Name: 의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO 학습 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 학습하세요 순환 압력 생물 반응기를 이용한 대동맥 심장 판막 조직의 기계생물학적 반응 분석 방법을. 이 기술은 판막 질환의 병인 이해와 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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저자는 원고를 준비하여 시스템 및 지원 Valtresa의 마일즈의 설계 및 제조와 그들의 도움을 쉐그 Schipke, 다니엘 체서에게 감사하고 있습니다.

1. 조직 하베스트 및 준비 <ol><li> 대동맥 밸브는 바로 죽은 후 더 이상 120 이상 파운드 무게 성인 돼지에서 수집해야합니다. </li><li> 멸균 인산과 함께 두 번 밸브를 세척 식염수 (PBS)와 얼음에 실험실로 전송이 버퍼. </li><li> 모든 후속 단계는 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. </li><li> 그 전단지가 찢어이나 석회화, 변성의 기호를 표시하지 않도록. 환대에서 거리의 1 / 3 절단하여 대동맥 루트에서 전단지를 제거합니다. </li><li> 플레이스 여섯 잘 접시의 각각의 우물에서 전단지 37 ° C와 5 % CO 2에서 1퍼센트 anti-biotic/anti-mycotic 솔루션와 10 % 태아 소 혈청과 보충 3ml Dulbecco의 수정된 이글 매체와 함께 밤새 품어. </li><li> 대체 절연 세포 6 - 잘 문화 접시에 씨앗을 품고 및 압력 장치에 사용될 수 있듯이. 이전 13 14 설명된대로 밸브 내피 세포와 중간 세포의 분리는 수행할 수 있습니다. </li></ol> 2. 압력 연구 <ol><li> 맞춤 만든 압력 시스템은 대동맥 밸브 조직 15 순환 압력 mechanobiological 효과를 연구하기 위해 설계되었습니다. </li><li> 컴퓨터에 로그인하고 labVIEW 프로그램 (그림 1)을 엽니다. </li><li> 보정 : <ol><li> 이전 실험하기 위해 시스템이 적절히 보정해야합니다. </li><li> 회로 기판에 전원 공급 장치를 연결합니다. 이것은 챔버로 밖의 공기의 흐름을 제어 솔레노이드 밸브에 전원을 제공합니다. </li><li> 압축 공기가 시스템에 연결되어 있는지 확인하고 전체 속도로 공기 공급 장치를 엽니다. </li><li> 신호 증폭기를 켭니다. 전압 독서가 0.00 있는지 확인하십시오. 필요에 따라 조정 </li><li> labVIEW 인터페이스는 "TEST / 기록"라고 표시된 스위치가 있습니다. 스위치가 "TEST"로 설정되어 있는지 확인하십시오. "공기 공급"유입 솔레노이드 밸브를 열고 표시된 버튼을 클릭합니다. </li><li> 가스 압력 조절기를 사용하여, 1 PSI에 압축 공기 챔버의 기압. 챔버의 압력 챔버의 최종 플레이트 후면에있는 디지털 압력 게이지를 사용하여 읽을 수 있습니다. 압력 equilibrated되면, 신호 증폭기에서 전압 독서를 기록합니다. 2, 3, 4 및 5 PSI에 대해 반복합니다. </li><li> 압력 대 전압의 보정 곡선을 구축. 압력은 PSI에서 mmHg로 변환해야합니다. 그래프의 방정식은 labVIEW 프로그램의 코드에 삽입할 수 있습니다 </li></ol></li><li> 압력 챔버에서 알루미늄 전면 플레이트를 제거하고 70 % 에탄올로 챔버를 스프레이. 잔여 에탄올 가스가 분산 수 있도록 10 분 최소 둡니다. </li><li> 챔버에 전단지 샘플을 포함하고있는 여섯 잘 플레이트를 삽입하고 프런트 엔드 플레이트를 교체하십시오. 봉인 손으로 네 개의 스레드 막대 (경판의 각 모서리에 위치)에있는 너트를 강화하여 밀폐 있는지 확인하십시오. 37 ° C 배양기에서 압력 챔버를 놓습니다. 압력 챔버의 구조 다이어그램은 그림 2에 표시됩니다. </li><li> 인터페이스는 압축 공기 입력 및 출력 사이의 시스템의 순환 시간을 제공하기 위해 사용자에게 프롬프트합니다. 이러한 1Hz의 주파수에서 각각 0.6s와 모방에 0.4s diastolic과 수축기 조건에 설정해야합니다. 사용자는 또한 데이터 파일의 경로를 입력합니다. </li><li> labVIEW, 실행을 클릭하고 "레코드"로 "TEST / 레코드가"토글 스위치. </li><li> 압력이 labVIEW 인터페이스에 대한 그래프를 사용하여 원하는 수준에 있는지 확인하십시오. 압력은 가스 압력 조절기를 사용하여 조정할 수 있습니다. </li><li> 시간의 원하는 기간 동안 프로그램을 실행합니다. </li><li> 실험이 완료되면, labVIEW에있는 중지 버튼을 클릭 공기 공급 장치를 끄고 압력 챔버에 배기 밸브를 엽니다. </li><li> 챔버에서 프런트 엔드 플레이트를 제거하고 여섯 잘 플레이트가 포함된 샘플을 검색할 수 있습니다. 샘플은 현재 유전자 발현, 단백질 표현, 조직학, 기계적 성질 등의 분석 수 </li></ol> 3. 대표 결과 : 압력 시스템은 normotensive 하에서 관찰 최대 transvalvular 압력을 시뮬레이션 할 수있어, 내가 무대 II 신경성 조건을 무대. 단, 압력은 생체내에 본질적으로 제로입니다 수축기 압력 기울기를 모방 수 없습니다. 주파수는 0.6s 0.4s의과 배기 시간의 공기 유입 시간, 1Hz에서 관리하고 있습니다. 시스템에서 얻은 정상 및 높은 압력 조건의 대표 압력 파형은 그림 3에서 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1 : LabVIEW 인터페이스의 스크린 샷. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2 : 압력 챔버의 압력 챔버 A. 사시의 도식 그림, 압력 챔버의 B. 사이드보기;압력 챔버의 C. 톱 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig3.jpg" alt="그림 3"> 그림 3 : (A) normotensive, (B) 나는 신경성 스테이지, 그리고 (C) 스테이지 II 신경성 조건에서 압력 챔버 내의 압력 시뮬레이션의 그래프.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

