Name: 항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 17 s
Description: 배우세요 대장암 조직의 세포 표면 단백질 프로파일링 방법을 DOT scan 항체 마이크로어레이와 형광 멀티플렉싱을 사용하여. 이 기술은 생존 가능한 단일 세포를 포착하고 CD 항원을 분석하여 예후 바이오마커를 식별하는 데 활용됩니다.

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우리는 로얄 프린스 알프레드와 CRC와 정상적인 장 점막의 신선한 샘플 수집에 대한 콩코드 송환 병원의 해부 병리학 연구소에서 직원을 감사드립니다. 작품은 암 연구소 뉴사우스 웨일즈 Translational 프로그램 권한 부여에 의해 투자되었다.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> CRC의 수술 표본에서 살고 세포 현탁액의 준비를 위해 그림 1. 워크플로우. 1. 임상 샘플 disaggregation 모든 샘플은 프로토콜 번호 X08 - 164 아래의 정보를 동의를 얻어 로얄 프린스 알프레드 병원 (Camperdown, NSW, 호주)과 콩코드 송환 병원 (콩코드 웨스트, NSW, 호주)에서 수집되었다. <ol><li> 신선한 대장암 (CRC) 또는 adenoma의 표본, 그리고 정상적인 창자 점막 종양에서 적어도 10cm를 수집합니다. 절제술 후 최대 12 H 4에서 행크의 균형 소금 솔루션 산도 7.3 (HBSS) ° C에서 저장 샘플. </li><li> 생물 학적 안전 캐비닛 클래스 II의 모든 임상 샘플 처리, 인간의 병원체에 대한 안전 규정을 따르십시오. 이 메스 블레이드를 사용하여 배양 접시에있는 2mm 큐브에 샘플을 해부하다. </li><li> 37 60 분 가끔 부드러운 혼합 별도의 Eppendorf 튜브에 종양과 정상 조직을 품어 ° 2% (V / V) collagenase 타입 4 (워싱턴, 레이크 우드, 뉴저지, 미국)와 0.1이 포함된 RPMI 1640 배지의 동일한 볼륨 C 소 pancrease에서 % (W / V) deoxyribonuclease I (DNAse I, 시그마 - 올드 리치). </li><li> 포스 10 ML의 주사기에서 플런저를 사용하여 미세 와이어 메쉬 스트레이너를 통해 조직을 준 소화, HBSS로 세척을 통해 세포. </li><li> 셀 집계를 제거 200 μm의 50 μm의 Filcon 필터 (BD Biosciences)를 통해 세포 현탁액을 결과 전달합니다. DNA, 점액 및 세포 집계의 대부분은 filtrations이 시리즈 제거됩니다. </li><li> 5 분 20 °에서 400 XG에서 세포 정지를 원심 분리기. </li><li> 10% 디메틸 sulphoxide (DMSO)를 포함하는 열 inactivated FCS에서 Resuspend 세포 산탄은 -80 °에서 cryovials과 가게에서 천천히 냉동. 동결 과정은 샘플에서 점액을 감소하는 경향과 적혈구를 lyses. </li></ol> 2. 세포 캡처를위한 샘플 준비 <ol><li> DMSO를 씻어 HBSS 10 ML에서 37 ° 물 욕조, resuspend 세포에 신속하게 샘플을 좀 녹여. </li><li> 5 분 20 °에서 410 XG에서 세포 정지를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다하고 HBSS 500 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 0.1 % (W / V) 실온에서 20 분 DNAse I로 샘플을 처리합니다. </li><li> trypan 파랑의 동일한 볼륨 각 세포 현탁액의 10 μL를 혼합하고 hemocytometer로 혼합 10 μL를로드합니다. 죽은 세포는 염료를 차지하면서 100 배 배율에서 가벼운 현미경을 사용하여, trypan 파랑 배제로 인해 명확한 표시 가능한 세포를 계산합니다. 최소 4 X 10 6 유력한 세포는 microarray에 셀 캡처가 필요합니다. </li><li> DNAse 처리 다음, 5 분 20 °에서 410 XG 10 ML HBSS와 원심 분리기의 세포 현탁액을 resuspend. </li><li> 200 μL의 최종 볼륨 RPMI 1640에서 supernatants 및 resuspend 세포 알약을 가만히 따르다. </li></ol> 3. 항체 microarray 셀 캡처 <ol><li> 인산염로 nitrocellulose 섹션을 찍기로 DotScan 항체 microarray를 축축하게하다하면 약 20 S.위한 식염수 (PBS)를 버퍼 조심스럽게 nitrocellulose 섹션을 감동 피하고, 접힌 Kimwipes와 microarray의 유리 가장자리를 닦으십시오. </li><li> 습기 챔버를 제공하기 위해 microarray 보육 트레이에 물을 추가합니다. 챔버에 microarray를 놓고 젖은 nitrocellulose 섹션에 RPMI 1640에 세포 현탁액을 피펫. 