3'UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

이 실험 절차의 전반적인 목표는 리포터 컨스트럭트와 micro RNA mimic을 공동 형질전환하여 human 3' UTR 내의 예측된 micro RNA 표적을 검증하는 것입니다. 이는 먼저 세포주 선택, micro RNA mimic 선정, 그리고 실험군 및 대조군 3' UTR GoClone 리포터 컨스트럭트 선택을 포함한 실험 설계를 통해 이루어집니다. 그 다음, 형질전환 약 24시간 전에 부착 세포를 배양합니다. 이어지는 단계에서는 각 실험군 또는 대조군 3' UTR GoClone 리포터 컨스트럭트를 micro RNA mimic 또는 비표적 대조군과 공동 형질전환한 후, 24~48시간 동안 배양합니다. 마지막 단계로, LightSwitch luciferase assay 시약을 세포 및 배양액에 직접 첨가하고 플레이트 루미노미터(plate luminometer)를 통해 발광 신호를 측정합니다.

최종적으로 리포터 분석 기술을 이용한 루시퍼레이스 신호 감소 측정을 통해 특정 microRNA의 표적이 되는 인간 3' UTR을 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 살아있는 세포 내에서 예측된 microRNA 3' UTR 표적 상호작용을 검증하는 기능적 분석법을 제공하므로 microRNA 연구자들의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 설계는 적절한 고효율 형질전환 부착성 세포주를 선택하는 것으로 시작하며, microRNA mimic 기반 분석은 해당 microRNA의 내인성 발현 수준이 낮은 세포주에서 가장 효과적으로 작동합니다.

그런 다음 micro RNA mimic과 non-target control 쌍을 선택하십시오. 플라스미드와 소형 RNA oligo를 함께 형질전환하면 플라스미드만 형질전환했을 때보다 신호가 낮아지므로 non-target control을 포함하는 것이 중요합니다. 다음으로, Switchgear의 genome-wide collection에서 pre-clone 3' UTR Go Clone 리포터 컨스트럭트를 선택하십시오. 온라인 카탈로그로 이동하여 UTR 검색 버튼을 클릭하십시오.

유전자 이름, 유전자 기호 또는 액세션 번호 목록을 입력하면 검색 결과에 벡터 및 서열 정보와 함께 재고 상태가 제공됩니다. 이제 대조군 리포터 구조체를 선택하십시오. micro RNA의 과발현이 전반적인 세포 건강이나 분석 신호에 미치는 비특이적 영향을 제어하기 위해, 하우스키핑(housekeeping) 서열, 무작위 단편과 같이 선택한 micro RNA의 표적이 될 가능성이 낮은 3' UTR을 가진 대조군 구조체를 선택하십시오.

또한, mimic 활성을 확인하기 위한 양성 대조군으로 합성 micro RNA 표적 리포터를 사용하는 것을 고려하십시오. 1일 차에 낮은 계대의 부착 세포를 접종하여, 24시간 후 transfection 시점에 80~100% 합류도(confluency)가 되도록 합니다. 높은 합류도의 세포를 사용하는 것이 좋은 결과를 얻는 핵심입니다. 세포를 흰색 96-well 조직 배양 플레이트에 총 부피 100 µL로 접종하십시오.

병행하여 수행하십시오. 세포 분주 24시간 후인 2일 차에 투명 플레이트 내 세포들이 급격히 밀집(confluence)되었는지 적절한 수의 세포를 확인하십시오. 형질전환(transfection) 해동을 준비하십시오.

리포터 컨스트럭트와 micro RNA를 상온에서 해동하십시오. 해동 후 잘 섞어 micro RNA를 RNA-free water로 2 µM의 작동 농도로 희석하십시오. gDNA 플라스미드 DNA는 30 ng/µL 농도로 제공되므로 추가 희석이 필요하지 않습니다. 트랜스펙션 혼합물을 준비할 때, 각 DNA-RNA 조합은 3반복으로 트랜스펙션해야 함을 고려하십시오. 부피는 수행되는 분석 횟수에 맞추어 조정해야 합니다.