압력 시스템은 성공적으로 diastolic transvalvular 압력을 대표했다 순환 압력에 대동맥 밸브 전단지를 노출. 압력은 40 mmHg로 감소 그러나, 그것은 수축기 transvalvular 압력을 모방 수 없습니다. Transvalvular 압력은 오름차순 대동맥의 압력과 좌심실 사이의 차이입니다. 심장 확장하는 동안, 밸브가 닫힐 때, 압력 차이가 normotensive 조건 90 mmHg 이하 80mmHg이며 무대 II의 고혈압은 각각 단계 100mmHg. 수축기 동안, 밸브가 열려있을 때, 좌심실과 대동맥 사이에 상승 압력 차이가 제로입니다. 대동맥 밸브 질환에서 발생하는 세포 변화가 높은 diastolic 압력과 연관된 것으로 않으므로 압력이 제로로 떨어진 게 아니라는 사실은 큰 우려되지 않을 수 있습니다. 이것은 그것이 압력 크기 및 생물 학적 반응의 원동력되지 압력 진폭이라는 가정을 기반으로합니다. 100 mmHg에서 0 mmHg로 압력을 감소시 20 압력 사이클의 데이터 분석에서 보고된 1.20 ± 0...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5671 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS </td><td> 시그마 </td><td> D5652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mycotic/antibiotic 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Viton의 격막 솔레노이드 밸브 </td><td> 맥매스터 카 </td><td> 4868K11 </td><td></td></tr><tr><td> 압력 변환기 </td><td> 오메가 엔지니어링 주식 회사 </td><td> PX302 - 200GV </td><td></td></tr><tr><td> 로드 셀 컨디셔너 </td><td> 앙코르 전자 주식 회사 </td><td> 4025-101 </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 (DAQ) 모듈 </td><td> 측정 컴퓨팅 </td><td> PMD1608 </td><td></td></tr></tbody></table>

