Name: TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 MCF10A 세포주를 이용한 3차원 콜라겐 젤에서 TGF-β 유발 침략을 정량적으로 측정하는 회전 타원체 분석법입니다. 이 방법은 유방암 진행 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 세포 라인을위한 시약 및 프레드 밀러 (바바라 앤 Karmanos 암 Intitute, 디트로이트, 미국)의 켄 이와타 (OSI 제약, 뉴욕, 미국)에게 감사하고 있습니다.

1. methocel 솔루션의 준비 (500 ML) <ol><li> 자기 활동가를 포함한 500 ML 병에 메틸 셀룰로오스의 압력솥 6g. </li><li> 20 분에 대한 혈청 (60 ° C)없이 preheated DMEM/F12 250 ML에 메틸 셀룰로오스를 분해. </li><li> 10 % 말 혈청을 포함하는 DMEM/F12 (RT) 250 ML을 추가합니다. 믹스 하룻밤 (4 ° C). </li><li> 원심 분리 (5천그램, 2 시간, 4 ° C)의 솔루션을 취소합니다. </li><li> 새로운 튜브 (재고 솔루션의 9​​0-95 % 정도)에 명확한 높은 점성 솔루션을 가져가라. </li><li> 4 저장 ° C까지 사용. </li></ol> 2. 회전 타원체 문화 <ol><li> 20 % methocel 솔루션 (10 ML methocel 40 ML 성장 매체) 준비. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻어, 37에서 0.1 %의 트립신과 부화 세포를 추가 ° C </li><li> 성장 매체 세포를 Resuspend하고 세포를 계산합니다. </li><li> 20 % methocel에서 ML 당 10 000 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 96 잘 둥근 바닥의에 세포 현탁액을 추가uspension 플레이트 (물론 당 100 μl). </li><li> 다음날, 서스펜션 플레이트의 회전 타원체 형성을 확인합니다. Spheroids 1-3 일 후에 사용할 준비가됩니다. </li></ol> 3. 콜라겐의 준비 <ol><li> 얼음 8 ML의 콜라겐, 1 ML 10X PBS, 1 ML 0.1 N NaOH 3 방울 0.1 N HCL의 솔루션을 준비합니다. 산도가 산도 표시기 스트립에있는 솔루션의 일부를 야생으로 7.4 있는지 확인하십시오. 인지 범위의 산도를 조정합니다. </li><li> 96 잘 접시의 우물에 무력화 콜라겐 솔루션 50 μl 추가 </li><li> 37 품어 ° C 콜라겐이 (90 분) 확정되기 전까지. </li><li> 얼음 methocel - 콜라겐 - 리간드 솔루션을 준비 : 콜라겐 솔루션의 각 리간드 피펫 한 부분. 콜라겐 TGF - β의 20 NG 당 ML을 추가합니다. 다른 레이어 위에 methocel 및 확산과 희석 후 TGF - β의 최종 농도 5 NG / vortexing에 의해 ML 믹스 것입니다. methocel - 솔루션의 한 부분을 추가합니다. vortexing하여 섞는다. </li></ol> 4. 회전 타원체 포함땡땡 <ol><li> 200 μl 피펫에, 팁 잘라 약 5mm가 200 μl 팁을 놓으십시오. 피펫 한 회전 타원체를 빨아 조심스럽게 빈 접시에 매체를 분배. 회전 타원체의 팁 내부 좋다면보세요. 회전 타원체는 흰색 점으로 표시됩니다. 플런저를 발표하지 않고, 100 μl 콜라겐 - methocel 혼합물을 빨아하고 콜라겐 - 코팅 잘 96에 콜라겐 혼합에있는 회전 타원체를 분배. 각각의 조건 12 spheroids에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 콜라겐, 37 적어도 30 분 응고하자 ° C </li><li> 200 μl 팁과 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 1.6 %의 혈청 및 DMSO에 녹아있는 저해제와 중간의 50 μl를 추가합니다. SB - 431542에 대한 재고 솔루션을 4 μl (10 ㎜) 중간 1 ML로 추가합니다. 확산 후 억제제의 최종 농도는 10 μm의 것입니다. TGF - β와 억제제는 실험의 과정을 계속합니다. 40X 배율을 사용하여 현미경 spheroids 사진을 가져가라. </li><li> 사 후TGF - β 및 / 또는 억제제와 자극의 8h는 40X 배율을 이용하여 현미경 spheroids의 사진을 찍을. </li><li> 이일 후에 침해 spheroids의 영역을 측정하고 시작 영역을 뺍니다. 의 영역을 측정 회전 타원체 : 어도비 포토샵 확장 (그림 2A)의 회전 타원체의 사진과 빠른 선택 도구 (그림 2B)을 선택 엽니다. '플러스'(+) 기호 (그림 2C)와 동그라미에 마우스 포인터가 변경됩니다. 