피펫은 심지어 세포의 확산하기 위해 nitrocellulose의 각 모서리에 방울. </li><li> 1 H.위한 37 ° C에서 microarrays를 품어 배양은 세포의 microarray에 대한 항체와 접촉에 정착하여 올 수 있습니다. 그들은에 착륙 항체에 해당하는 표면 항원을 표현 전지 캡처됩니다. </li><li> 부화 후, 언바운드 세포 (씻어 당 20의) 씻어 최소 15 ML PBS를 포함하는 세 골짜기로 부드럽게 수직 microarrays을 찍어. </li><li> 교차 연결하여 세포와 항체를 해결하기 위해 3.7 % (W / V) PBS에 포름 알데히드를 준비합니다. 부드럽게 microarray의 nitrocellulose 부분을 충당하기 위해 약 1 ML을 피펫. 상온 20 분 알을 품다. </li><li> 다음 딥 microarrays PBS (15 ML, 30의 각) 3 변화에 초과하는 포름 알데히드를 씻어 수 있습니다. </li><li> 가장자리와 Kimwipes있는 유리 슬라이드 다시 닦으하고 DotScan 스캐너 동안을 사용하여 microarray를 스캔, nitrocellulose 섹션 촉촉한입니다. 광학 스캔 혼합 세포 인구 예 : CRC 세포, leukocytes 및 종양의 다른 stromal 세포의 항원 표현 패턴을 제공합니다. </li></ol> 4. 멀티플렉싱 형광 <ol><li> 스캐너에서 microarray를 제거하고 차단 버퍼 (2 % W / V BSA, 2퍼센트 열 inactivated 인간 AB 묘약, PBS, pH를 7.3) 200 μL를 적용합니다. 20 분 상온에서 microarray 트레이에 품어. </li><li> multip 준비(Biolegend, 10 μL 알렉사 형석 647 - 안티 EpCAM, 20 μL Phycoerythrin - 안티 인 경우에는 3 번 CD (1/7.5 최종 희석 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, Gladesville, NSW, 호주, # IM12824) : 알루미늄 호일로 덮여 Eppendorf 튜브에 솔루션을 lexing 샌디에이고, CA, 미국, 15분의 1 희석), 열 inactivated 인간 AB 혈청 (시그마 - 올드 리치, 성 힐, NSW, 호주)와 차단 버퍼 118 μL 2 μL. </li><li> microarray에서 초과 차단 버퍼를 배수하고 균일하게 확산, nitrocellulose 섹션에 멀티플렉싱 솔루션을 피펫. 상온에서 어두운 곳에 30 분 알을 품다. </li><li> 세로 15 ML 신선한 PBS의 세 골짜기로 microarray를 찍어, (30의 각). </li><li> 4 어둡고 저장소에있는 microarrays가 건조 해 ° 슬라이드 상자에 C. microarray는 형광의 손실없이 최대 3 개월 동안 어둠에 저장할 수 있습니다. </li><li> 50 설정된 해상도 태풍 FLA 9000 스캐너 (GE 헬스케어, Rydalmere, NSW, 호주)를 사용하여 건조 microarray 스캔 (532 nm의 레이저, PE에 대한 580 BP30 방출 필터를. 알렉사 647에 대한 633 NM 레이저와 670 BP30 방출 필터). microarrays은 유리 스캐너 트레이에서 아래쪽으로 직면하고있는 nitrocellulose 측면과 함께 스캔됩니다. </li><li> 17 TIFF 파일과 같은 형광 이미지를 사용하여 포토샵 설정 이미지 크기를 저장하는 것은 X 25cm와 해상도 72 픽셀 / cm합니다. 점들의 강도를 분석하는 DotScan 분석 소프트웨어로 이미지를 가져옵니다. </li><li> DotReader는 점 바인딩 패턴의 디지털 이미지를 캡처하고 8 비트 greyness 규모 (1-256 U) 각 항체 점에서 셀 바인딩의 밀도를 quantifies. 수시 아닌 특정 isotype 컨트롤 바인딩이 해당 면역 글로불린과 항체 isotypes에 대한 구속력이 값에서 빼는되었습니다. 각 microarray에 대한 점 형광 농도 100 %의 강도로 설정 밝은 점에 대한 정상화되었습니다. 신호 / 현장 강도. xml 파일 (원시 데이터)에 기록된 또는에서 막대 차트로 표시했습니다. pdf 파일 (최종 보고서) </li><li> Microarray heatsmaps 및 계층적 클러스터링은 TM4 Microarray 소프트웨어 스위트 (에서 MultiExperiment 뷰어 (MeV) 버전 4.4을 사용하여 수행되었다 <a href="http://www.tm4.org/mev.html">http://www.tm4.org/mev.html</a> ). 계층적 클러스터링은 전체 연동 분석 MeV를 사용하여 배경 - 조정 데이터에서 수행되었다. 유클리드 거리는 유사성 측정을 위해 사용되었다. 동일한 분산과 함께 2 꼬리 학생의 T - 테스트 결과의 통계적 중요성을 결정하는 데 사용되었다. </li></ol> 5. 