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 vivo</em대동맥 심장 밸브> 학습

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

좌심실과 대동맥 사이에 대동맥 밸브, 뇌실에 역류 방지, 단방향 혈액의 흐름을 허용합니다. 대동맥 밸브 전단지는 세포외 매트릭스 (ECM) 내에 정지 및 내피 세포 monolayer로 채워져 있습니다 침입형 세포로 구성되어 있습니다. 밸브는 거칠고, 역동적인 환경을 withstands하고 지속적으로 전단, 굴곡, 인장 및 압축에 노출됩니다. 연구 내피 중단하거나 중간 매트릭스 손상 1-3의 결과로 높은 기계적 응력 영역에서 발생하는 질병 밸브에 calcific 병변을 보이지 않고있다. 따라서, 그것은 역학 연구 대동맥 밸브 질환 4 발병의 주요 위험 요인으로 고혈압을 보여준 것은 놀라운 일이 아니다. 밸브 질환에 대해 현재 사용할 수있는 유일한 치료 방법은 bioprosthetic 또는 기계적 밸브 5 낡고 밸브의 수술 대신합니다. 물리적 스트레스에 대한 응답으로 밸브 생물학의 개선 이해 밸브 pathogenesis의 메커니즘을 명료하게하다 도움이 될 것이다. 차례로,이 같은 제약 개입이나 방지와 같은 비침습 요법의 개발에 도움을 줄 수 있습니다. 여러 bioreactors는 이전에 다음 ID로 기본 설계 또는 심장 밸브 6-9의 mechanobiology을 연구하기 위해 개발되었습니다. 타악기 bioreactors 또한 연골 10 골 11 방광을 포함하여 12 조직의 범위를 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 작품의 목적은 증가 압력 하중에 대동맥 밸브 전단지의 생물 학적 반응을 명료하게하다하는 데 사용할 수있는 순환 압력 시스템을 개발하는 것이었습니다. 이 시스템은 샘플을 장소와 순환 압력, 압력 사이클의 타이밍을 제어하는​​ viton의 격막 솔레노이드 밸브, 전기 장치를 제어하는​​ 컴퓨터를 생산하는 아크릴 챔버로 구성되어. 압력은 압력 변환기를 사용하여 모니터링할 있었고, 신호는 부하 셀 컨디셔너를 사용하는 시설되었다. LabVIEW 프로그램은 적절한 속도로 시스템에 압축 공기를 펌프하는 아날로그 장치를 사용하여 압력을 규제. 시스템은 대동맥 밸브와 연결된 동적 transvalvular 압력 수준을 했었, 소우 치아 파의 밸브 개방을 묘사한 날카로운 압력 강하 다음 음절 연장 기간 동안 밸브에 걸쳐 존재하는 transvalvular 압력 구배의 전형적인 압력의 점진적 증가, 생산 수축기. LabVIEW 프로그램은 사용자가 주기적 압력의 크기와 주파수를 제어할 수있었습니다. 시스템은 생리와 병리 학적 압력 조건에 조직 샘플을 대상 수있었습니다. 이 장치는 심장 밸브가 로컬 기계 환경의 변화에​​ 대응하는 우리의 이해를 높이기 위해 사용할 수 있습니다.

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

좌심실과 대동맥 사이에 위치한 대동맥판막은 혈액이 한 방향으로만 흐르게 하여 심실로 혈액이 역류하는 것을 방지합니다. 대동맥...

