Name: 3UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 LightSwitch 루시페라제 분석 시스템을 사용하여 인간 세포에서 microRNA와 3'UTR 상호작용을 검증하는 방법을. 이 기술은 유전자 발현 조절 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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소개 MicroRNAs는 많은 중요한 생물 학적 과정의 활동을 조절 유전자 발현의 중요한 규제로 등장했습니다. 700 명 이상 인간 miRNAs 지금까지 1 확인을 통해, 그것은 변이와 miRNAs의 부적 절한 규제가 이러한 암, 심장 질환 2,3 등 생리 장애의 다양한 연결되었다는 놀라운 일이 아닙니다. 최근 연구는 miRNA 규제 바인딩 사이트의 대다수가 3'UTRs 4,5에서 발견되는 것으로 나타났습니다, 일부 연구자들은 세포 6 miRNA마다 대상의 수백이있다는 것을 예상했습니다. miRNAs의 생물 학적 중요성을 감안할 때, 존재 miRNAs하고 각각에 대한 대상의 다수의 다수가, 그것은 연구자들이 안정적으로 선호 높은 처리량 연구 의무 플랫폼에서 miRNAs의 내생적인 목표를 식별 수있는 것이 중요합니다. miRBase, TargetScan 및 PicTar 1,6,7와 같은 전산 도구를 이용해도 miRNA에 대한 putative mRNA 목표의리스트를 생성하는 강력한 방법이지만, 예측은 아직 혼자 8시 의존 수있을 정도로 정확하지 않습니다. 따라서, 연구자들은 또한 목표 드 노보를 식별하거나 예측 목표를 확인하는 실험 방법의 숫자를 활용. 많은 팀들은 표현의 변화가 miRNA 활동 때 4,9,10를 불안정하게된다 는걸 알수있는 유전자를 식별하는 정상 상태 mRNA 또는 단백질 수준의 높은 처리량 측정에 의존합니다. 이러한 변화는 그러나 성적표 및 간접 또는 스트림 신호 효과에 miRNA의 직접적인 효과를 구분하지 않는 전반적인 표현의 변화를 측정, 의심의 여지가 생물 학적 의미 있고 중요한 첫 단계를 나타냅니다. 직접 miRNA - mRNA의 상호 작용에 대한 증거를 제공하는 다른 강력한 도구 miRNAs과 mRNAs로 상호 연결 argonaute 단백질은 (그리고 따라서 RISC 복합), 상호 작용하는 파트너를 식별하지만 즉시 기능 효과를 나타내는하지 않는 염색질 - immunoprecipitation (칩) 전략 아르 이러한 바인딩 이벤트 5,11니다. 따라서, 특정 UTR에서 miRNA의 효과에 대한 증거를 제공하는 기능 3'UTR - 기자 assays는 철저한 miRNA 연구의 중요한 구성 요소가되고 있습니다. 계산 대상 예측이나 표현 및 proteomics 데이터와 함께 찍은 이러한 세포 기반 분석 데이터는 특정 3'UTR 직접 관심의 miRNA에 의해 규제되어 강력한 증거를 제공합니다. 3'UTR - 기자 분석에서 관심의 유전자에서 3'UTR은 루시페라제 리포터 유전자의 끝에 융합이다. 3'UTR가 miRNA의 표적 경우, 기자의 성적표 안정성 및 / 또는 변환 효율은 기능적 miRNA 농도의 변화와 함께 변경됩니다. 그래서 성적 증명서 전용 기반 assays와는 달리 기자 assays는 안정 상태 mRNA와 단백질 수준 모두에 영향을 식별하는 데 도움이. 