의 기생충 말벌에 대한 소개 Drosophila 그리고 Antiparasite 면역 반응

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 숙주에서 기생 말벌의 배양을 유지하는 방법과 림프선과 지방체를 해부하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 먼저 초파리 유충에서 말벌을 배양함으로써 이루어집니다. 그런 다음 동물을 해부하여 유충 림프샘을 분리하는데, 여기에는 표피를 벗겨내고 지방체와 기타 미세한 구조를 제거하여 림프선을 분리하는 작업이 포함됩니다.

마찬가지로, 지방체 자체는 면역 세포 화학(immuno cyto chemistry) 및 형광 현미경 검사(fluorescence microscopy)를 사용하는 유사한 절차를 사용하여 분리할 수 있습니다. 유전자 발현 및 세포 특이적 변화는 면역 조직에서 시각화됩니다. 말벌 감염 후, 우리는 초파리 호스와 기생 말벌을 사용하는 독특한 감염 및 면역 시스템을 연구합니다.

우리 실험실은 초파리 기생충의 생명 배양이 유지되는 몇 안 되는 곳 중 하나입니다. 따라서 우리는 종종 우리의 기술을 공유하라는 요청을 받습니다. 기생충은 많은 곤충의 천적입니다.

우리가 연구하는 종은 많은 초파리 종의 유충 단계를 공격합니다. 실험실에서는 초파리 멜란 위장(drosophila melan gastro)을 사용하여 곤충의 면역 체계가 기생충의 공격에 어떻게 영향을 받는지 이해합니다. 둘째, 우리는 호스트 방어를 극복하기 위해 WASS가 사용하는 전략을 발견하고자 합니다.

일반적으로 지방체와 림프샘 해부를 처음 접하는 사람들은 유충은 성장하기 쉽지만 크기가 상당히 작고, 이러한 성체 기관을 일상적으로 쉽게 해부하는 데 상당한 익숙함이 필요하기 때문에 어려움을 겪습니다. NF kappa B 신호전달의 구성적 활성화가 세포 조직의 캡슐화와 같은 자가면역으로 이어진다는 것을 발견한 후, 우리는 이 반응이 oph fla 돌연변이에서 어떻게 발생하는지 궁금해졌습니다. 그래서 우리는 유도 캡슐화가 자연적인 대응물이라는 가설을 세우고 우리가 시연할 이러한 표준 프로토콜을 개발합니다 오늘 저는 이제 말벌 배양을 준비하고 유지하는 방법을 시연할 것입니다.

갓 준비한 효모 페이스트를 약간 넣어 신선한 플라이 푸드 바이알을 준비하는 것으로 시작합니다. 50-60마리의 어린 야생형 파리를 바이알로 옮겨 섭씨 24도에서 48시간 동안 알을 낳습니다. 알을 낳은 지 이틀 후, 바이알에서 파리를 제거하고 버즈 플러그에 꿀 한 방울을 넣으십시오.

마지막으로 바이알을 요약합니다. 말벌은 파리보다 가스에 더 민감하기 때문에 마취하기 전에 이산화탄소의 흐름을 낮추십시오. 말벌을 마취 할 준비가되면 6-8 마리의 암컷 말벌과 6-8 마리의 수컷 말벌을 분류하여 유리병에 넣습니다.

초파리 알과 유충과 함께. 말벌이 깨어날 때까지 약병을 부드럽게 옆으로 눕힙니다. 그런 다음 바이알을 섭씨 24도의 인큐베이터에 넣습니다.

영향을 받지 않는 길로 숙주와 성공적으로 자신을 방어하는 숙주는 정상적인 발달 시점에서 강아지 페인트를 칠합니다. 그들은 말벌 e 폭발하기 전에 제거 할 수 있습니다. 말벌은 일반적으로 AC가 25-30 일 정도 닫혀 동일한 발달 단계에서 말벌을 준비합니다.

면역 조직이나 기생충을 해부하기 위해 감염된 유충을 수확하기 위해 48시간이 아닌 2시간에서 6시간에 걸쳐 숙주 알을 낳은 말벌을 사육합니다. 플라이 바이알의 내용물을 작은 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 실체 현미경을 사용하여 집게를 찾아 조심스럽게 6-10 마리의 유충을 선택하십시오.

유충을 먼저 하나의 XPBS가 있는 우물에 넣은 다음 물, 70% 에탄올 물과 하나의 XPBS로 연속적으로 옮깁니다. 이 단계의 목적은 동물에서 파리 먹이를 제거하고 표면을 철저히 청소하고 살균하는 것입니다. Zes 1000 해부 현미경의 해부 단계에서 입사광이 샘플을 통해 투과될 수 있도록 하는 라이트 박스를 배치합니다.

가는 집게를 사용하여 PBS에서 청소된 방황하는 세 번째 instar 유충을 선택합니다. 유충을 현미경 슬라이드에 놓습니다. 집게를 사용하여 배쪽이 위로 향하도록 동물을 배치합니다.

유기체가 투명하게 보이고 내부 장기가 보이도록 샘플에서 광원을 타일링했습니다. 유충을 슬라이드로 옮길 때 때때로 섹션을 더 어렵게 만들 수 있으므로 과도한 PBS가 없는지 확인하고 싶습니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 동물의 뒤쪽 끝 양쪽을 잡고 큐티클을 부드럽게 당겨 큐티클에 작은 표재성 파열을 만듭니다.

