Name: 재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 학습하세요 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산 및 정제 방법을. 헤파린 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 고순도 바이러스를 얻고, 면역형광 현미경으로 정확한 타터 측정을 수행합니다.

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다음과 같은 프로토콜을 요약 보여주기위한 그림 1을 참조하십시오. 안전주의 : 조립 바이러스 입자들과 접촉을 해 왔습니다 모든 자료 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독해야합니다. 1. 플라스미드 DNA 주식 (~ 2 일)의 준비 <ol><li> 다음 plasmids는 1이 필요합니다 : <ul><li> pRV1 - AAV2 담당자와 모자 시퀀스를 포함 </li><li> pH21 - AAV1 담당자와 모자 시퀀스를 포함 </li><li> pFdelta6 - 아데노 바이러스 - 헬퍼 플라스미드 </li><li> 플라스미드 AAV는 AAV2 포장 신호 (거꾸로 터미널 반복, ITRs) 어귀 재조합 표현 카세트를 포함하는 </li></ul></li><li> pFdelta6이 부분 삭제를 방지하기 위해 Stbl2 유능한 세포 성장해야하지만, pRV1와 pH21는 DH5alpha 유능한 세포의 성장 수 있습니다. 부분 삭제가 DH5alpha 세포에서 발생하는 경우에는 AAV의 plasmids은 Stbl2 세포의 성장 수 있습니다. </li><li>플라스미드 DNA는 고품질의 RNA 오염 물질의 무료 있어야합니다. Plasmids는 다음과 소화를 사용하여 무결성 검사를 할 수 있습니다 : <ul><li> pRV1 - 소화와 XbaI은 7.5 킬로바이트 및 3.8 킬로바이트의 밴드를 제공 </li><li> pH21 - EcoRI로 소화 4.5 킬로바이트의 밴드 2.8 킬로바이트 및 0.2 킬로바이트를 제공 </li><li> pFdelta6 - HindIII와 소화가 5.5 킬로바이트의 밴드, 3킬로바이트, 3킬로바이트 2.3 킬로바이트 및 1.5 킬로바이트를 제공 </li></ul></li></ol> 2. (- 3 일 2) transfection에 대한 인간의 배아 신장 293 (Hek293) 세포의 준비 <ol><li> 플레이트이 80% 합류 150cm 다섯 15cm 직경 Nunc 조직 문화 요리에 Hek293 전지 2 flasks. 세포는 70해야 - transfection (약 48 시간이 도금 후) 전에 80% 합류. 10% 소태아 혈청과 100 U / ML 페니실린 / 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는 낮은 포도당 표준 Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 문화 세포. </li><li> transfection 전에 3 시간 DMEM을 제거하고 Iscove로 교체의 수정된 Dulbecco의 중간 (IMDM)는 소태아 혈청 5 %를 포함. </li></ol> 3. 바이러스 plasmids의 Transfection (transfection에 대해 ~ 1 시간 부화 3 일) <ol><li> 바이러스의 단일 배치 (5 X 15cm 조직 문화 플레이트)에 대한 다음과 같은 준비 : <ul><li> 플라스미드 62.5 μg AAV </li><li> 125 μg pFdelta6 </li><li> 31.25 μg pRV1 </li><li> 31.25 μg pH21 </li><li> 1650 μl 2.5 M CaCl 2 </li><li> 12 ML DH 2 O </li></ul></li><li> 50 ML 튜브에 2 급 조직 문화 후드 살균 필터 transfection 혼합물에. </li><li> 솔루션을 vortexing 반면, 신속하게이 X의 HEPES 13 ML을 추가 (산도 7.05) 염분 버퍼. 50 ML 튜브의 뚜껑을 교체하고 15 초 동안 와동로 진행합니다. 일분 45 초 동안 서 떠나 훌륭한 흰색 침전물이 형성됩니다. </li><li> 부드럽게 각 15cm 조직 문화 요리에 transfection 솔루션의 5 ML를 추가합니다. 