리포터 시스템은 또한 실제로 interaction8에 필요한 확인 3'UTR에 putative miRNA 바인딩 사이트를 mutagenizing의 기능 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 표현 배열, proteomics 기술과 argonaute 칩을 사용하는 대규모 연구 실험 조건, 셀 기반의 기자 assays 소수를위한 귀중한 게놈 - 광범위한 데이터를 제공하는 동안 그리고 miRNA - 3 '의 연구를 위해 스케일링 최대 가장 의무 아르 같은 조건의 수백 또는 수천 UTR의 상호 작용은 작은 분자 또는 다른 라이브러리를 기반 effectors의 높은 처리량 검사에 필요한 될 수 있습니다. 많은 과학자들은 miRNA - 3'UTR 상호 작용의 연구에 기자 분석 기술을 적용했습니다. 그러나 많은 miRNAs 다양한 성적의 각 대상 수백, 그것은 높은 처리량 규모의이 강력한 접근 방식을 활용하는 연구자에 대한 어려운 것으로 생각 다른 수천 만들기위한 복제, 검증 및 최적화 단계 때문에 3'UTR을 기자 벡터는 종종 금지 비용입니다. 소형 및 대형 3'UTR - 기자 공부하는 연구자에 액세스할 수를 만들기 위해 노력의 일환으로, 우리는 인간 3'UTRs 높은 최적화된 LightSwitch 루시페라제 분석 시스템에 미리 복제의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다. 기자 시스템은 검증된 제어 벡터, 긍정적인 컨트롤로 사용하기 위해 700 명 이상 합성 miRNA 목표 기자 구성 요소의 집합과 표준 실험 프로토콜의 시리즈를 포함하고 있습니다. 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 특정 인간 3'UTR 관심의 miRNA의 대상인지 여부를 요청할 수 있습니다. 이 워크플로우의 중요한 단계는 실험 설계, 기자의 구성 및 miRNA 싫어하지의 transfection, 루시페라제 리포터 assays, 데이터 분석입니다. 실험 디자인, 그것은 신중 transfectable 세포주, 실험 및 제어 기자의 구성 및 miRNA의 모방이 아닌 타겟팅 컨트롤을 선택 중요합니다. 일반적인 높은 transfectable adhHT1080, HepG2 같은 erent 셀 라인, HCT - 116, HELA, 293, 그리고 다른 사람들은 종종이 프로토콜과 함께 잘 작동합니다. 실험 디자인에 관한 중요 사항 LightSwitch 루시페라제 분석 시스템 RenSP 루시페라제 유전자와 LightSwitch 루시페라제 분석 시약을 이용한 GoClone 구조를 포함하고있는 완벽하게 최적화된 리포터 시스템입니다. 로 최적의 기자 분석 결과를 얻기 위해 권장 LightSwitch 시스템의 모든 구성 요소를 사용합니다. 개폐 GoClone 기자 구성 요소가있는 모든 oligos / plasmids의 공동 transfection이 아닌 특정 방식으로 전체 루시페라제 신호를 감소시킵니다. 따라서 다음과 transfection 조합을 수행하는 것이 중요하다 : 기자뿐만 아니라, 기자가 +가 아닌 타겟 제어 miRNA, 그리고 기자 + 특정 miRNA. 우리 empty_3UTR 벡터는 (강력한 발기인, 아니 UTR) 루시페라제 신호의 매우 높은 수준을 제공하며, transfection 효율을위한 긍정적인 컨트롤 역할을하며, 합성 miRNA 목표 기자 벡터는 활동을 모방에 대한 긍정적인 제어 역할을 수 있습니다. 또한, 우리는 정확하게 순서대로 특정 대 비 특정 효과를 분리를위한 GoClone 3'UTR의 가사 컨트롤 및 임의의 컨트롤을 사용하는 것이 좋습니다. 귀하의 프로토콜과 가능한 마스터 pipetting 오류 또는 증발로 인해 데이터의 다양성을 감소 믹스 확인을 공부합니다. 