회전 타원체 위에 커서를 드래그하는 동안 포토샵은 회전 타원체의 경계를 인식합니다. (-) 도구 모음에서 로그인 회전 타원체 외부 영역을 선택한 경우,이 지역은 Alt 키를 눌러 또는로 표시됩니다 부정적인 선택 도구를 사용하여 선택에서 제외시킬 수 있습니다. (-) '마이너스'로 동그라미에 커서 변경 서명하고 잘못 선택한 영역 위로 커서를 드래그하여,이 지역은 선택 (그림 2D)에서 제거됩니다. 필요한 여러 영역 쉬를 눌러 선택할 수있다면ift의 버튼을 클릭합니다. 더 정확하게 해결하려면 마우스 포인터의 크기는 도구 모음에서 브러쉬 직경 (그림 2E)을 변경하여 조정할 수 있습니다. 전체 회전 타원체를 선택하면, 선택 영역은 메뉴 막대에 분석 법안을 통해 또는 Ctrl + Shift + M (그림 2F)를 눌러 계산됩니다. 측정 기록 창에 파일 이름과 픽셀 선택 영역뿐만 아니라 다른 데이터 (그림 2G)를 보여주는 표시됩니다. 여러 선택이 측정하는 경우, 첫 번째 라인은 모든 영역의 합계를 보여줍니다. 개인 선택의 측정은 아래 라인에 제공됩니다. 모든 측정 데이터는 텍스트 파일에 수출 및 Excel에서 열 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : MCF10A1 (M1) 정상 유방 상피 세포와 회전 타원체 분석의 예를 들어 H - RAS는 MCF10AneoT (M2) 세포를 변환하고 M2 - 파생 MCF10CA1a (M4)는 그림 3에 있습니다. M1 세포없이 오직 약한 침략를 보여주자극하지만, 상당히 침공 TGF - β로 자극에 더. 대조적으로, M2는 자극의 추가없이 효율적으로 이미 침략 M1 - 유도체 RAS - 변환, 그리고 이것은 더 TGF - β 치료시 4-5 배 증가했다. M4 세포 모두와 TGF - β 이외없이 강한 침공을 보여주었다. 다음, 우리는 화학 억제제를 사용하여이 회전 타원체 모델에서 TGF - β - 유발 침공에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사했다. 이러한 목적을 위해 우리는 SB - 431542, ATP의 아날로그 및 TβRI의 키나제 활동의 선택적 억제제뿐만 아니라, activin 유형 IB 수용체 (ActRIB)와 activin 키나제와 같은 수용체 (하시죠) 7 12를 사용합니다. 예상했던대로, SB - 431542는 potently M1의 TGF - β - 유발 침공, 그 TGF - β - 유발 침략을 나타내는 M2와 M4 세포 (그림 4), TβRI - 키나제 저해 종속됩니다. 또한, spheroids의 기초 침공도 강하게 저해했다, 그 기저 침공을 제안하는 데 또한TGF - β에 늘어뜨린. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 3D 회전 타원체 분석의 그림 1. 플로우 차트. 첫째, 세포는 U - 모양의 정지 플레이트에서 비 점착 성의 조건 하에서 도금입니다. 세포는 multcellular spheroids에 aggregrate과 콜라겐 매트릭스에 삽입하실 수 있습니다. 이 콜라겐 매트릭스에, 그들은 침략 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 어도비 포토샵을 사용하여 spheroids의 지역의 부량가 확장. (A) 회전 타원체의 그림을 사용하여 wongly 포함된 영역의 회전 타원체 (D) 제거 영역을 선택 회전 타원체 위에 커서를 드래그 빠른 선택 도구 어도비 포토샵 Extendend (B) 선택 (C)에서 열립니다 더 정확하게 영역을 선택하는 빠른 선택 도구의 브러쉬 크기의 부정적인 빠른 선택 도구 (E) 조정 (F)가 선택측정 명령 (G) 측정 기록의 예를 기록합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 저절로 불후의 MCF10A1 (M1) (A)의 spheroids의 TGF - β - 유발 침공, MCF10AneoT (M2 (B) 및 전이성 파생 MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2와 M4 spheroids는 임베디드 RAS - 변환 표시된로 콜라겐으로 48h에 대한 TGF - β의 5ng/ml로 치료했다. AC 대표 사진 포함의 하루 촬영하고 이틀 후. D 상대 공격이 2 일 마이너스 일 0에 지역 차이로 계량되었습니다. 결과 표현 같은 의미 ± SD 13에서 적응. <img alt="그림 4a" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4A"> <img alt="그림 4b" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4B"> 그림 4. 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 및 TGF - β - 유도된 회전 타원체의 침공은 B를 저해합니다Y SB - 431542. M1, M2와 M4 spheroids은 콜라겐에 포함하고 5ng/ml TGF - β 및 표시 등 / 또는 10 μm의 SB - 431542로 치료했다. 이일 (A) 이후에 촬영한 대표 사진. 상대 침공은 2 일 마이너스 일 0 (B)에 지역 차이로 계량되었습니다. 결과는 말은 ± SD 13에서 적응으로 표현됩니다.