소용돌이 모양의 접시는 믹스 앤 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> transfection 후 16시간은 IMDM 미디어를 제거하고 DMEM로 바꿉니다. </li></ol> 4. (2 시간) 세포의 Lysing 및 rAAVs의 수확 <ol><li> transfection 후 72 시간, 세포 배양 접시에서 미디어를 제거하고 폐기. 모든 폐기물은 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독 치료를해야합니다. </li><li> 부드럽게 따뜻한 1X 인산염의 세포를 세척 식염수는 (; 산도 7.4 PBS) 버퍼. </li><li> 각 판 25 ML 따뜻한 PBS를 추가하고 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 제거합니다. 50 ML 튜브의 중지를 수집합니다. </li><li> 10 분 800 XG에 펠릿 세포. </li><li> NaCl 150 MM, 20 MM 트리스 산도 8.0에서 뜨는 및 resuspend 펠렛을 폐기, 조직 문화 판 당 10 ML을 사용합니다. 이 50 ML 튜브로 가라. </li><li> DH 2 O.에서 10 %의 나트륨 deoxycholate의 새로운 솔루션을 준비 0.5 %의 최종 농도 각 튜브에이 1.25 ML을 추가합니다. ML 당 50 단위의 최종 농도 benzonase nuclease를 추가합니다. 철저하게 튜브를 섞습니다. </li><l c><li> 15 분에 대한 3000 XG에 centrifuging하여 세포 파편을 제거합니다. 신선한 50 ML 관에 전송 모든 세포 부스러기가 (5 단계 참조) 헤파린 열 차단 방지하기 삭제되었습니다 보장합니다. 이 단계에서는 샘플을 계속하기 전에 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 우리는 감염의 감소없이 -20 ° C에서 몇 주 동안 샘플을 저장합니다. </li></l></ol> 5. rAAVs의 헤파린 열 정화 (2-3시간) <ol><li> 해당 솔루션은 흐름 있도록 5.4 단계 5.2에 대한 분당 1 ML에있는 컬럼을 통해 연동 펌프를 사용하여 설치 HiTrap의 헤파린 열. 기포가가 헤파린 컬럼에 도입되지 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 10 ML 150 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0로 컬럼을 평형. </li><li> 칼럼 50 ML 바이러스 솔루션을 적용하고 흐름을 통해 수 있습니다. </li><li> 20 ML 100 MM NaCl, 20 MM 트리스, pH를 8.0로 컬럼을 씻으십시오. </li><li> 5 ML의 주사기를 사용하면 열 w을 씻어 계속한 ML 300 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 다음​​ ith 일 ML 200 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0,. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 적용하여 열에서 5 ML 주사기와 부드러운 압력 elute 바이러스를 사용 : <ul><li> 1.5 ML 400 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 </li><li> 3.0 ML 450 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 </li><li> 1.5 ML 500 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 </li><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브에서 이러한를 수집합니다. </li></ul></li></ol> 6. 농도와 rAAVs의 무균 여과 (1 시간) <ol><li> 100,000 분자량의 컷오프와 Amicon 울트라 - 4 원심 필터 유닛을 사용하여 벡터를 집중. 이분 (실온에서) 2000 XG에 농축기와 원심으로 열 eluate 4 ML을로드합니다. 나머지 바이러스 솔루션과 반복 원심 분리와 flowthrough 및 재장전 농축기를 폐기하십시오. 집중 볼륨 약 250 μl해야합니다. 집중 볼륨이보다 훨씬 더 많은 경우, 흐름 T를 폐기hrough는 볼륨이 약 250 μl 때까지 일분 단계에서 원심 분리기를 계속합니다. </li><li> 500 μl의 최종 볼륨 바이러스에 PBS 250 μl를 추가하고 농축기에서 제거합니다. </li><li> 13mm 직경 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터 벡터. 