트랜스펙션당 9.85 µL의 무혈청 배지와 0.15 µL의 Dharma effect DUO를 혼합하여 트랜스펙션 시약 혼합물을 만듭니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 각 분석을 위해 3.33 µL의 go clone 리포터 컨스트럭트와 원하는 최종 농도에 도달할 수 있는 양의 micro RNA mimic을 혼합하여 DNA-RNA 혼합물을 만듭니다.

무혈청 배지를 사용하여 부피를 10 µL로 맞춥니다. 다음으로, transfection 시약 혼합물 10 µL를 각 DNA-RNA 혼합물 10 µL와 결합하고 잘 섞어줍니다. 각 분석당 최종 부피는 20 µL가 됩니다.

덮개를 잘 덮고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 미리 데운 항생제 제거 완전 배지 80 µL를 추가하여 각 웰당 총 부피를 100 µL로 맞춥니다. 이 분석법을 통해 최종 mimic 농도는 10에서 15 nM 사이가 됩니다.

마지막 단계로, 세포가 분주된 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하고 적절한 최종 트랜스펙션 혼합물 100 µL로 교체합니다. 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮겨 24~48시간 동안 배양합니다. 대부분의 혼합물은 24시간 이내에 유의미한 결과를 나타낼 것입니다.

48시간의 배양 기간은 웰 간의 신호 편차를 크게 만듭니다. transfection 후 24시간이 경과한 3일 차에 light switch luciferase assay 시약을 사용하여 루시퍼레이스 분석을 수행하십시오. 세포는 즉시 분석하거나 -80 °C에서 냉동 보관 후 나중에 분석할 수 있습니다. 동결-해동 과정을 거치면 세포 용해가 촉진되어 리포터 신호가 더 높아집니다. transfection된 세포가 담긴 플레이트를 상온으로 가져옵니다.

그런 다음 키트 설명서에 따라 light switch 루시페라아제 분석 용액을 준비하여 멸균 리저버에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 white 96-well 플레이트의 각 샘플 웰에 light switch 분석 용액 100 µL를 직접 첨가합니다. 플레이트를 덮어 빛으로부터 보호하고 상온에서 30분 동안 배양합니다.

플레이트 루미노미터(Luminometer)를 사용하여 각 웰을 2초 동안 측정합니다. HT 10 80 세포에서 let-7a에 의한 3' UTR Luciferase 리포터 활성의 넉다운을 측정하기 위해, 각 리포터 컨스트럭트를 let-7a mimic 또는 비표적 대조군(non-target control)과 함께 공동 transfection하였습니다. 결과 분석 시, 각 컨스트럭트의 비표적 대조군 신호를 100%로 간주합니다.

특이적 micro RNA mimic의 신호를 비표적 대조군(non-target control) 신호로 나누어 knockdown 백분율을 계산합니다. 특정 micro RNA mimic은 전반적인 세포 생존력이나 분석 신호에 비특이적 영향을 미칠 수 있으므로, 이러한 비특이적 영향을 보정해야 합니다. 여기에 표시된 것처럼, 실험적 UTR 표적에서 관찰된 knockdown을 housekeeping 유전자 또는 무작위 대조군 T에서 관찰된 knockdown과 비교하십시오.

PONC 및 arid3B 인간 3' UTR은 let-7a microRNA의 표적입니다. let-7a microRNA mimic이 존재할 때 PUNC 및 arid3B 유전자의 인간 3' UTR 리포터 신호는 유의미하게 감소하지만, 하우스키핑 유전자 및 무작위 서열 UTR의 신호는 감소하지 않습니다. 이 영상을 시청한 후, 살아있는 세포에서 microRNA mimic과 3' UTR 리포터 컨스트럭트를 성공적으로 공동 형질전환(cotransfection)하는 방법과 루미노미터를 이용해 신호 감소를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.