항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

다음 실험의 전반적인 목표는 DOT 스캔 항체 마이크로어레이를 사용하여 대장암 조직의 표면 항원을 분자적으로 프로파일링하는 것입니다. 또한, 혼합 세포 집단 내에서 특정 프로파일을 가진 세포 유형을 구분하기 위해 형광 멀티플렉싱이 사용됩니다. 분화군 또는 CD 항원은 대장암에서 잠재적인 예후 또는 전이 바이오마커로 확인되었습니다.

이러한 항원들은 종양의 진행이나 다른 세포 유형과의 상호작용에 따라 발현량이 자주 변하기 때문에 이상적인 바이오마커가 됩니다. 본 영상에서는 발현된 표면 항원을 통해 살아있는 세포를 포획하기 위해 DOT scan 항체 마이크로어레이를 사용합니다. DOT scan 항체 마이크로어레이는 니트로셀룰로오스 층이 입혀진 유리 슬라이드로 구성되어 있습니다.

DOT scan 항체 마이크로어레이 패널은 CD 29 및 CD 44로 구성된 정렬점으로 둘러싸여 있습니다. 복제 어레이 또한 어레이의 각 측면에 점 형태로 배치되어 있습니다. 첫 번째 패널은 DOT scan 백혈병 마이크로어레이의 기존 항체 82개로 구성되며, 대장암 위성 마이크로어레이로서 예후 잠재력을 기반으로 선정된 추가 항체 40개가 포함되었습니다.

마지막 패널은 동형 대조군 항체로 구성됩니다. 여기서는 대장암 조직과 정상 장점막을 소화 및 여과하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 이 현탁액은 동결하거나 나중에 사용하기 위해 보관할 수 있습니다.

세포 현탁액은 DOT scan 항체 마이크로어레이의 세포 캡처에 사용되며, 서로 다른 세포 하위 유형에서 발현되는 항원들은 형광 멀티플렉싱을 통해 분석됩니다. 결과적으로 나타난 발현 프로파일은 대장암 세포와 정상 장점막 사이의 항원 발현에서 유의미한 변화를 보여줍니다. 이러한 차이는 종양 관련 백혈구 군집에서도 동일하게 반영됩니다.

여러 종양 프로필의 계층적 군집 분석 결과, 질병 시그니처가 대장암 단계별로 군집화되는 것으로 나타났습니다. 안녕하세요, 호주 시드니 대학교 분자생명과학부의 Jerry입니다. 오늘은 대장암 조직의 표면 항원 프로파일링 실험을 보여드리겠습니다. Dot scan 항체 마이크로어레이와 형광 멀티플렉싱을 이용한 Dot scan 마이크로어레이는 생존 암세포 및 관련 염증성 백혈구의 표면 항원 약 140종에 대한 프로파일링을 가능하게 합니다.

마이크로어레이에 포획된 세포의 하위 집합은 관심 세포에서 높게 발현되는 마커 항원에 결합하는 형광 표지 항체를 사용하여 구별할 수 있습니다. 세 가지 서로 다른 특이성을 가진 항체에 적절한 형광 표지를 사용하면, 단일 마이크로어레이에서 최대 세 가지의 서로 다른 세포 하위 집합을 프로파일링할 수 있습니다. DOT 스캔 마이크로어레이 분석법은 상대적으로 간단한 방법이며, 이미 여러 암종의 세포 표면 프로파일링에 사용되었습니다.

DOT 스캔의 핵심 특징은 표면 항원을 통해 살아있는 세포를 포착할 수 있다는 점이며, 따라서 얻어지는 결합 패턴은 세포 표면 프로파일을 반영합니다. 표면 항원은 종양의 발달 및 전이, 그리고 암에 대항하는 염증 반응에서 중요한 역할을 합니다. 광범위한 표면 프로파일 또는 면역 표현형은 질병의 시그니처로 활용되어 암 분류를 개선함으로써 수술 후 최적의 치료를 가능하게 할 수 있습니다.

이제 시작하겠습니다. 여기 제시된 실험에서는 A등급부터 D등급까지의 임상 대장암 종양 샘플을 Hank's buffer에 수집합니다. 먼저 두 개의 메스를 사용하여 종양을 1 mm 두께의 얇은 조각으로 조심스럽게 절단합니다.

절편을 소화를 위해 2% collagenase type four 및 10% DNA 용액에 넣습니다. 동일한 환자의 원발성 종양 부위에서 10 cm 떨어진 곳의 정상 장 점막 절편을 수집합니다. 이는 대조군으로 사용되며 종양 샘플과 동일하게 처리합니다.

결합 조직의 분해를 촉진하기 위해 37 °C에서 1시간 동안 종양 소화를 진행하며, DNase는 손상된 세포에서 유래한 DNA를 제거합니다. 배양 후, 조직 현탁액을 와이어 메쉬에 통과시키고 샘플 위에 Hanks buffer를 부으며 10 mL 주사기의 플런저를 사용하여 세포가 통과하도록 밀어줍니다. 이 과정을 대부분의 세포가 와이어 메쉬를 통과할 때까지 여러 번 반복합니다.