이 프로토콜은 DharmaFect 듀오 transfection 시약 (Dharmacon)를 사용합니다. 1 일 중요 팁 : 현명하게 셀 라인을 선택합니다. 최상의 결과를 얻으려면, transfectable 할수 있는것으로 알려져있는 세포 라인을 사용합니다. 우리는 또한 miRNA로 3 'UTR 기자의 측정 반응은 특정 miRNA 높은 내생 수준 셀 라인에 감쇠는 모방 것으로 나타났습니다. 많은 휴대 라인 표현 miRNA 방법을 모르는 경우, 간접적으로 세포뿐만 아니라 분석의 동적 범위로 알려주에서 특정 miRNA의 풍부한를 측정 SGG의 합성 microRNA 타겟을 시도해보십시오. 1. 종자 세포는 transfection시 ≥ 80 % 합류를 얻을 수 있습니다. <ol><li> 100μl 전체 볼륨의 96 - 웰 화이트 TC 플레이트의 씨앗 세포. </li><li> 병렬, 종자에 합류 평가에 대한 명확한 96 - 웰 플레이트에 세포의 적절한 수입니다. </li></ol> 중요 팁 : 1 합류는 모방 실험 좋은 결과를 달성하는 열쇠입니다. 최적의 최저 들어, 세포는 transfection시 100 % 합류한다. 중요 팁 2 : 최상의 결과 낮은 통로 전지를 사용합니다. 많이 passaged되었습니다 세포는 시끄러운 transfection 데이터를 얻을하는 경향이 있습니다. 날 2 GoClonereporter 구조와 miRNAs 준비 후 합류 세포에 transfect. 2. 구성 준비 <ol><li> 실온에서 해동의 GoClone 구조 (플라스미드 DNA). 잘 섞는다. </li><li> 뚜껑에서 결로를 제거하는 원심 분리기. </li></ol> 3. 마이크로 RNAs 준비 <ol><li> 실내 온도와 뚜껑의 결로를 제거하는 원심 분리기에 해동의 microRNAs (특정 모방이 아닌 타겟팅 컨트롤). </li><li> RNase없는 물 2 μm의의 작업 농도로 희석. </li></ol> 실험 miRNA 이외에 항상 비 타겟팅 miRNA 제어를 포함 모방. 공동 transfecting 플라스미드과 작은 RNA oligo 혼자 플라스미드를 transfecting보​​다 낮은 신호를 발생합니다. 하나 이상의 긍정적인 컨트롤을 포함합니다. SGG의 카탈로그에 합성 miRNA 목표 기자 벡터의 수백 중 하나를 사용하여 고려하십시오. 하나 이상의 음수 또는 이외의 특정 컨트롤을 포함합니다. SGG는 가사 유전자, 임의의 조각 및 / 또는 빈 (NO UTR 삽입) 제어 3 'UTRs 포함하여 컨트롤의 범위를하고 있습니다. 실험 구성과 함께 이러한 컨트롤 중 하나 이상의 사용은 특정 miRNA 또는 비 대상 컨트롤의 overexpression에 기인하지 않은 특정 효과에 대한 정상화 수 있습니다. 4. Transfections 준비 <ol><li> 각각의 transfection에 대해 하나의 분석을 위해 다음과 같은 시약을 결합 : </li></ol> 혼합 1 <table border="1"><tbody><tr><td> 개인 GoClone 기자 : </td><td> 3.33 μL </td></tr><tr><td> microRNA : </td><td> *이 다름 </td></tr><tr><td> 세럼 - 무료 미디어 : </td><td> 10 μL에 </td></tr></tbody></table> miRNA의 * 효과적인 농도는 10 NM - 100 nm의에서 다를 수 있습니다. 적절한 농도에 대한 miRNA 제조 업체에 문의하십시오. 중요 팁 : 모방 너무 많이 추가하지 마십시오. 모방 농도에 대한 합리적인 범위는 최종 100uL 반응에 10-50 NM입니다. 