대표 결과 : DotScan의 microarray의 결과는 중복 배열 사이의 일관성을 셀 바인딩 패턴을 표시합니다. 강력한 정렬 도트 바인딩 (CD44/CD29)는 배열의 영역에 배치 될 수있는 격자 수 있습니다. 그림 2는 최적의 세포 캡처 및 멀티플렉싱의 예를 보여줍니다. 그림 3은 세포 캡처 및 가능한 해결 방법 중에 발생한 몇 가지 일반적인 문제를 보여줍니다. microarray 셀 바인딩 결과는 1부터 256까지 greyness 규모에 표현 점 농도를 측정하여 계량하실 수 있습니다. 그림 4는 계층 클러스터링과 히트맵로 EpCAM - 알렉사 647 항체 물들일 58 수술 CRC 샘플에서 수치 데이터를 나타냅니다. 샘플의 수가 제한에도 불구하고, 동일한 단계 CRCs 같은 그룹에 클러스터하는 경향이있다. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 임상 대장암 종양 (호주 클리닉 - 병적 스테이징, ACP 단계 B1)의 세포 결합 패턴. 중복 microarray (설명)의 왼쪽 절반 항체의 위치를​​ 보여주는 (A) DotScan 항체 키. 상단 부분 DotScan의 백혈병 microarray의 원래 82 항체가 포함되어 있습니다. 특정 표면 항원에 해당하는 추가 정보는 40 항체는 CRC '위성'microarray으로 추가되었습니다, 문학에 - 규제로 발견했습니다. 아래 섹션 isotype 제어 항체 microarray에 바인딩 CRC 세포 (B) 광학 이미지로 구성되어 있습니다. T - 세포를 보여주는 (C) 인 경우에는 3 번 CD의 형광 이미지. CRC 세포를 보여주는 (D) EpCAM 형광 이미지. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 가난한 DotScan 결과와 가능한 해결 방법의 예. (A) 낮은 셀 바인딩, 솔루션 :; 최소화하기 위해 microarray에 부화하기 전에 샘플로 열 inactivated 인간 AB 혈청을 추가 솔루션 적어도 4x106 가능한 세포 (B) 바인딩 Isotype 컨트롤 바인딩이 아닌 특정 세포가 배열에 있는지 확인하십시오 isotype 제어 바인딩. 때때로, nitrocellulose에 세포가 아닌 특정 바인딩의 작은 금액은 CRC 샘플 발생하고 훨씬 결과에 영향을주지 않습니다. (C) Nitrocellulose이 부화하는 동안 밖으로 건조, 솔루션 : 예제는 전체 nitrocellulose 섹션을 포함하고 microarray는 평평한 표면에 incubated 있는지 확인하십시오. (D) 높은 배경 유물, 솔루션 :을 보장microarray는 철저하게 다음과 부화를 씻어입니다. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. DotScan 분석 소프트웨어는 1에서 256까지 greyness 규모 셀 바인딩 밀도를 나타내는 막대 차트를 생성. 축의 숫자는 CD 항원을 참조하십시오. κ, λ, 면역 글로불린 라이트 체인,, 시그마, 표면 면역 글로불린, DCC, 대장암 단백질의 삭제, EGFR, 표피 성장 인자 수용체, FAP, fibroblast 활성화 단백질, HLA - A, B, 기타 약어는 TCR, T - 세포 수용체 아르 A, B, C 각각 C HLA - DR, 인간 백혈구 항원 DR과, 운모, MHC 클래스 I 체인과 관련된 단백질, MMP - 14, 매트릭스 metallopeptidase 14, PIGR, 고분자 면역 글로불린 수용체, TSP - 1, thrombospondin - 1; Mabthera, humanised 안티 CD20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3322/3322fig4large.jpg">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에서는, 우리는 DotScan 항체 microarray는 CRC 조직의 세포 집단을위한 표면 항원 프로필을 연구하기위한 간단한 세미 양적 방법으로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 에너지 종속 프로세스 (예 : 항원이 상한 및 / 또는 pseudopodia 형성) 보육시 항체 점들에 전체 세포의 회사 바인딩에 필요한 것으로 나타납니다 때문에 조직에서 가능한 단일 세포 현탁액 구하기, 실험의 성공에 중요 죽은 세포는 그 후에 씻어하는 동안. 1 형 collagenase가 처음 조직 disaggregation8에 대한 고용했지만, 그것이 적은 테아제 오염 물질로 세포 점막에 덜 손상을 collagenase 4로 대체되었다. 이 변경 사항은 휴대폰 생산량, 생존 또는 바인딩 패턴에 영향을주지 않았다. 일부 종양 및 제어 샘플에서 점액이 세포 수율 감소하고 세포 캡처 방해. 점액이 끈적 거림은 -80 10 % DMSO / FCS에 disaggregated 세포 현탁액 ° C...