<ol><li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li>
<li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+TGF-%CE%B21+and+TGF-%CE%B2+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li>
<li>Sheen-Chen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Surg%22%5BJournal%5D)">Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer.</a> Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).</li>
<li>ten Dijke, P., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+TGF-%CE%B2-Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">New insights into TGF-β-Smad signaling.</a> Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).</li>
<li>Moustakas, A., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Smad+TGF-%CE%B2+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-Smad TGF-β signals.</a> J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).</li>
<li>Soule, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+human+breast+epithelial+cell+line%2C+MCF-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10.</a> Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).</li>
<li>Strickland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+premalignant+MCF10AT+generates+heterogeneous+malignant+variants+with+characteristic+histologic+types+and+immunohistochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers.</a> Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).</li>
<li>Santner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+multicellular-mediated+resistance+to+alkylating+agents+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).</li>
<li>Inman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-b+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).</li>
<li>Wiercinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSmad+pathway+induces+breast+cancer+cell+invasion+through+the+up-regulation+of+matrix+metalloproteinase+2+and+9+in+a+spheroid+invasion+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system.</a> Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).</li>
<li>Tang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC. Med. 6, 11-11 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).</li>
<li>Lee, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).</li>
<li>Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> 30, 256-256 (2011).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-Activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> 10, 314-314 (2011).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌하지 않습니다.

우리는 MCF10A1 세포와 악성 유도체는 TGF - β - 의존적으로 콜라겐 매트릭스에 침공하는 회전 타원체 모델을 설립했습니다. 첫째, spheroids은 메틸 셀룰로오스의 면전에서 96 우물 원형 바닥 서스펜션 플레이트를 형성하고 있습니다. 물론, 또한 U - 모양의 폴리 - HEMA 코팅 플레이트는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있습니다. 세포 메틸 셀룰로오스의 부재에 죽을 이후 메틸 셀룰로오스는 절대적으로,이 단계에서 필요합니다. 우리는 세포가이 요소는 콜라겐의 매체 조합 톱에 추가되었을 때 TGF - β에 덜 잘 반응 것을 발견 이후 TGF - β는 콜라겐 - methocel 혼합물에 직접 추가됩니다. DMSO는 icecold 콜라겐 - methocel 혼합물에 precipitates 이후 그러나, 그것은 콜라겐에 직접적인 원인은 아니 DMSO에 녹아있는 화학 억제제를 추가하는 것이 좋습니다. 따라서, 우리는 콜라겐 위에 매체에서 이러한 화합물을 추가합니다. 그 후...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 메틸 셀룰로오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> 고급 Biomatrix </td><td> 5005 - B </td><td></td></tr><tr><td> 산도 표시기 스트립 </td><td> 머크 </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 정지 접시 </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> TC 접착 96 - 웰 접시 </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