적어도 세 복제를 수행테 각각의 치료 / UTR 조합에 대한 transfections하고 오류를 pipetting 수 있도록 추가적인 볼륨이 포함됩니다. 예를 들어, 오류 또는 증발을 pipetting에 대한 추가를 포함한 세 복제 transfection의 우물에 대한 충분한 transfection 믹스를 3.5으로 단일 반응 볼륨을 곱하면됩니다. 각 기자 들어, 다음에 대한 복제 설정 : 기자뿐만 아니라, 기자가 +가 아닌 타겟 제어 miRNA와 기자 + 특정 miRNA. 비 타겟 제어 것과 동시에 타겟팅 microRNA에 대한 transfections를 설정합니다. <ol start="2"><li> DharmaFECT DUO (Dharmacon) 혼합물이 각 transfection에 대해 다음과 메이크업 : </li></ol> 혼합물이 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect 듀오 : </td><td> 0.15 μL </td></tr><tr><td> 세럼 무료 미디어 : </td><td> 9.85 μL </td></tr></tbody></table> 추가할 수 DharmaFECT 듀오의 양은 의존 세포 라인 수 있습니다. 위의 금액 표시는 HT1080 세포에 적합하고 있습니다. 휴대 라인에 해당하는 금액을 결정하기 위해 제조 업체의 설명서를 참조하십시오. 팁 : 기자의 숫자로 위의 볼륨을 곱하여 대형 transfection 혼합물을 만들고, 수가 복제 및 miRNAs의 수가 테스트합니다. 준비 transfection 믹스의 양을 계산할 때, 오류 및 증발을 pipetting을위한 계정을 추가 소량을 포함해야합니다. <ol start="3"><li> DharmaFECT 듀오 혼합 5 분 동안 상온에서 부화 수 있습니다. </li><li> 5 분 후에, 10uL 플라스미드 및 / 또는 miRNA (혼합 1) 각각의 준비 튜브에 DharmaFECT 듀오 혼합물 (혼합 2) 10μL를 추가합니다. 각각의 튜브 다음 복제 transfection 당 20μL의 볼륨을 포함해야합니다. </li><li> 상온에서 20 분 동안 각 혼합물을 품어. </li><li> 20 분정도 후에 복제 transfection 당 100μL 총 각 튜브에 복제마다 미리 예열 (37 ° C), 항생제없는, 전체 미디어의 80 μL를 추가합니다. 깊이 잘 블록은 많은 사람들이 동시에를 복제 및 샘플의 준비를 위해 사용할 수 있습니다. 최대 pipetting 아래로 솔루션을 섞는다. </li><li> 인큐베이터에서 씨앗을 품고 플레이트를 제거합니다. 세포가 적어도 80 % 합류되어 있는지 확인합니다. </li><li> 각 우물에서 언론에서 조심스럽게 pipet. </li><li> 각각 잘 수있는 transfection 혼합물 (20uL DNA / 시약 믹스 + 80uL 미디어)의 100μL를 추가합니다. </li><li> 하룻밤 인큐베이터에 넣어 판. </li></ol> 오버 부화하지 마십시오. 대부분의 모방은 24 시간 이내에 타고난 대상에 대한 의미있는 결과를 생산합니다. 48 시간 측정 억압의 수준보다 수도 있지만 잘 변화에 잘됩니다. 모방 실험 억제제 실험을보다 쉽게​​하고 있습니다. 대부분의 모방은 크게 24 시간 이내에 진정한 목표를 주체할 수 있지만 억제제에 기인 드 억압 중대한 변화는 측정하는 48 시간 정도 걸릴 수 있으며, 거의 항상 모방의 효과보다 발음됩니다. 