이 절차의 전반적인 목적은 대동맥 판막 조직 또는 세포의 주기적 압력에 대한 생물학적 반응을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 돼지 심장에서 판막 조직을 분리하여 조직 배양 배지에서 하룻밤 동안 배양함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 압력 시스템의 보정 상태를 확인하는 것입니다.판막 조직 또는 세포를 가압 시스템에 넣습니다. 챔버를 37 °C 인큐베이터에 넣고, 원하는 기간 동안 원하는 강도와 빈도로 주기적 가압 체계를 시작합니다. 마지막으로, 생물학적 분석을 위해 조직을 시스템에서 제거합니다.최종적으로, 실시간 PCR, Western blotting 또는 현미경 관찰을 통해 상승된 압력이 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기계적 압력의 효과를 다른 기계적 힘이나 생화학적 자극제와 분리하여 확인할 수 있다는 점입니다. 이는 동물 모델과 같은 다른 기술에 비해 가지는 장점이며, 기계적 힘이 생물학적 기능과 심장 판막의 병인에 영향을 미치는 방식을 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이는 또한 조직 공학 구조물을 개발하는 데 사용될 수 있습니다. 지금 저희를 위해 이 절차를 시연할 사람은 제 실험실의 대학원생인 Toy Fate입니다. 압력 가압을 위한 조직을 준비하겠습니다.연구에서는 체중이 120 pounds 이하인 성체 암퇘지로부터 사후 즉시 대동맥판막을 수집합니다. 판막을 멸균 PBS로 두 번 세척한 후, 얼음에 놓아 실험실로 운반합니다. 이후의 모든 단계는 멸균 조건 하에서 수행해야 합니다.리플렛(leaflets)에 변성, 파열 또는 석회화의 징후가 없는지 확인하십시오. 환상부(annulus)에서 1/3 거리 지점을 절단하여 대동맥근(aortic root)으로부터 리플렛을 제거합니다. 리플렛을 6-웰 플레이트의 개별 웰에 넣고, 1% 항생제-항진균제 용액과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 3 mL와 함께 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오.이 압력 시스템은 주문 제작되었으며, 대동맥 판막 조직에 가해지는 주기적 압력의 기계생물학적 효과를 연구하기 위해 설계되었습니다. 시스템을 사용하려면 컴퓨터에 로그인하고 LabVIEW 프로그램을 실행하십시오. 압축 공기가 시스템에 연결되어 있는지 확인하고 공기 공급 밸브를 완전히 열어 최대 유속으로 설정하십시오.신호 증폭기를 켭니다. 전압 읽기 값이 0.00인지 확인하십시오. 필요에 따라 조정합니다.LabVIEW 인터페이스에는 'test record'라고 표시된 스위치가 있으며, 이 스위치는 'test'로 설정되어 있습니다. 'air supply' 버튼을 클릭하여 입구 솔레노이드 밸브를 엽니다. 가스 압력 조절기를 사용하여 챔버를 1 PS.I의 압축 공기로 가압합니다. 챔버 후면 플레이트에 위치한 디지털 압력계를 사용하여 챔버 내의 압력을 측정합니다.압력이 평형 상태에 도달하면 신호 증폭기에서 전압 측정값을 기록합니다. 2, 3, 4, 5 PSI에 대해서도 동일하게 반복합니다. 그다음 압력 대 전압의 교정 곡선을 작성합니다.압력을 PSI에서 수은 밀리미터(mmHg)로 변환하십시오. 그래프의 방정식을 LabVIEW 프로그램 코드에 입력하십시오. 압력 챔버에서 알루미늄 전면 플레이트를 제거하고 챔버에 70% ethanol을 분무하십시오.리플릿 샘플이 담긴 6-웰 플레이트를 챔버에 넣고 전면 엔드 플레이트를 다시 장착합니다. 4개의 나사산 로드에 위치한 너트를 손으로 조여 밀봉 상태가 기밀한지 확인하십시오. 압력 챔버를 37 °C 인큐베이터에 넣습니다.압축 공기 입력과 출력 사이를 시스템이 순환하는 시간을 입력하십시오. 1Hz의 주파수에서 각각 이완기 및 수축기 조건을 모방하도록 0.6초와 0.4초로 설정해야 합니다. 그런 다음 LabVIEW에 데이터 파일 경로를 입력하십시오.실행(run)을 클릭하고 테스트 기록 토글을 기록(record)으로 전환하십시오. LabView 인터페이스의 그래프를 사용하여 압력이 원하는 수준인지 확인하십시오. 필요한 경우 가스 압력 조절기를 사용하여 압력을 조정하십시오.실험이 완료되면, lab view에서 stop을 클릭하고 공기 공급을 중단한 뒤 압력 챔버의 배기 밸브를 엽니다. 마지막으로 인큐베이터에서 압력 시스템을 꺼냅니다. 그런 다음 챔버에서 전면 엔드 플레이트를 제거하고 6-웰 플레이트를 회수합니다.이제 샘플을 대상으로 유전자 발현, 단백질 발현, 조직학 및 기계적 특성을 분석할 수 있으며, 이는 정상 및 상승된 압력의 압력 파형을 나타냅니다. 시스템에서 얻은 조건들이 여기의 in vivo 조건 하에 표시되어 있습니다. 이완기 동안 좌심실과 상행 대동맥 사이에 압력 차이가 발생하며, 이를 통해 정상적인 생리적 조건에서 대동맥판막이 닫힌 상태를 유지할 수 있습니다.이 판막 횡압은 80 mmHg입니다. 하지만 1단계 및 2단계 고혈압 상태에서는 판막 횡압이 각각 90 mmHg 및 100 mmHg까지 증가할 수 있습니다. 본 압력 시스템은 정상 혈압, 1단계 및 2단계 고혈압 조건에서 관찰되는 최대 판막 횡압을 시뮬레이션할 수 있습니다.시스템에서 얻은 정상 압력 및 고압 상태의 대표적인 압력 파형이 여기에 제시되어 있습니다. 이 절차를 통해 엽(leaflet)에 대해 PCR, 웨스턴 블롯팅 및 현미경 관찰과 같은 다른 분석 방법들을 수행할 수 있습니다. 이는 유전자 발현 및 단백질 합성의 변화와 같은 사항을 파악하는 데 유용하며, 심장 판막의 기계적 신호 전달(mechano transduction) 과정을 이해하는 데 도움을 줍니다.이 기술은 기계 생물학 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 유용했으며, 향후 체내에서 압력 변화를 겪을 수 있는 다른 조직에서 발생하는 변화를 이해하는 데에도 도움이 될 수 있습니다.