tgf - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF - β는 초기 단계에서 종양 억제 역할을하지만, 나중에 무대 1,2에서 침략과 전이를 자극하여 유방암의 진행에서 역할을 반대했다. 또한, TGF - β가 자주 유방암에 overexpressed과 그 표현이 불쌍한 예후와 전이 3,4와 상호입니다. TGF - β 유도의 공격을 잘 이해하지하는 메커니즘. TGF - β는 TGF - β 타입 II (TβRII)와 유형 I (TβRI) 수용체를 통해 세포의 반응을 elicits. TGF - β - 유발 heteromeric 복잡한 형성되면, TβRII는 TβRI을 phosphorylates. 활성 TβRI는 phosphorylating 수용체 Smads (R - Smads), 즉 Smad2 및 Smad3하여 세포내 표준 신호 경로를 시작합니다. 이러한 활성 R - Smads는 핵에 축적하고 목표 유전자 5 전사를 조절 Smad4와 heteromeric 단지를 형성하고 있습니다. 이전에 D 이외에escribed Smad 경로, 여러 비 Smad 신호 경로의 활성화에 수용체 활성화 결과가 예를 들어 Mitogen는 단백질 키나제를 활성화하면 (MAPK) 경로 6. 유방암의 여러 단계에서 TGF - β의 역할을 연구하기 위해, 우리는 MCF10A 전지 시스템을 사용했다. 이 시스템은 자발적으로 남을 MCF10A1 (M1) 유방 상피 세포를 7로 구성되어, H - RAS는 생쥐 8 premalignant 병변을 생산 M1 - 파생 MCF10AneoT (M2), 그리고에서 설립되었습니다 M2 - 파생 MCF10CA1a (M4)를 변형 M2 xenografts 및 양식 폐 9 전이하는 능력을 가지고 고급 carcinomas. 이 MCF10A 시리즈는 다른 유전 배경에 의해 편견없는 강한 악의의 다른 성적 세포의 반응을 연구하기위한 가능성을 제공합니다. TGF - β - 유발 침략의 분석을 위해, 우리는 homotypic MCF10A 회전 타원체 셀 문화 embe를 생성시험 관내 (그림 1)에서 3D 콜라겐 매트릭스에 dded. 이러한 모델은 밀접하게 회전 타원체 10 내부에 괴사성도 외부와 정지 또는 세포에 대한 활성화 및 침입 세포의 결과로, 산소와 영양소의 그라데이션을 확립하여 생체내 인간의 종양과 유사. 회전 타원체 기반 assays는 monolayer 문화 11 이상의 약물 저항을 잘 요점을 되풀이하는 표시되었습니다. 이 MCF10 3D 모델 시스템은 우리가 강한 악의의 다른 단계에서 유방암 세포의 침투 특성에 TGF - β 신호의 영향을 조사 수있었습니다.

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

TGF-β는 초기 단계에서는 종양 억제제로 작용하지만, 이후 침습과 전이를 촉진함으로써 유방암 진행 과정에서 상반된 역할을 수행합니다...