3 일 참고 : 루시페라제 assays 즉시 실시하거나 접시가 -80에서 얼어 수 있습니다 ° C (동결은 일반적으로 세포 용해와 루시페라제 신호를 증가). 고정 및 최상의 결과를 얻으려면 시금하기 전에 세포를 녹여. LightSwitch 분석 시약을 추가하기 전에 실내 온도에 동결 세포의 해동을하게해야합니다. 5. LightSwitch AssayReagents로 측정 루시페라제 활동 <ol><li> 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 실내 온도에 가져와. </li><li> LightSwitch 분석의 시약을 (LS010 키트에 대한 다른 키트 크기의 프로토콜을 온라인으로 찾을 수 있습니다) 준비 : <ol><li> 동결 건조된 분석 기판의 튜브에 솔벤트 기판의 100μL를 추가하여 Reconstitute 100X 기판. 빛으로부터 보호하고 실온에서 시간을 최소화. 100X 기판 2-3주을위한 - 20C에 저장된 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 신선한 재구성 기판을 사용합니다. </li><li> 상온의 물을 욕조에서 분석 버퍼의 10mL 병을 해동하여 분석 솔루션을 준비하고 사용하기 전에 재구성 100X 기판의 100μL를 추가합니다. 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 직접 화이트 96 - 웰 플레이트에 잘 각 샘플 (100uL 세포 + 미디어를 포함)에 100μL LightSwitch 분석 솔루션 (버퍼 + 기판)을 추가하는 멀티 채널 pipettor을 사용합니다. 전지는 다른 판이나 플라스크 형식, 전송 샘플에서 재배면 100μL 총 볼륨 (미디어 또는 PBS)에 흰색 96 - 웰 플레이트에. </li><li> 플레이트 커버, 빛으로부터 보호하고, 실온에서 30 분 알을 품다. 하나 이상의 접시를 시금 경우 각 접시 읽기 전에 30 분 incubates 있도록 분석 솔루션의 추가 서다. </li><li> 접시 lumi 2 초 동안 각 잘 읽어nometer (SpectraMax L 또는 동급). </li><li> (발광은 = 특정 miRNA / 제어를하지 않는 타겟) 이외의 타겟팅 제어할 특정 miRNA에 대한 각 구성에 대한 루시페라제 신호 비율을 계산하여 최저를 계산합니다. 비 UTR 특정 치료 효과에 대한 제어 임의의 가사, 그리고 빈 구조에서 데이터를 사용합니다. </li></ol> 대표 결과 대상으로 miRNA의 존재에 3'UTR 목표는 루시페라제 최저를 보여줍니다. 하자 - 7A로 3'UTR - 루시페라제 리포터 활동의 최저는 다음 발광 기자를 읽고, 24 시간 동안 잠복기, 20nM 보자 - 7A 모방하거나 비 타겟팅 제어 구조 각 기자의 공동 transfecting 100ng로 HT1080 세포로 측​​정되었다 LightSwitch 루시페라제 분석 시약을 사용하여 신호. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. PUNC 및 ARID3B 인간 3'UTRs의하자 - 7A microRNA의 목표입니다. PUNC 및 ARID3B 유전자에 대한 인간의 3'UTR 기자의 신호가 크게 보자 - 7A microRNA의 존재에 무너뜨렸다하는 것은 모방하면서 가사와 임의의 시퀀스에 대한 신호 UTRs가 없습니다.

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</ol>

저자는이 문서에 나타나는 도구 및 시약을 개폐 장치의 지노 믹스의 직원입니다. 이 문서의 생산은 스위치의 지노 믹스에 의해 후원되었다.

