 및 해부되지 않은 VNO가 여기에 표시되어 있습니다. 먼저 3% 저융점 agar를 준비하고 필요한 도구들로 작업 공간을 구성합니다. 임베딩 몰드에 agar를 채우고, 해부된 VNO를 담그기 전에 온도가 41 °C 미만인지 확인합니다. 관상면 절편을 얻기 위해 조직을 수직으로 배치합니다.오거(auger)가 응고될 때까지 임베딩 몰드를 얼음 위에 1분 동안 둡니다. 1분 후, 오거 블록을 제거하고 한천(agar)을 파라메탈(parametal) 모양으로 자른 다음 마이크로톰 지지대에 접착합니다. 차가운 CSF 내에서 0.5 millimeters per second의 속도, 0.7 millimeters의 진폭, 100 micrometers의 두께로 VNO 관상면 슬라이스를 마이크로톰으로 절단합니다.브러시를 사용하여 조직 절편을 수집하고 차가운 A CSF가 채워진 조직 배양 플레이트에 옮깁니다. 이는 수집된 조직 절편의 구조적 무결성을 확인하기 위함이며, 이후 고정 과정을 거쳐 세포골격 성분이나 기타 관심 단백질에 대해 면역 염색을 수행할 수 있습니다. 여기서는 보라색으로 염색된 acetylated tubulin에 대한 면역 염색을 통해 조직 절편의 구조적 무결성을 보여줍니다. 또한, 특정 페로몬 수용체가 GFP로 표지된 특정 신경세포 집단을 관찰하면 보존된 신경세포 형태를 확인할 수 있습니다. 암실에서 관찰하면 작은 타원형의 세포체와 루멘 표면까지 뻗어 미세융모로 끝나는 긴 수지상 돌기를 가진 신경세포를 관찰할 수 있습니다.7 µM URA 2:00 AM과 0.1% onic이 포함된 차가운 A CSF 로딩 용액에서 VNO 슬라이스를 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 로딩된 슬라이스는 사용 전까지 oxy carbonation 상태로 얼음 위에 보관하십시오. 페인트 브러시를 사용하여 로딩된 슬라이드를 A CSF가 들어 있는 관류 챔버에 배치하고, 조직 슬라이스 앵커로 슬라이스를 고정합니다.관류 챔버를 칼슘 이미징 설정의 현미경 스테이지 위에 놓고 실온에서 산소 포화 탄산화된 A CSF를 지속적으로 관류합니다. 4 O 2:00 AM의 경우 340 nm에서 380 nm에 해당하는 형광 파장을 사용하여 로딩된 VNO 슬라이스를 관찰합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 세포 내 칼슘 비율 변화를 기록합니다. 화학적 자극을 유도하기 위해서는 관류 시스템이 필요합니다.여기 V1R2 페로몬 수용체를 발현하는 뉴런의 하위 집단이 GFP 또한 발현하는 마우스의 vno 조직 관상 단면이 있으며, 보라색으로 표시된 아세틸화 튜불린 단백질에 대해 면역 염색되었습니다. 단면의 고배율 뷰는 조직 무결성이 유지되고 있음을 보여줍니다. 긴 수지상 돌기를 가진 뉴런들이 루멘 표면에 도달하는 모습이 보이며, 칼슘 이미징을 위한 수지상 돌기 노브와 미세융모에서 구조 단백질의 발현을 확인할 수 있습니다.FU가 로드된 조직 절편은 먼저 Hoffman 위상차 현미경을 사용하여 시각화하며, 혈관(첫 번째 흰색 화살표)부터 시작하여 관심 영역을 찾습니다. 관찰자는 루멘(두 번째 흰색 화살표)과 신경 상피 영역을 향해 천천히 이동합니다. RO 비강 뉴런의 타원형 세포체는 길고 가는 돌기(세 번째 흰색 화살표)를 통해 식별할 수 있습니다.강내로 뻗어 있는 네 번째 흰색 화살표는 신경세포의 수지상 돌기 결절을 나타냅니다. 다섯 번째 흰색 화살표는 페로몬 RA가 적재된 세포와 접촉하고 있는 미세융모를 나타내며, 여기서 380 nm로 순차적으로 조명된 후 340 nm와 380 nm로 조명되었을 때, 이 형광 파장 비율은 선택된 신경세포(검은색, 빨간색, 파란색 원)의 세포 내 칼슘 변화에 상응하는 그래프가 됩니다. 신경세포의 생존력을 결정하기 위해 TP가 사용되었습니다.선택된 세 개의 뉴런에서 나타나는 칼슘 반응의 범위를 확인하십시오. 또한, 빨간색 원으로 표시된 2번 뉴런은 TP에 반응하지 않으므로 이후 분석에서 제외됩니다. 그다음 조직 절편의 심부를 관찰하며 소변과 마우스 페로몬 혼합물을 모두 사용하여 화학적 자극을 줍니다. GFP와 V1RR2 수용체를 모두 발현하는 뉴런의 하위 집단을 국소화할 수 있습니다.여기 GFP와 V1RB2 수용체를 모두 발현하는 뉴런이 V1RB2를 발현하지 않는 뉴런과 함께 표시되어 있습니다. 두 세포 모두 URA-2 AM이 로딩되었으며, V1RB2 발현 뉴런은 해당 수용체의 리간드인 2-hepnon의 관류에 반응하여 칼슘 스파이크를 나타냅니다. 흥미롭게도, V1RB2를 발현하지 않는 뉴런 또한 2-hepnon에 반응하며, 이는 VNO 내 페로몬 코딩의 복잡성을 보여줍니다.이 영상을 시청한 후, 귀하는 급성 조직 슬라이스 제작을 위해 마우스의 mar 세포 기관을 추출하고 미세 절제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜은 다른 칼슘 염료 및 현미경 설정을 이용한 생리학적 연구에도 적용 가능합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

이 비디오는 쥐 성기 장기(VNO)의 분리 및 진동 절편을 위한 조직 준비에 대해 간략하게 설명합니다. 섹션은 특정 감각 뉴런 그룹의 생물물리학적, 생리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

Vibratome Sectioning을 위한 Mouse Vomeronasal Organ의 준비

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

이 기사는 단일 핵 RNA 시퀀싱을 목적으로 쥐 후각 상피의 해부 및 해리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.

단일 핵 현탁액을 위한 마우스 후각 상피의 신속한 해부 및 해리

학습하세요 마우스 비강기관(VNO) 급성 조직 슬라이스 준비 및 칼슘 이미징을 통한 페로몬 감지 신경 활동 관찰 방법을. 이 기법은 수컷 마우스의 화학수용체-리간드 상호작용 연구에 활용됩니다.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

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