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j.zhou@uws.edu.au
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jzho7551@mail.usyd.edu.au

Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H6136 - 10X1L </td><td> 25 MM Hepes (시그마 # H3375)와 버퍼 </td></tr><tr><td> Airpure 생물 학적 안전 캐비닛 클래스 II </td><td> 웨스팅 하우스 </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 블레이드 </td><td> 리빙스톤 </td><td> 090609 </td><td> 100 팩 </td></tr><tr><td> 이 MM Hepes와 RPMI 1640 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R4130 - 10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 유형 4 </td><td> 워싱턴 </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease 1 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> DN25 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo 주사기 (10 ML) </td><td> Terumo </td><td> SS 10 L </td><td> 100 박스 </td></tr><tr><td> Filcon 필터 (200 μm의) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon 필터 (50 μm의) </td><td> Filcon 필터 (50 μm의) </td><td> Filcon 필터 (50 μm의) Filcon 필터 (50 μm의) 340603 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> 5810 R을 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 sulphoxide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan 파랑 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> Hirschmann </td><td> 사용할 수 없습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 라이트 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 니콘 TMS </td><td></td></tr><tr><td> Cyrovial 튜브 </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo의 동결 contrainer </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan 항체 microarray 키트 </td><td> Medsaic </td><td> 사용할 수 없습니다 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan microarray 페인트 트레이 </td><td> Medsaic </td><td> 사용할 수 없습니다 </td><td></td></tr><tr><td> KimWipes </td><td> 킴벌리 - 클락 </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> 37% 포름 알데히드 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> F1635 - 500ML </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> 사용할 수 없습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A9418 - 10G </td><td></td></tr><tr><td> 열 inactivated AB 혈청 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Phycoerythrin - 복합 인 경우에는 3 번 CD에 들어 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647 - 복합 EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> 태풍 FLA 9000 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9558-08 </td><td> 532 NM 레이저, PE에 대한 580 BP30 방출 필터. 633 NM 레이저와 Alexa647에 대한 670 BP30 방출 필터 </td></tr><tr><td> MultiExperiment 뷰어 v4.4 </td><td> TM4 Microarray 소프트웨어 스위트 </td><td> 오픈 - 소스 소프트웨어 (참조 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