우리는 살아있는 세포에서 miRNA - 3&#39;UTR 상호 작용 연구를 활성화하기 위해 사전에 복제된 인간 3&#39;UTR - 기자 구성 요소의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다. 여기 루시페라제 기자 시스템을 사용 3&#39;UTR - 기자 공동 transfecting miRNA 싫어하지에 대한 재현성 및 높은 처리량 방법을 보여주었다. 이 방법은 높은 transfectable 세포 라인을 사용하고 overexpression 기술과 miRNA 활동을 perturbing 연구에 의존합니다. 저조한 transfectable 세포 라인을 사용하는 연구자들은 시그마 (미션 3&#39;UTR Lenti GoClones)와 함께 만든 우리의 동반자 lentiviral 3&#39;UTR - 기자 컬렉션을 사용하는 것이 좋습니다. miRNA와 세포를 치료하면 overexpression 타입 실험 결과를 모방하고, 그러한 연구와 연구자들은 이것이 아니면 실제 생리 조건을 대표하지 않을 수 있습니다 수도 고려합니다. overexpression의 문제를 해결하기 위해, 연구자들은 섭동 12-14의 두 가지 종류의 상호 작용을 연구하기 위해 모방 이외에 miRNA 억제제를 사용할 수 있습니다. 일단 가능성이 miRNA 목표를 식별, 연구진은 사이트가 기능적 상호 작용에 필요한 있는지 여부를 확인하기 위해 putative miRNA 바인딩 사이트를 mutagenize하실 수 있습니다. 그들은 또한 다른 잠재적인 대상 UTRs (Boutz)의 수백을 테스트까지 확장하실 수 있습니다. 연구진은 miRNA가 성적표 안정성 또는 변환 효율에 영향을 미치는 것인 지에 관심이있다면 또한, 루시페라제 리포터 데이터가 정상 상태 증명서 수준의 조치에 비해 수 있습니다. 사본 레벨에 비례 변화와 관련되지 않습니다 루시페​​라제 신호에 변화가 번역의 효율성에 영향을 가리킨 것입니다. 마지막으로, 연구진은 miRNA 농도 14 변화에 다른 UTRs의 상대 감도를 비교하는 기자 벡터가 선량 반응 곡선을 만들 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 화이트 조직 문화 플레이트 (96 - 물론 고체 아래) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> 뚜껑 맑은 조직 문화 플레이트 (96 - 음) </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch 루시페라제 분석 시약 </td><td> 개폐 장치 </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT 듀오 Transfection 시약 (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T - 2010-02 </td></tr><tr><td> 박 플레이트 씰링 테이프 </td><td> E &amp; K 과학 </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> 통풍 플레이트 씰링 테이프 </td><td> E &amp; K 과학 </td><td> T896100 - S </td></tr><tr><td> 플레이트 Luminometer </td><td> 분자 장치 </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

3&#39;utr - 기자의 구성과 microrna를 사용하여 lightswitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 micrornas의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs는 (miRNAs) 유전자 발현의 중요한 규제하고 많은 생물 학적 과정에 역할을한다. 700 명 이상 인간 miRNAs는 각각 고유한 대상 mRNAs 수백까지 발생과 함께 지금까지 발견되었습니다. 전산 도구, 표현 및 proteomics assays, 그리고 염색질 - immunoprecipitation 기반 기술은 특정 miRNA의 직접적인 목표물 mRNAs을 확인하는 중요한 단서를 제공합니다. 그들이 기능 증거를 제공하고 셀 기반 시스템에서 특정 miRNA - 3&#39;UTR 상호 작용의 영향을 quantitate 때문에 또한, 3&#39;UTR - 기자 assays는 철저한 miRNA 대상 연구의 중요한 구성 요소가되고 있습니다. 활용 3&#39;UTR - 기자 assays에 더 많은 연구를 활성화하고 규모 업 높은 처리량 수준에 이러한 assays의를 지원하기 위해, 우리는 고도로 최적화된 LightSwitch의 루시페라제 인간의 3&#39;UTR 루시페라제 기자의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다 분석 시스템. 