메시는 세포를 소화되지 않은 결합 조직으로부터 분리합니다. 다음으로, 10 M 주사기로 세포 현탁액을 흡입한 뒤 fcon 200 µm 필터와 fil con 50 µm 필터 순으로 통과시켜 추가로 여과합니다. 이러한 더 세밀한 필터들은 과도한 점액이나 DNA를 제거하고 세포 응집체를 분해하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있도록 합니다.

정상 점막에 대해서도 동일한 처리를 수행합니다. 정상 점막은 결합 조직을 더 많이 포함하는 경향이 있으며, 그 결과 메쉬 원심분리 단계로 넘어가기 위해 더 많은 세척 과정이 필요하다는 것을 확인했습니다. 410 G, 20 °C에서 5분간 세포 현탁액을 원심분리합니다. 냉장 보관을 위해 세포 펠렛을 750 µL의 fetal calf serum으로 현탁한 후, DMS가 포함된 fetal calf serum을 동일한 부피로 추가합니다.

이 DMS에서 용액을 처리합니다. 지속적으로 혼합하면서 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후, 상층액을 크라이오 튜브에 분주하여 단열 용기에 넣습니다. 이 샘플들은 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.

단열 처리와 DMSO는 세포가 파열되지 않고 서서히 해동되도록 합니다. 저장 과정의 부작용으로 적혈구 집단이 용해될 수 있으나, 다행히 이번 실험에서 적혈구는 필요하지 않습니다.

실험을 위해, 보관 중인 샘플을 꺼내어 빠르게 처리합니다. 37 °C 항온수조에서 세포 현탁액을 10 mL의 Hank's buffer로 재현탁하며, 이때 버퍼는 10% DMSO와 fetal calf serum을 희석하는 역할을 합니다. 이후 20 °C에서 410 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다.

다음으로, 상층액을 따라내고 500 µL의 Hank's buffer에 재현탁합니다. 동결 및 해동 과정 중에 일부 세포가 파괴되어 현탁액으로 DNA가 방출될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 시료를 0.1% DNAs와 함께 실온에서 배양합니다. 이 시간 동안 세포 생존율 측정(cell viability count)을 수행할 수 있습니다.

triam blue와 세포 현탁액 10 µL를 동일한 양으로 혼합한 후, 혼합액 10 µL를 세포 계수기에 피펫으로 분주합니다. 현미경으로 관찰했을 때, 건강하고 생존 가능한 세포는 투명하게 나타납니다. 반면, 세포막이 파괴되어 생존 불가능한 세포는 파란색으로 나타납니다.

DOT scan 항체 상의 세포 포획을 위해 최소 400만 개의 생존 세포가 필요합니다. MICRORAY 침강. DNA 처리를 위해 Hank's buffer 10 mL로 세포를 다시 한번 세척하고, 20 °C에서 410 G로 5분 동안 원심분리합니다.

최종 세포 펠렛을 200 µL의 RPMI 배지로 부유시킵니다. 이 배지는 Hanks 완충액보다 영양분이 상대적으로 더 많이 포함되어 있으며, 세포 생존력을 유지하면서 항체 마이크로어레이에서 세포 포획을 용이하게 하는 데 사용됩니다. 대장암 도트 스캔 항체 마이크로어레이는 니트로셀룰로오스 상에 중복 배치된 140가지의 서로 다른 항체 도트로 구성되어 있습니다.

어레이의 각 도트에는 세포 표면 항원에 대한 단클론 항체 10 nanoliters가 포함되어 있습니다. 항체 마이크로어레이를 준비하려면, PBS가 담긴 트레이에 담가 니트로셀룰로오스를 적신 후 어레이의 유리 가장자리를 닦아냅니다. Kim wipes를 사용하여 니트로셀룰로오스 부분이 닿지 않도록 주의하며, 마이크로어레이를 트레이에 놓고 니트로셀룰로오스 위에 세포 현탁액을 피펫으로 분주합니다.

세포 현탁액을 고르게 도포하면 모든 항체가 세포를 포집할 수 있는 상태가 됩니다. 마이크로어레이를 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 과정 동안 서로 다른 세포들이 아래로 내려가 어레이 세포 상의 항체와 접촉하게 됩니다.

항체에 상응하는 표면 항원을 제시하는 세포는 배양 후 결합하여 포획됩니다. 어레이를 신선한 PPS 용액에 세 번 가볍게 담가 결합되지 않은 세포를 세척합니다. 10% 포르말린과 PPS 용액으로 결합된 세포를 고정합니다.

고정액을 충분한 양으로 취해 니트로 셀 로드 섹션을 덮도록 조심스럽게 피펫팅합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그다음, 마이크로어레이를 신선한 PBS에 세 번 담급니다.