항체 microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

CRC의 현재 예측과 분류 histopathologic 및 임상 결과를 통합하는 시스템을 준비에 의존합니다. 그러나, CRC 케이스의 대다수에서, 세포 기능 장애는 단백질 표현과 사후 translational 수정 수정 1 수많은 돌연변이의 결과이다. 차별화 (CD) 항원의 클러스터를 포함하여 세포 표면 항원,의 숫자 CRC 잠재적인 전조 또는 전이성 생체으로 확인되었습니다. 이러한 항원들은 종종 자신의 표현으로 종양의 진행이나 ​​다른 세포 유형, 같은과 상호 작용과 변화를 이상적인 생체를 종양 - 침투 lymphocytes (TILs)와 종양 - 관련 macrophages (리버 탐)를. 암 하위 분류와 예지를위한 immunohistochemistry (IHC)의 사용은 물론 일부 종양 유형 2,3에 대해 설정됩니다. 그러나, 하나의 &#39;표지&#39;는 clinico - 병적인 준비 이상의 전조 중요성을 표시하거나 모든 CRC 케이스의 일상 병리보고에 사용하기 위해 광범위한 수용을 받고있다. 질병 phenotypes의 전조 충화에 더 최근의 접근 방법은 여러 &#39;표시&#39;를 사용하는 표면 단백질 프로파일에 의존합니다. 같은 iTRAQ로 proteomic 기술을 이용하여 종양의 표현 프로 파일링이 biomarkers4의 발견을위한 강력한 도구이지만, 그것은 진단 실험실에서 일상적인 사용을위한 최적되지 않고 혼합 인구의 서로 다른 세포 유형을 구분할 수 없습니다. 또한, 종양 조직의 대량는 이러한 방법으로 정화 플라즈마 막 glycoproteins의 프로파일이 필요합니다. 이 비디오에서 우리는 DotScan CRC의 항체 microarray를 사용하여 disaggregated CRC 샘플에서 가능한 세포의 표면 프로테옴 프로 파일링위한 간단한 방법을 설명했다. 122 - 항체 microarray는 CRC 40 잠재적인 전조 마커의 검출을위한 위성 지역과 함께 혈통 특정 백혈구 마커, 접착 분자, 수용체 및 염증 및 면역 반응 5 마커의 범위를 인식 표준 82 - 항체 영역으로 구성되어 있습니다 . 세포는 그들이 해당 항원을 표현하는 항체에 캡처됩니다. 광학 스캔에 의해 결정 점 당 세포 밀도, 그 항원, 항체 6 항원과 친화력의 표현의 수준을 표현하는 세포의 비율을 반영합니다. CRC 조직이나 정상적인 창자 점막 들어, 광학 스캔은 세포의 혼합 인구의 immunophenotype을 반영합니다. 형광 멀티플렉싱은 다음 배열에 캡처 관심 세포의 선택된 하위 인구 프로파일에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 알렉사 647 - 안티 상피 세포 유착 분자 (EpCAM, CD326)는 Phycoerythrin - 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어, 사용하는 동안, CRC 세포뿐만 아니라 정상적인 창자 점막의 상피 세포를 감지하는 데 사용한 냄비 - 상피 분화 항원이다 T - 세포 7 침투 감지합니다. DotScan CRC microarray는 해부학적인 몸의 구조 기반 CRC의 준비 시스템 진단 대안에 대한 프로토 타입을해야합니다.

그러면 표면 항원 (DotScan CRC microarray)를 인식 맞춤 항체 microarrays에 캡처되어 가능한 단일 세포를 생산하는 대장암 (CRC)의 disaggregation에 대한 절차를 설명했다. microarray에 바인딩된 세포의 하위 인구는 형​​광 염료와 태그 단클론 항체를 사용하여 형광 멀티플렉싱하여 프로파일 수 있습니다.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

현재 대장암(CRC)의 예후 판정과 분류는 조직병리학적 소견과 임상적 소견을 통합한 병기 결정 시스템에 의존하고 있습니다. 하지만 대다수의...