장과 지방체를 포함하는 혈 림프액이 체강에서 빠져나가기 시작합니다. 혈림프는 필요한 경우 10 마이크로 리터 피펫 맨으로 사용하여 도말 할 수 있으며, 두 집게를 입 고리 바로 아래 동물의 왼쪽에 조심스럽게 놓습니다. 큐티클을 부드럽게 찢어줍니다.

동물의 오른쪽에 있는 두 집게를 입 고리 바로 아래에 놓고 조심스럽게 다시 한 번 작은 눈물을 만듭니다. 이제 동물의 입 고리를 잡고 동물의 뒤쪽 끝을 향해 큐티클을 부드럽게 벗겨냅니다. 큐티클이 뒤로 당겨지면 뇌, 지방체, 상상의 디스크, 타액선 및 입증된 심실이 노출됩니다.

뒤쪽 끝에서 분리된 표피는 림프선이 부착된 등쪽 혈관을 가지고 있습니다. 림프선은 뇌 아래에 있습니다. 입증된 심실을 절단하고 림프선 영역에서 멀리 이동합니다.

림프선에서 지방, 신체, 장, 타액선 및 기타 구조를 조심스럽게 떼어냅니다. 뇌 뒤쪽에 위치한 고리선과 등쪽 혈관에서 절뚝거리는 분비선이 분리되지 않도록 주의하십시오. 림프선을 현미경 슬라이드에 평평하게 놓고 전체 림프선이 전엽에서 심낭의 최종 세트까지 펼쳐질 때까지 모든 추가 조직을 조심스럽게 제거합니다.

이제 분비선은 Zes 1000 해부 현미경의 해부 단계에서 고정하고 염색할 준비가 되었습니다. 입사광이 샘플을 통해 투과될 수 있는 라이트 박스를 배치합니다. 청소된 세 번째 instar 유충을 현미경에 배치합니다.

하나의 XPBS를 200마이크로리터로 밀어 넣습니다. 샘플에서 광원을 기울여 유기체가 투명하게 나타나고 내부 장기가 보이도록 합니다. 집게를 사용하여 앞쪽 끝이 당신에게서 멀어지도록 동물을 배치합니다.

다음 단계에서는 내부 장기를 건드리지 않고 큐티클만 찢을 수 있도록 집게의 위치를 기록하는 것이 중요합니다. 한 쌍의 집게로 입 왼쪽에 있는 유충의 표피를 잡고 다른 집게로 갈고리를 잡습니다. 반대쪽의 큐티클을 뒤쪽 끝까지 부드럽게 찢습니다.

몸의 큐티클을 뒤쪽 끝에서 떼어내기 전에 멈추고 아주 부드럽게 한쪽으로 장을 제거하기 시작합니다. 뇌 상상 디스크와 링프선이 등쪽 혈관을 통해 흐르는 고리선을 부드럽게 제거합니다. 마지막으로 뚱뚱한 몸의 양쪽에 있는 큐티클을 부드럽게 제거합니다.

침샘의 양쪽에 지방체가 있으므로 침샘을 제거하지 마십시오. 조직 고정 및 염색을 진행하기 전에 PBS를 제거해야 합니다. 잘 절부된 지방체 샘플은 정상적인 세포 접촉을 유지해야 하며 절개된 샘플 주위에 최소한의 지방 덩어리가 있어야 합니다.

말벌 감염이 유전자 발현에 미치는 영향은 in vivo에서 시각화됩니다. 감염되지 않은 대조 동물에서 Theso Mycin 프로모터에 연결된 GFP 리포터를 사용하여 GFP 발현을 검출하지 못했습니다. GFP 신호는 l Victoria에 감염된 동물에서 해부된 지방체의 세포질에서 명확하게 검출되는 반면.

엘빅토리아 감염 후 전엽에서 유도된 세포 변화를 시각화하기 위해 림프선을 절개했습니다. 기형 인핸서(misshapen enhancer)에 의해 구동되는 GFP로 표시된 새로 분화된 세포는 엽의 주변에서 볼 수 있습니다. 일반적으로 땀샘은 엽을 지속적으로 둘러쌉니다.

그러나 이러한 동일한 해부로 인한 말벌 감염 후 기저막이 불연속적이었기 때문에 이 땀샘에서 전엽의 무결성이 파괴되었습니다. 혈림프의 세포(cyte)는 도말로 시각화되었습니다. 일부 림프구는 베첼 발현을 감지하기 위해 기생충 발달을 차단하기 위해 캡슐 형태로 사용되었습니다.

절개된 림프선. 림프선은 in vivo에서 다클론 항슈필 항체로 염색하였다. 말벌 감염 후 림프선 세포에서 슈필 수치가 감염되지 않은 대조군에 비해 증가했습니다.

이 절차를 시도하는 동안 원하는 생물학적 연령에서 식도 배양을 준비하는 것이 중요합니다. 수동 취급으로 면역 반응을 유발하지 않도록 부드럽게 다루십시오. 이 절차에 따라 절개된 장기, 지방체 및 림프선을 사용하여 추출된 RNA 또는 단백질을 사용하여 RNA와 단백질을 추출할 수 있습니다.

유전자 및 단백질 발현을 연구하기 위해 PCR 또는 Westin 분석을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 보고 나면 성장하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 기생충은 초파리 숙주에 있었고 면역조직화학 및 기타 응용을 위해 면역 조직을 해부했습니다.