과도한 포머 높이는 형광 멀티플렉싱을 방해할 수 있으므로, 각 세척 단계마다 어레이를 PBS에 30초 동안 담가둡니다. 이제 마이크로어레이를 빛에 비추어 확인함으로써 세포 결합 여부를 훨씬 더 정밀하게 분석할 수 있습니다. DOT 스캔 스캐너와 분석 소프트웨어를 사용하면 결합 패턴을 스캔하여 혼합 세포 집단 내 항원 발현의 정량적 결과를 도출할 수 있습니다.

소프트웨어는 8비트 그레이스케일(grainer scale)을 사용하여 배경 노이즈 대비 세포 결합 강도를 비교합니다. 강도 단위는 최대값 256으로 정규화됩니다. 어레이 간의 비교를 용이하게 하기 위해, 양성 아이소타입 대조군(ice type control) 결합 값은 해당 IG 아이소타입의 항체 값에서 차감됩니다.

마이크로어레이에 블로킹 버퍼 200 µL를 첨가하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 형광 멀티플렉싱 준비를 위해, 블로킹 버퍼 118 µL에 Fiery 및 conjugated CD3 10 µL와 Alexa conjugated epam 20 µL를 첨가합니다. 또한, 비특이적 결합을 방지하기 위해 열 불활성화 혈청 2 µL를 혼합물에 첨가합니다.

블로킹이 완료되면 블로킹 버퍼를 멀티플렉싱 용액으로 교체하고 암실에서 30분 동안 배양합니다. 실온 배양 중에 CD3 접합 항체는 어레이에 결합된 CD3 발현 T 세포에 결합하며, EPAM 접합 항체는 어레이 상의 상피 세포 또는 대장암 세포에 결합합니다. 다음으로, 마이크로어레이를 신선한 PBS로 3회 세척하고, 형광 스캔 전 암실에서 건조시킵니다.

Typhoon FLA 9,000 스캐너로 형광을 검출합니다. FICO ery 프로파일은 523 nanometer 레이저와 580 BP 30 방출 필터를 사용하여 스캔하며, Alexa 647은 633 nanometer 레이저와 670 BP 30 방출 필터를 사용하여 스캔합니다. 얻어진 형광 이미지는 분석을 위해 tif 형식으로 변환합니다.

DOT 스캔 소프트웨어를 사용합니다. 형광 다중 분석을 통해 동일한 조직 샘플 내에서 서로 다른 세포 집단의 항원 프로파일을 구별할 수 있습니다. 여기에 표시된 이미지는 대장암 샘플에서 얻은 것입니다.

이 세 개의 이미지는 광학 스캔, CD3 발현 세포의 형광 스캔, 그리고 EpCAM 발현 세포의 형광 스캔 결과입니다. DOT 스캔 마이크로어레이 결과는 두 개의 중복 슬라이드 간에 일관된 세포 결합 패턴을 보여야 합니다. 슬라이드 가장자리를 따라 강한 정렬 도트 결합이 나타나는 것은 충분한 양의 세포가 포집되었음을 나타냅니다.

세포 결합의 정량적 값을 제공하기 위해 PDF 보고서를 생성할 수 있습니다. 막대 그래프는 정상 점막과 종양 샘플 간의 항원 발현 차이를 보여줍니다.

광학 결과는 샘플 내 모든 세포 유형의 항원 발현에 대한 전반적인 표현을 제공하는 반면, AAM 멀티플렉싱 결과는 정상 상피 세포와 암세포 간의 항원 발현 차이를 더 명확하게 보여줍니다. 차등 발현된 많은 항원들이 집단적으로는 알려진 대장암 바이오마커들이지만, 이들은 단일 바이오마커가 달성할 수 있는 것보다 훨씬 더 정확한 층화용 질병 시그니처를 제공합니다. CD3 멀티플렉싱 결과는 정상 샘플에 비해 암 샘플에서 더 많은 T 세포가 있음을 보여줍니다.

암 T 세포는 흔히 활성화 마커를 발현하며, 이는 해당 T 세포가 종양 침윤 림프구 또는 염증 관련 T 세포일 가능성을 시사합니다. 대규모 분석은 오픈 소스 히트맵 및 데이터 분석 소프트웨어인 multi experiment viewer version 4.4를 통해 수행할 수 있습니다. 대장암 샘플의 계층적 군집 분석을 통해 질병 단계 또는 환자의 예후와의 상관관계를 분석할 수 있습니다.

광범위한 질병 시그니처 라이브러리는 대장암 환자의 예후 예측이나 수술 후 치료 과정의 결정에 있어 매우 가치 있는 도구입니다. 본 영상에서는 DOT scan 항체 마이크로어레이와 형광 다중 분석법을 이용하여 대장암 조직 내 혼합 세포 집단의 표면 항원 발현을 프로파일링하는 절차를 살펴보았습니다. 이 실험에서 기억해야 할 중요한 점은 항상 신선한 조직을 사용해야 하며, 실험이 성공적으로 진행되기 위해서는 최소 400만 개의 생존 세포가 필요하다는 것입니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.