다음 실험의 전반적인 목표는 DOT 스캔 항체 마이크로어레이를 사용하여 대장암 조직의 표면 항원을 분자적으로 프로파일링하는 것입니다. 또한, 혼합 세포 집단 내에서 특정 프로파일을 가진 세포 유형을 구분하기 위해 형광 멀티플렉싱이 사용됩니다. 분화군 또는 CD 항원은 대장암에서 잠재적인 예후 또는 전이 바이오마커로 확인되었습니다.이러한 항원들은 종양의 진행이나 다른 세포 유형과의 상호작용에 따라 발현량이 자주 변하기 때문에 이상적인 바이오마커가 됩니다. 본 영상에서는 발현된 표면 항원을 통해 살아있는 세포를 포획하기 위해 DOT scan 항체 마이크로어레이를 사용합니다. DOT scan 항체 마이크로어레이는 니트로셀룰로오스 층이 입혀진 유리 슬라이드로 구성되어 있습니다.DOT scan 항체 마이크로어레이 패널은 CD 29 및 CD 44로 구성된 정렬점으로 둘러싸여 있습니다. 복제 어레이 또한 어레이의 각 측면에 점 형태로 배치되어 있습니다. 첫 번째 패널은 DOT scan 백혈병 마이크로어레이의 기존 항체 82개로 구성되며, 대장암 위성 마이크로어레이로서 예후 잠재력을 기반으로 선정된 추가 항체 40개가 포함되었습니다.마지막 패널은 동형 대조군 항체로 구성됩니다. 여기서는 대장암 조직과 정상 장점막을 소화 및 여과하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 이 현탁액은 동결하거나 나중에 사용하기 위해 보관할 수 있습니다.세포 현탁액은 DOT scan 항체 마이크로어레이의 세포 캡처에 사용되며, 서로 다른 세포 하위 유형에서 발현되는 항원들은 형광 멀티플렉싱을 통해 분석됩니다. 결과적으로 나타난 발현 프로파일은 대장암 세포와 정상 장점막 사이의 항원 발현에서 유의미한 변화를 보여줍니다. 이러한 차이는 종양 관련 백혈구 군집에서도 동일하게 반영됩니다.여러 종양 프로필의 계층적 군집 분석 결과, 질병 시그니처가 대장암 단계별로 군집화되는 것으로 나타났습니다. 안녕하세요, 호주 시드니 대학교 분자생명과학부의 Jerry입니다. 오늘은 대장암 조직의 표면 항원 프로파일링 실험을 보여드리겠습니다. Dot scan 항체 마이크로어레이와 형광 멀티플렉싱을 이용한 Dot scan 마이크로어레이는 생존 암세포 및 관련 염증성 백혈구의 표면 항원 약 140종에 대한 프로파일링을 가능하게 합니다.마이크로어레이에 포획된 세포의 하위 집합은 관심 세포에서 높게 발현되는 마커 항원에 결합하는 형광 표지 항체를 사용하여 구별할 수 있습니다. 세 가지 서로 다른 특이성을 가진 항체에 적절한 형광 표지를 사용하면, 단일 마이크로어레이에서 최대 세 가지의 서로 다른 세포 하위 집합을 프로파일링할 수 있습니다. DOT 스캔 마이크로어레이 분석법은 상대적으로 간단한 방법이며, 이미 여러 암종의 세포 표면 프로파일링에 사용되었습니다.DOT 스캔의 핵심 특징은 표면 항원을 통해 살아있는 세포를 포착할 수 있다는 점이며, 따라서 얻어지는 결합 패턴은 세포 표면 프로파일을 반영합니다. 표면 항원은 종양의 발달 및 전이, 그리고 암에 대항하는 염증 반응에서 중요한 역할을 합니다. 광범위한 표면 프로파일 또는 면역 표현형은 질병의 시그니처로 활용되어 암 분류를 개선함으로써 수술 후 최적의 치료를 가능하게 할 수 있습니다.이제 시작하겠습니다. 여기 제시된 실험에서는 A등급부터 D등급까지의 임상 대장암 종양 샘플을 Hank's buffer에 수집합니다. 먼저 두 개의 메스를 사용하여 종양을 1 mm 두께의 얇은 조각으로 조심스럽게 절단합니다.절편을 소화를 위해 2% collagenase type four 및 10% DNA 용액에 넣습니다. 동일한 환자의 원발성 종양 부위에서 10 cm 떨어진 곳의 정상 장 점막 절편을 수집합니다. 이는 대조군으로 사용되며 종양 샘플과 동일하게 처리합니다.결합 조직의 분해를 촉진하기 위해 37 °C에서 1시간 동안 종양 소화를 진행하며, DNase는 손상된 세포에서 유래한 DNA를 제거합니다. 배양 후, 조직 현탁액을 와이어 메쉬에 통과시키고 샘플 위에 Hanks buffer를 부으며 10 mL 주사기의 플런저를 사용하여 세포가 통과하도록 밀어줍니다. 이 과정을 대부분의 세포가 와이어 메쉬를 통과할 때까지 여러 번 반복합니다.메시는 세포를 소화되지 않은 결합 조직으로부터 분리합니다. 다음으로, 10 M 주사기로 세포 현탁액을 흡입한 뒤 fcon 200 µm 필터와 fil con 50 µm 필터 순으로 통과시켜 추가로 여과합니다. 이러한 더 세밀한 필터들은 과도한 점액이나 DNA를 제거하고 세포 응집체를 분해하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있도록 합니다.정상 점막에 대해서도 동일한 처리를 수행합니다. 정상 점막은 결합 조직을 더 많이 포함하는 경향이 있으며, 그 결과 메쉬 원심분리 단계로 넘어가기 위해 더 많은 세척 과정이 필요하다는 것을 확인했습니다. 