벡터는 ° C까지 필요한 -80에서 aliquoted하고 저장해야합니다. </li></ol> 7. (3 일간) 바이러스 주식 Titering 이 기자의 유전자 또는 유전자 immunocytochemically 감지 제품을 운전 Hek293 세포에서 활성화되어 발기인이 필요합니다. Hek293 세포는 다른 세포 라인이나 기본 셀 문화가 사용할 수와 호환되지 않습니다 벡터를 제작하는 경우. <ol><li> 50% 합류 - 그들이 40되도록 Hek293 세포를 시딩하여 18 폴리 - L - 라이신 코팅 유리 coverslips 또는 Nunc 챔버 슬라이드 18 우물을 준비합니다. Cre - 의존 rAAVs의 적정 위해 안정 표현 Cre recombinase이 Hek293 세포를 사용합니다. </li><li> 시리얼 D 각각 잘 감염AAV 벡터 (그림 2A)의 ilutions. 희석 당 3 우물을 사용합니다. 우리는 일상적으로 각각 물론 직접 바이러스를 추가합니다. </li><li> 72시간은 실온 10 분 (2 % PFA의 최종 농도를주는) 중간에 4 % paraformaldehyde의 동일한 볼륨 (PFA)를 추가하여 Hek293 세포를 수정 후. </li><li> 세포에게 PBS로 세 번 씻어, DH 2 O와 coverslip에 린스. </li><li> 가장 높은 희석 요인을 세 우물에서 transduced 세포의 수를 세어하지만 여전히 감염된 세포를 포함하는 이들의 평균을 찾아 microliter 당 전염성 단위 (그림 2B)의 번호를 가르쳐주기 희석 요소를 기준으로 곱하면됩니다. </li></ol> 8. 예상 결과 Hek293 세포는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)가 그림 2B에 표시하는 바이러스 인코딩 transduced. 우리는 일반적으로 마이크로 리터 당 약 6 × 10 6 전염성 입자의 일관성 titers을 얻을 수 있습니다. 우리는 일상적으로 stereotaxic 인제 이러한 벡터를 사용성인 쥐 두뇌에 ction. 이것은 특정 지역과 관련된 유전자 발현 2에 대한 강력한 기술을 제공합니다. 우리가 Cre - 형질 전환 마우스 2 대상 지역으로 Cre recombinase 종속 rAAVs을 주입 셀 타입의 선택적 유전자 발현이 지역의 특이성을 결합합니다. 그림 2C - E는 성인 parvalbumin - Cre 유전자 변형 마우스 3 가지 뇌 영역에 eGFP 인코딩 Cre - 의존 rAAVs의 stereotaxic 주사의 예를 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. rAAV 생산을위한 프로토콜의 도식 그림. 1.) Hek293 전지는 도금 및 70 재배 - 80 % 합류합니다. 2.) AAV와 도우미 plasmids은 준비하고 Hek293 세포로 transfected 수 있습니다. 3.) 매체는 transfection 후 DMEM 16시간으로 변경되고 Hek293 세포는 다른 56시간에 대한 양식입니다. 4.) Hek293 세포는 수확 및 lysed 있습니다. rAAV 벡터는 C에 의한 세포의 잔해로부터 분리entrifugation. 5.) 바이러스성 입자 농도 및 살균하기 전에 헤파린 컬럼을 통해 정화됩니다. 6.) Hek293 세포 24 잘 접시에 성장과 전염성 단위의 수를 결정하는 AAV 벡터의 시리얼 dilutions로 감염됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Titering 및 rAAV1 / 2의 생체내 응용 프로그램 인치 바이러스 titer를 측정 Hek293 세포의 (A) 설정. Hek293 세포 rAAVs 일련 dilutions와 transduced 있습니다. C, 감염되지 않은 제어, N, undiluted 바이러스 주식 1 μl. (B) Hek293 세포 eGFP을 표현 rAAVs에 감염. (CE) 바이러스성 eGFP 표현은 제한됩니다 Cre - 표현 Cre가 활성화된 rAAVs의 stereotaxic 주입 후 parvalbumin - Cre 유전자 변형 마우스의 다른 대상 지역에서 뉴런합니다. 예 이미지 (C) 망상 시상 및 globus pallidus에서 GFP의 immunoreactivity를 보여, (D) 이가있는 이랑과 해마의 (E) CA1 지역. DG, 드ntate 이랑, RT, 망상 thalamic 핵, GP, globus pallidus의. 스케일 바 : B, 500 μm의, C, 100 μm의, D, 100 μm의, 전자, 500 μm의.