또한이 시스템은 긍정적인 컨트롤, 다양한 내생 3&#39;UTR 기자의 구성, 그리고 표준화된 실험 프로토콜의 시리즈로 사용하기 위해 합성 miRNA 목표 기자의 구조를 포함합니다. 여기서 우리는 miRNA, 효율적인 재현성, 높은 처리량 분석 의무는 것을 모방과 함께 개별 3&#39;UTR - 기자 구성 요소의 공동 transfection하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs는 (miRNAs) 유전자 발현의 중요한 규제하고 다양한 생물 학적 과정에서 역할을 보여왔다. 더 miRNA - UTR의 상호 작용을 이해하기 위해서, 우리는 소설 루시페라제 유전자와 분석 시약, LightSwitch 시스템과 결합하여 3 UTR 루시페라제 기자의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

마이크로RNA(miRNA)는 유전자 발현의 중요한 조절자로, 많은 생물학적 과정에서 역할을 수행합니다. 700종 이상의 인간 miRNA가 ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 리포터 컨스트럭트와 micro RNA mimic을 공동 형질전환하여 human 3' UTR 내의 예측된 micro RNA 표적을 검증하는 것입니다. 이는 먼저 세포주 선택, micro RNA mimic 선정, 그리고 실험군 및 대조군 3' UTR GoClone 리포터 컨스트럭트 선택을 포함한 실험 설계를 통해 이루어집니다. 그 다음, 형질전환 약 24시간 전에 부착 세포를 배양합니다. 이어지는 단계에서는 각 실험군 또는 대조군 3' UTR GoClone 리포터 컨스트럭트를 micro RNA mimic 또는 비표적 대조군과 공동 형질전환한 후, 24~48시간 동안 배양합니다. 마지막 단계로, LightSwitch luciferase assay 시약을 세포 및 배양액에 직접 첨가하고 플레이트 루미노미터(plate luminometer)를 통해 발광 신호를 측정합니다.최종적으로 리포터 분석 기술을 이용한 루시퍼레이스 신호 감소 측정을 통해 특정 microRNA의 표적이 되는 인간 3' UTR을 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 살아있는 세포 내에서 예측된 microRNA 3' UTR 표적 상호작용을 검증하는 기능적 분석법을 제공하므로 microRNA 연구자들의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 설계는 적절한 고효율 형질전환 부착성 세포주를 선택하는 것으로 시작하며, microRNA mimic 기반 분석은 해당 microRNA의 내인성 발현 수준이 낮은 세포주에서 가장 효과적으로 작동합니다.그런 다음 micro RNA mimic과 non-target control 쌍을 선택하십시오. 플라스미드와 소형 RNA oligo를 함께 형질전환하면 플라스미드만 형질전환했을 때보다 신호가 낮아지므로 non-target control을 포함하는 것이 중요합니다. 다음으로, Switchgear의 genome-wide collection에서 pre-clone 3' UTR Go Clone 리포터 컨스트럭트를 선택하십시오. 온라인 카탈로그로 이동하여 UTR 검색 버튼을 클릭하십시오.유전자 이름, 유전자 기호 또는 액세션 번호 목록을 입력하면 검색 결과에 벡터 및 서열 정보와 함께 재고 상태가 제공됩니다. 이제 대조군 리포터 구조체를 선택하십시오. micro RNA의 과발현이 전반적인 세포 건강이나 분석 신호에 미치는 비특이적 영향을 제어하기 위해, 하우스키핑(housekeeping) 서열, 무작위 단편과 같이 선택한 micro RNA의 표적이 될 가능성이 낮은 3' UTR을 가진 대조군 구조체를 선택하십시오.또한, mimic 활성을 확인하기 위한 양성 대조군으로 합성 micro RNA 표적 리포터를 사용하는 것을 고려하십시오. 1일 차에 낮은 계대의 부착 세포를 접종하여, 24시간 후 transfection 시점에 80~100% 합류도(confluency)가 되도록 합니다. 높은 합류도의 세포를 사용하는 것이 좋은 결과를 얻는 핵심입니다. 세포를 흰색 96-well 조직 배양 플레이트에 총 부피 100 µL로 접종하십시오.병행하여 수행하십시오. 세포 분주 24시간 후인 2일 차에 투명 플레이트 내 세포들이 급격히 밀집(confluence)되었는지 적절한 수의 세포를 확인하십시오. 형질전환(transfection) 해동을 준비하십시오.리포터 컨스트럭트와 micro RNA를 상온에서 해동하십시오. 해동 후 잘 섞어 micro RNA를 RNA-free water로 2 µM의 작동 농도로 희석하십시오. gDNA 플라스미드 DNA는 30 ng/µL 농도로 제공되므로 추가 희석이 필요하지 않습니다. 트랜스펙션 혼합물을 준비할 때, 각 DNA-RNA 조합은 3반복으로 트랜스펙션해야 함을 고려하십시오. 부피는 수행되는 분석 횟수에 맞추어 조정해야 합니다.