410 G, 20 °C에서 5분간 세포 현탁액을 원심분리합니다. 냉장 보관을 위해 세포 펠렛을 750 µL의 fetal calf serum으로 현탁한 후, DMS가 포함된 fetal calf serum을 동일한 부피로 추가합니다.이 DMS에서 용액을 처리합니다. 지속적으로 혼합하면서 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후, 상층액을 크라이오 튜브에 분주하여 단열 용기에 넣습니다. 이 샘플들은 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.단열 처리와 DMSO는 세포가 파열되지 않고 서서히 해동되도록 합니다. 저장 과정의 부작용으로 적혈구 집단이 용해될 수 있으나, 다행히 이번 실험에서 적혈구는 필요하지 않습니다.실험을 위해, 보관 중인 샘플을 꺼내어 빠르게 처리합니다. 37 °C 항온수조에서 세포 현탁액을 10 mL의 Hank's buffer로 재현탁하며, 이때 버퍼는 10% DMSO와 fetal calf serum을 희석하는 역할을 합니다. 이후 20 °C에서 410 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다.다음으로, 상층액을 따라내고 500 µL의 Hank's buffer에 재현탁합니다. 동결 및 해동 과정 중에 일부 세포가 파괴되어 현탁액으로 DNA가 방출될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 시료를 0.1% DNAs와 함께 실온에서 배양합니다. 이 시간 동안 세포 생존율 측정(cell viability count)을 수행할 수 있습니다.triam blue와 세포 현탁액 10 µL를 동일한 양으로 혼합한 후, 혼합액 10 µL를 세포 계수기에 피펫으로 분주합니다. 현미경으로 관찰했을 때, 건강하고 생존 가능한 세포는 투명하게 나타납니다. 반면, 세포막이 파괴되어 생존 불가능한 세포는 파란색으로 나타납니다.DOT scan 항체 상의 세포 포획을 위해 최소 400만 개의 생존 세포가 필요합니다. MICRORAY 침강. DNA 처리를 위해 Hank's buffer 10 mL로 세포를 다시 한번 세척하고, 20 °C에서 410 G로 5분 동안 원심분리합니다.최종 세포 펠렛을 200 µL의 RPMI 배지로 부유시킵니다. 이 배지는 Hanks 완충액보다 영양분이 상대적으로 더 많이 포함되어 있으며, 세포 생존력을 유지하면서 항체 마이크로어레이에서 세포 포획을 용이하게 하는 데 사용됩니다. 대장암 도트 스캔 항체 마이크로어레이는 니트로셀룰로오스 상에 중복 배치된 140가지의 서로 다른 항체 도트로 구성되어 있습니다.어레이의 각 도트에는 세포 표면 항원에 대한 단클론 항체 10 nanoliters가 포함되어 있습니다. 항체 마이크로어레이를 준비하려면, PBS가 담긴 트레이에 담가 니트로셀룰로오스를 적신 후 어레이의 유리 가장자리를 닦아냅니다. Kim wipes를 사용하여 니트로셀룰로오스 부분이 닿지 않도록 주의하며, 마이크로어레이를 트레이에 놓고 니트로셀룰로오스 위에 세포 현탁액을 피펫으로 분주합니다.세포 현탁액을 고르게 도포하면 모든 항체가 세포를 포집할 수 있는 상태가 됩니다. 마이크로어레이를 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 과정 동안 서로 다른 세포들이 아래로 내려가 어레이 세포 상의 항체와 접촉하게 됩니다.항체에 상응하는 표면 항원을 제시하는 세포는 배양 후 결합하여 포획됩니다. 어레이를 신선한 PPS 용액에 세 번 가볍게 담가 결합되지 않은 세포를 세척합니다. 10% 포르말린과 PPS 용액으로 결합된 세포를 고정합니다.고정액을 충분한 양으로 취해 니트로 셀 로드 섹션을 덮도록 조심스럽게 피펫팅합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그다음, 마이크로어레이를 신선한 PBS에 세 번 담급니다.과도한 포머 높이는 형광 멀티플렉싱을 방해할 수 있으므로, 각 세척 단계마다 어레이를 PBS에 30초 동안 담가둡니다. 이제 마이크로어레이를 빛에 비추어 확인함으로써 세포 결합 여부를 훨씬 더 정밀하게 분석할 수 있습니다. DOT 스캔 스캐너와 분석 소프트웨어를 사용하면 결합 패턴을 스캔하여 혼합 세포 집단 내 항원 발현의 정량적 결과를 도출할 수 있습니다.소프트웨어는 8비트 그레이스케일(grainer scale)을 사용하여 배경 노이즈 대비 세포 결합 강도를 비교합니다. 강도 단위는 최대값 256으로 정규화됩니다. 어레이 간의 비교를 용이하게 하기 위해, 양성 아이소타입 대조군(ice type control) 결합 값은 해당 IG 아이소타입의 항체 값에서 차감됩니다.