TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 3차원 환경에서 TGF 베타 유도 침입의 잠재적 조절자의 효과를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 세포의 스페로이드를 만들어 달성됩니다. 그런 다음 PHE는 3D 환경을 제공하는 콜라겐에 내장됩니다.

다음으로, 침입 영역을 정량화합니다. TGF 베타 유도 침입에 대한 치료 효과를 결정하기 위해, 결과는 TGF-베타 경로의 조절제가 3D 콜라겐 매트릭스에서 스테로이드의 침습적 특성에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. scratch ass 에세이와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 3D 환경을 더 잘 요약한다는 것입니다.

이 방법은 교사 베타 유도 침입에 관여하는 새로운 유전자의 식별과 같은 T 미터 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. TGF 베타 유도 침입 분석을 위한 메틸 세포 용액을 준비하려면 먼저 자기 교반이 포함된 500ml 병에 6g의 메틸셀룰로오스를 고압멸균하는 것으로 시작합니다. 미리 데워진 D-M-E-M-F 12의 250 밀리리터에 있는 메틸셀룰로오스를 20 분 동안 녹이고십시오, 4 섭씨 온도에 10%horse 혈청 믹스를 밤새 포함하는 실내 온도 D-M-E-M-F 12의 250 밀리리터를 다음날 4 섭씨 온도에 2 시간 동안 5, 000 G에 원심 분리에 의하여 해결책을 맑게 하십시오.

투명하고 점도가 높은 용액을 phe를 배양하는 데 사용할 때까지 섭씨 4도의 새 튜브 저장소로 옮깁니다. 준비된 메틸 세포 스톡 10ml와 성장량 40ml를 사용하여 20% 메틸 세포 용액을 준비합니다. MCF 10 A 세포를 PBS로 2회 중간 세척합니다.

0.1%트립신을 첨가하고 모든 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 세포를 10 밀리리터, 성장 배지에 재현탁시키고 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 10의 현탁액, 20%methyl 세포에 있는 milliliter 당 000의 세포를 준비하십시오.

각 테스트 조건에 대해 100마이크로리터의 셀 현탁액을 96웰 원형 바닥 서스펜션 플레이트의 12웰에 추가합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 세포를 밤새 배양하고 이산화탄소를 5%로 배양합니다. 다음날 스페로이드 형성을 확인합니다.

스페로이드는 1-3일 이내에 사용할 수 있습니다. 얼음 위에 콜라겐 8ml, 10XPBS 1ml, 0.1 일반 수산화나트륨 1ml, 0.1 일반 염산 3방울 용액을 준비합니다. 용액의 pH가 7.4인지 pH 지시 스트립에 표시하여 확인합니다.

범위를 벗어난 경우 pH를 조정하십시오. 50 마이크로리터의 중화 콜라겐 용액을 96 Well 플레이트의 웰에 첨가하고 섭씨 37도에서 약 90분 동안 또는 콜라겐이 응고될 때까지 배양합니다. 테스트할 각 리간드에 대해 얼음 위에 메틸 세포 콜라겐 리간드 용액을 준비합니다.

트리트먼트당 1ml의 콜라겐 용액으로 시작하여 20 나노그램의 TGF 베타를 추가하여 볼텍싱에 의해 혼합된 밀리리터당 5나노그램의 최종 농도를 만듭니다. 그런 다음 1 밀리리터의 메틸 셀 용액을 추가하여 2 밀리리터와 와류의 최종 부피를 만듭니다. 다시 스테로이드를 삽입하려면 200 마이크로 리터 피펫 팁을 배치하십시오.이 팁은 200 마이크로 리터 피펫에서 5 밀리미터 이상이 잘렸습니다.

그런 다음 피펫으로 하나의 스페로이드를 취합니다. 매체를 빈 플레이트에 조심스럽게 분배하면서 S 스페로이드가 팁 내부에 유지되도록 합니다. 플런저를 놓지 마십시오.

콜라겐 메틸 세포 혼합물 100마이크로리터를 흡수하고 S 스페로이드 콜라겐 혼합물을 96의 콜라겐 코팅 웰에 분배합니다. 웰 플레이트는 각 조건에 대해 12개의 웰을 채웁니다. 콜라겐이 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 응고되도록 하고 200마이크로리터 팁으로 기포를 제거합니다.