design-cyclic-pressure-bioreactor-for-ex-vivo-study-aortic-heart

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

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연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

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대동맥 역류는 대동맥 판막 심장 질환입니다. 이 원고는 네 차원 유동 자기 공명 영상이 대동맥 역류를 모방한 시험관내 심장 판막을 사용하여 대동맥 역류를 평가할 수 있는 방법을 보여줍니다.

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줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

이 프로토콜은 관류 중인 혈관의 체외 배양을 위해 새로 개발된 3D 프린팅 바이오리액터의 설정 및 작동을 제시합니다. 이 시스템은 다른 사용자가 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었으며, 실용적이고 저렴하며 기초 생물학 및 약리학 연구와 같은 다양한 실험 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Ex Vivo (체외 주행) 3D 프린팅 생물반응기에서 큰 혈관의 관류 배양

유체역학적 특성을 테스트하기 위해 펄스 복사기에 돼지 대동맥 판막을 장착하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 대형 동물 모델에 사용하기 전에 실험 절차 또는 새로운 의료 기기를 적용한 후 유체 역학의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

실험적 대동맥 판막 시술 및 새로운 의료 기기의 유체역학 테스트를 위한 생체 외 돼지 모델

에 대한 기계적 적응 고분자 나노 복합 재료의 환경 제어 Microtensile 테스트<em&gt; 생체</em&gt; 특성

학습하세요 순환 압력 생물 반응기를 이용한 대동맥 심장 판막 조직의 기계생물학적 반응 분석 방법을. 이 기술은 판막 질환의 병인 이해와 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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