마이크로어레이에 블로킹 버퍼 200 µL를 첨가하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 형광 멀티플렉싱 준비를 위해, 블로킹 버퍼 118 µL에 Fiery 및 conjugated CD3 10 µL와 Alexa conjugated epam 20 µL를 첨가합니다. 또한, 비특이적 결합을 방지하기 위해 열 불활성화 혈청 2 µL를 혼합물에 첨가합니다.블로킹이 완료되면 블로킹 버퍼를 멀티플렉싱 용액으로 교체하고 암실에서 30분 동안 배양합니다. 실온 배양 중에 CD3 접합 항체는 어레이에 결합된 CD3 발현 T 세포에 결합하며, EPAM 접합 항체는 어레이 상의 상피 세포 또는 대장암 세포에 결합합니다. 다음으로, 마이크로어레이를 신선한 PBS로 3회 세척하고, 형광 스캔 전 암실에서 건조시킵니다.Typhoon FLA 9,000 스캐너로 형광을 검출합니다. FICO ery 프로파일은 523 nanometer 레이저와 580 BP 30 방출 필터를 사용하여 스캔하며, Alexa 647은 633 nanometer 레이저와 670 BP 30 방출 필터를 사용하여 스캔합니다. 얻어진 형광 이미지는 분석을 위해 tif 형식으로 변환합니다.DOT 스캔 소프트웨어를 사용합니다. 형광 다중 분석을 통해 동일한 조직 샘플 내에서 서로 다른 세포 집단의 항원 프로파일을 구별할 수 있습니다. 여기에 표시된 이미지는 대장암 샘플에서 얻은 것입니다.이 세 개의 이미지는 광학 스캔, CD3 발현 세포의 형광 스캔, 그리고 EpCAM 발현 세포의 형광 스캔 결과입니다. DOT 스캔 마이크로어레이 결과는 두 개의 중복 슬라이드 간에 일관된 세포 결합 패턴을 보여야 합니다. 슬라이드 가장자리를 따라 강한 정렬 도트 결합이 나타나는 것은 충분한 양의 세포가 포집되었음을 나타냅니다.세포 결합의 정량적 값을 제공하기 위해 PDF 보고서를 생성할 수 있습니다. 막대 그래프는 정상 점막과 종양 샘플 간의 항원 발현 차이를 보여줍니다.광학 결과는 샘플 내 모든 세포 유형의 항원 발현에 대한 전반적인 표현을 제공하는 반면, AAM 멀티플렉싱 결과는 정상 상피 세포와 암세포 간의 항원 발현 차이를 더 명확하게 보여줍니다. 차등 발현된 많은 항원들이 집단적으로는 알려진 대장암 바이오마커들이지만, 이들은 단일 바이오마커가 달성할 수 있는 것보다 훨씬 더 정확한 층화용 질병 시그니처를 제공합니다. CD3 멀티플렉싱 결과는 정상 샘플에 비해 암 샘플에서 더 많은 T 세포가 있음을 보여줍니다.암 T 세포는 흔히 활성화 마커를 발현하며, 이는 해당 T 세포가 종양 침윤 림프구 또는 염증 관련 T 세포일 가능성을 시사합니다. 대규모 분석은 오픈 소스 히트맵 및 데이터 분석 소프트웨어인 multi experiment viewer version 4.4를 통해 수행할 수 있습니다. 대장암 샘플의 계층적 군집 분석을 통해 질병 단계 또는 환자의 예후와의 상관관계를 분석할 수 있습니다.광범위한 질병 시그니처 라이브러리는 대장암 환자의 예후 예측이나 수술 후 치료 과정의 결정에 있어 매우 가치 있는 도구입니다. 본 영상에서는 DOT scan 항체 마이크로어레이와 형광 다중 분석법을 이용하여 대장암 조직 내 혼합 세포 집단의 표면 항원 발현을 프로파일링하는 절차를 살펴보았습니다. 이 실험에서 기억해야 할 중요한 점은 항상 신선한 조직을 사용해야 하며, 실험이 성공적으로 진행되기 위해서는 최소 400만 개의 생존 세포가 필요하다는 것입니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

이 비디오는 특정 유전자 발현을 측정하기 위해 항체 마이크로어레이를 사용하여 miRNA 형질 주입된 폐암 세포의 단백질 발현을 연구하는 기술을 설명합니다. 특색지어진 프로토콜에서는 세포 주기 및 혈관 신생을 중단하는 데 있어 조합 miRNA 치료의 활성 식별을 위해 항체 마이크로어레이를 수행합니다.

항체 마이크로어레이: miRNA 처리된 폐암 세포의 단백질 발현을 연구하는 기술

이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.

고밀도 바코드 항체 마이크로 어레이의 흐름 패턴 가이드 제작

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

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배우세요 대장암 조직의 세포 표면 단백질 프로파일링 방법을 DOT scan 항체 마이크로어레이와 형광 멀티플렉싱을 사용하여. 이 기술은 생존 가능한 단일 세포를 포착하고 CD 항원을 분석하여 예후 바이오마커를 식별하는 데 활용됩니다.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

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