1.6% 호스 혈청을 함유한 D-M-E-M-F 12 1밀리리터에 SB 4 31 542 원액 4마이크로리터를 첨가하여 TGF 베타 억제제 SB 4 31 542의 40 마이크로몰 용액을 준비합니다. 확산 후 각 웰에 억제제가 있는 배지 50마이크로리터를 추가합니다. 억제제의 최종 농도는 10마이크로몰입니다.

40배 배율을 사용하여 현미경으로 스테로이드 사진을 찍은 다음 섭씨 37도와 5% 이산화탄소의 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 2 일간의 배양 후, 다시 사진을 찍고 Adobe Photoshop에서 스페로이드 사진을 열어 침입 스테로이드의 면적을 측정합니다. Extended(확장)를 클릭하고 빠른 선택 도구를 선택합니다.

마우스 포인터가 더하기 기호가 있는 원으로 바뀌고 커서를 회전 타원체 위로 드래그합니다. 소프트웨어는 스페로이드의 경계를 인식합니다. 스테로이드 바깥쪽의 영역을 선택한 경우 Alt 키를 누르거나 도구 모음에서 음수 기호인 음수 선택 도구를 사용하여 영역을 제외합니다.

잘못 선택한 영역 위로 커서를 드래그하면 소프트웨어가 선택 항목에서 해당 영역을 제거합니다. 스페로이드 내의 영역을 선택 취소하면 Shift 바를 누른 상태에서 드래그하여 영역을 다시 포함할 수 있습니다. 보다 정확하게 작업하려면 도구 모음에서 브러시 직경을 변경하여 마우스 포인터의 크기를 조정하십시오.

모든 활성 선택 영역의 영역을 계산하려면 메뉴 모음에서 분석 측정값을 선택합니다. 측정 기록 창이 나타나 파일 이름과 선택 영역을 픽셀 단위로 표시합니다. 하나의 스페로이드 내에서 여러 선택 항목을 측정한 경우 첫 번째 줄에는 모든 영역과 아래 선의 합이 표시됩니다.

개별 선택 항목의 값이 나열됩니다. 데이터를 텍스트 파일로 내보내고 Excel에서 엽니다. MCF 10 A 1, 정상 유방 상피 세포를 사용한 S 스페로이드 분석의 예는 MCF 10 A neo T 세포 및 M 2 개의 유래 MCF 10 CA 1 A를 형질전환시켰다.

M1 세포는 자극 없이 약한 침입만을 보였으나, TGF beta에 의한 자극 후에는 현저히 더 잘 침입하였다. 대조적으로, RA는 자극을 추가하지 않고 효율적으로 침습한 M1 유도체 M 2를 변형시켰으며, 이는 4배에서 5배까지 더 증가했다. TGF 베타 처리 후, M 4개의 세포는 TGF 베타 에디션이 없는 세포와 함께 가장 강력한 침입을 보였습니다.

본 실험에 대한 결과의 그래픽 표현은 포토샵(Photoshop)을 사용하여 얻어졌으며, 본 실시예에 도시되어 있으며, SB 4 31 5 42 A TP TGF 베타 수용체 1의 키나아제 활성의 유사체 및 선택적 억제제뿐만 아니라, 유형 B 수용체에서 활성이며 키나아제 7과 같은 수용체에서 활성인 SB 4 31 5 42를 세포 배양에 첨가하고, 강력하게 억제된 TGF 베타는 M1, M 2 및 M 4 세포의 침입을 유도했으며, 이는 TGF-베타 유도 침입이 TGF-베타 수용체 1 키나아제 의존성을 나타냅니다. 또한, PHE의 기저 침입이 강력하게 억제되었다. 이 실험의 결과를 그래픽으로 표현한 것은 Photoshop을 사용하여 다시 만들어졌으며 여기에 나와 있습니다.

이 절차에 따라 RNA 분리 또는 단백질 분리와 같은 다른 방법을 수행하여 어떤 유전자가 발현되는지 또는 어떤 단백질이 발현되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 타비타 유도 침입의 새로운 조절제를 찾는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.