트랜스펙션당 9.85 µL의 무혈청 배지와 0.15 µL의 Dharma effect DUO를 혼합하여 트랜스펙션 시약 혼합물을 만듭니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 각 분석을 위해 3.33 µL의 go clone 리포터 컨스트럭트와 원하는 최종 농도에 도달할 수 있는 양의 micro RNA mimic을 혼합하여 DNA-RNA 혼합물을 만듭니다.무혈청 배지를 사용하여 부피를 10 µL로 맞춥니다. 다음으로, transfection 시약 혼합물 10 µL를 각 DNA-RNA 혼합물 10 µL와 결합하고 잘 섞어줍니다. 각 분석당 최종 부피는 20 µL가 됩니다.덮개를 잘 덮고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 미리 데운 항생제 제거 완전 배지 80 µL를 추가하여 각 웰당 총 부피를 100 µL로 맞춥니다. 이 분석법을 통해 최종 mimic 농도는 10에서 15 nM 사이가 됩니다.마지막 단계로, 세포가 분주된 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하고 적절한 최종 트랜스펙션 혼합물 100 µL로 교체합니다. 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮겨 24~48시간 동안 배양합니다. 대부분의 혼합물은 24시간 이내에 유의미한 결과를 나타낼 것입니다.48시간의 배양 기간은 웰 간의 신호 편차를 크게 만듭니다. transfection 후 24시간이 경과한 3일 차에 light switch luciferase assay 시약을 사용하여 루시퍼레이스 분석을 수행하십시오. 세포는 즉시 분석하거나 -80 °C에서 냉동 보관 후 나중에 분석할 수 있습니다. 동결-해동 과정을 거치면 세포 용해가 촉진되어 리포터 신호가 더 높아집니다. transfection된 세포가 담긴 플레이트를 상온으로 가져옵니다.그런 다음 키트 설명서에 따라 light switch 루시페라아제 분석 용액을 준비하여 멸균 리저버에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 white 96-well 플레이트의 각 샘플 웰에 light switch 분석 용액 100 µL를 직접 첨가합니다. 플레이트를 덮어 빛으로부터 보호하고 상온에서 30분 동안 배양합니다.플레이트 루미노미터(Luminometer)를 사용하여 각 웰을 2초 동안 측정합니다. HT 10 80 세포에서 let-7a에 의한 3' UTR Luciferase 리포터 활성의 넉다운을 측정하기 위해, 각 리포터 컨스트럭트를 let-7a mimic 또는 비표적 대조군(non-target control)과 함께 공동 transfection하였습니다. 결과 분석 시, 각 컨스트럭트의 비표적 대조군 신호를 100%로 간주합니다.특이적 micro RNA mimic의 신호를 비표적 대조군(non-target control) 신호로 나누어 knockdown 백분율을 계산합니다. 특정 micro RNA mimic은 전반적인 세포 생존력이나 분석 신호에 비특이적 영향을 미칠 수 있으므로, 이러한 비특이적 영향을 보정해야 합니다. 여기에 표시된 것처럼, 실험적 UTR 표적에서 관찰된 knockdown을 housekeeping 유전자 또는 무작위 대조군 T에서 관찰된 knockdown과 비교하십시오.PONC 및 arid3B 인간 3' UTR은 let-7a microRNA의 표적입니다. let-7a microRNA mimic이 존재할 때 PUNC 및 arid3B 유전자의 인간 3' UTR 리포터 신호는 유의미하게 감소하지만, 하우스키핑 유전자 및 무작위 서열 UTR의 신호는 감소하지 않습니다. 이 영상을 시청한 후, 살아있는 세포에서 microRNA mimic과 3' UTR 리포터 컨스트럭트를 성공적으로 공동 형질전환(cotransfection)하는 방법과 루미노미터를 이용해 신호 감소를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

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3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

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배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

배우세요 LightSwitch 루시페라제 분석 시스템을 사용하여 인간 세포에서 microRNA와 3'UTR 상호작용을 검증하는 방법을. 이 기술은 유전자 발현 조절 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

3'UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

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