다음 실험의 전체적인 목표는 3차원 환경에서 TGF beta에 의해 유도된 침습의 잠재적 조절 인자들이 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 세포의 스페로이드를 형성함으로써 달성됩니다. 이후 PHE를 콜라겐에 매립하여 3D 환경을 제공합니다.다음으로, 침습 영역을 정량화합니다. TGF beta로 유도된 침습에 대한 처리 효과를 결정하기 위해, TGF-beta 경로의 조절제가 3D 콜라겐 매트릭스 내 스테로이드의 침습 특성에 영향을 미친다는 결과를 보여줍니다. 스크래치 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 3D 환경을 더 잘 재현한다는 것입니다.이 방법은 TGF-beta 유도 침습에 관여하는 새로운 유전자의 식별과 같은 T-meter 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. TGF-beta 유도 침습 분석을 위한 메틸셀룰로오스 용액을 준비하려면, 마그네틱 바가 들어 있는 500 mL 병에 Methylcellulose 6 g을 넣고 오토클레이브 멸균하는 것으로 시작하십시오. 예열된 serum-free D-M-E-M-F 12 250 mL에 Methylcellulose를 넣고 20분 동안 용해시킨 후, 10% horse serum이 함유된 상온의 D-M-E-M-F 12 250 mL를 추가하여 4 °C에서 하룻밤 동안 혼합하십시오. 다음 날, 4 °C에서 5,000 ×g로 2시간 동안 원심분리하여 용액을 맑게 정제하십시오.투명하고 점도가 높은 용액을 새 튜브로 옮겨 4 °C에서 보관하며 phe 배양 시까지 유지합니다. 준비된 methyl cell 스톡 10 mL와 성장 배지 40 mL를 사용하여 20% methyl cell 용액을 준비합니다. MCF 10 A 세포를 PBS로 두 번 세척합니다.0.1% trypsin을 첨가하고 모든 세포가 떨어져 나올 때까지 37 °C에서 배양합니다. 세포를 10 mL의 성장 배지에 재부유시키고, 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 20% methyl cell에서 mL당 10,000개의 세포가 포함된 현탁액을 준비합니다.각 테스트 조건에 대해, 96-웰 라운드 바텀 서스펜션 플레이트의 12개 웰에 세포 현탁액 100 µL를 첨가하십시오. 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 스페로이드 형성 여부를 확인하십시오.스페로이드는 1~3일 이내에 사용 가능한 상태가 됩니다. 얼음 위에서

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Guyon, J., et al. 교모세포종에 대한 3D 스페로이드 모델. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 종양 세포 침입의 3차원 스페로이드 모델의 생성을 보여줍니다. 스페로이드는 인간의 뇌종양 세포에서 형성되며 콜라겐 매트릭스에 내장되어 있습니다. 스페로이드 말초의 종양 세포는 침습적 표현형을 채택하여 프로테아제를 분비하여 콜라겐을 분해하고 전진하여 주변 기질을 침범합니다.

종양세포 침입의 3차원 스페로이드 모델 생성

복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

종양 미세 환경은 암 성장과 침략의 필수적인 부분입니다. 암의 진행을 모방 하기 위해 생물학적으로 관련 된 인간 매트릭스가 필요 합니다. 이 프로토콜은 인간 평활 근 종 기반 매트릭스를 적용 하 여 시험관 내 3 차원 세 포스 페 로이드 침입 검정에 대 한 개선을 도입 한다. 이 프로토콜은 또한 컴퓨터 기반 세포 침입 분석을 소개 합니다.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

침습은 암의 발병과 진행에 있어 중요한 생물학적 현상입니다. 이 과정은 비종양 세포와 종양 미세환경의 구성 요소에 의해 영향을 받습니다. 이 연구의 목적은 3차원(3D) 배양을 사용하여 종양 세포 침입을 in vitro 분석하는 대체 방법을 설명하는 것입니다.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

여기에서는 3차원(3D) 콜라겐 I 매트릭스에서 1차 인간 단핵구 유래 대식세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 조사하기 위한 프로토콜을 제시하며, 미세환경의 용해성 및 물리적 특성이 세포 침입에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

학습하세요 MCF10A 세포주를 이용한 3차원 콜라겐 젤에서 TGF-β 유발 침략을 정량적으로 측정하는 회전 타원체 분석법입니다. 이 방법은 유방암 진행 메커니즘 연구에 활용됩니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

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