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</ol>

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rAAV 벡터 동물의 생체내 연구에 대한 가치가 점점지고 있습니다. 여기, 우리는 기업에 바이러스 생산의 값비싼 아웃소싱을 피하고하여이 유용한 벡터의 광범위한 응용을 용이하게 할 수있는, 생산 rAAVs을위한 간단하고 저렴한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜 (참고 1 기준) 동등한 비율 4 양쪽 부모 serotypes의 capsid 단백질을 포함하는 키메라 rAAV1 / 2 벡터의 생산을 설명합니다. 헤파린 컬럼에 바인딩하여 rAAV 벡터의 정화는 AAV2 capsid 단백질의 표현에 의존하지만, 여기에 설명된 AAV1 이외 serotypes과 함께하실 수 있습니다. 또한, AAV6은 감소 친화력과 함께 있지만, 헤파린에 바인딩하는 것으로보고되었습니다, 그리고 잠재적으로이 절차를 사용하여 헤파린 5,6 열이 정화 수 있습니다. 그것은 다른 serotypes는 헤파린 칼럼 용출 5,7에 대한 NaCl의 다른 농도가 필요합니다, 그러나 지적해야합니다. 포장 rAAV의 genomes은 5.2 킬로바이트 8까지 포장 효율 날카로운 감소로 4.1 및 4.9 킬로바이트 사이에 최적으로 표시되었다. transgene 표현의 셀 유형 - 특정 규제는 일반적으로 작은 AAV 입자 내에 수용 수없는 요소를 행동을 대형 CIS에 의해 달성되기 때문에이 포장 제한은 rAAV 시스템의 가장 큰 단점으로 간주 수 있습니다. 이러한 우리가 아니라 같은 단계 6.3에서 설명하는 PBS를 추가하는 것보다 한 500 μl 배치에 250 μl에 집중 별도의 바이러스 배치를 결합하는 AAV 포장 한도에 가까운 패키지 유전자 시도로 인한 것과 같은 낮은 titer의 일괄를 극복하기. 신뢰성 셀 타입의 특정 형질 도입은 통합 Cre - 드라이버 마우스 및 포장 한도를 스트레칭 피하기 위해 조건부 rAAV 카세트 (아래 참조)에 의해 얻을 수 있습니다. 지폐,이 프로토콜은 높은 t의 생산에 쉽게 따라 지침을 제공하기 위해 시도하는 동안iter rAAV, 그건 헤파린 친화도 크로마 토그래피에 의한 정화를위한 AAV2 capsid 단백질 moieties의 존재를 필요로합니다. AAV2 이외 Serotypes는 대체 절차에게 9를 사용 정화해야합니다. 헤파린 열 정화의 장점은 그것이 세슘 염화물 경사도 10을 사용 제작 그 이상의 감염 속도를 가지고 AAV 벡터를 생성하는 생각입니다. 그러나이 방법에는 몇 가지 단점도 있습니다. 예를 들어, 헤파린을 묶고 다른 단백질은 또한 정화 바이러스 재고가 나타날 수 있습니다. 헤파린 - 정화 벡터의 tropism이 벡터 titer 10, 구체적으로 흥분성의 20 억제 뉴런 (그림 2) 중 하나를 대상으로 우리의 접근 방법에 의해 영향을받을 수 있지만 AAV - 중재 transgene 표현의 Cre - 유도된 활성화를 고용하고 titre - 독립적입니다. 헤파린 열 정화하는 대안의 사용을보다 높은 바이러스 titer와 순수한 준비를 생산 iodixanol 밀도 구배의 사용이다세슘 염화물 기울기 10. 이 방법은 99% 순도 11보다 큰 벡터를 생성하기 위해 헤파린 열 정화와 함께하실 수 있습니다. 따라서 신중한 검토가 바이러스성 정화 방법은 자신의 특정 다운 스트림 응용 프로그램에 가장 적합한하는 개별 그룹으로 이동해야합니다. 이 프로토콜과 관련된 가장 일반적인 문제는 낮은 바이러스 titer입니다. 우리의 경험에서 이것은 일반적으로 낮은 transfection 효율, 또는 헤파린 칼럼에서 바이러스의 용출로 추적할 수 있습니다. 모든 transfection 자료 transfection하기 전에 상온에서해야하고, 테스트 transfections는 각 연구실에 최적의 조건을 찾기 위해 수행되어야합니다. transfection의 다른 방법은 lipofectamine과 같은, 고효율 있지만, prohibitively 비싼 수 있습니다. 또한, 헤파린 열 용출 솔루션의 농도와 산도는 헤파린 열 witho에서 virions 완벽하게 용출에 대한 중요UT 손상. 또 다른 중요한 포인트는 패키징 세포 조직 문화 요리의 표면에 잘 준수해야한다는 것입니다. 세포 절차를 수행하는 동안 어떤 단계에서 분리하는 경우 그것은 실험과 서리를 없애다 세포의 새로운 약병을 종료하는 것이 좋습니다. 설치류의 transgene 표현의 Spatio - 시간적 제어를 쉽게 정확한 해부 학적 타겟팅과 동물의 발달 단계에 의해 이루어진다. 효율적인 AAV - 중재 유전자 전송은 utero 12,13에 표시되었습니다. 성인 두뇌에서 stereotaxic 주사 후 rAA​​V 입자에 감염된 영역뿐만 아니라 바이러스 titer의 변화에​​ 의해뿐만 아니라 사출 매개 변수를 변경하여 훨씬 더 큰 영역에 아주 작은 타겟 지역에서 조정할 수 있습니다. 이것은 볼륨과 속도 주입과 바이러스 정지 14 폴리올 mannitol의 포함을 포함합니다. Mannitol은 또한 체계 rAAV 주입 15 일 이후에 조직의 다양한 감염을 향상시키기 위해 사용할 수 있습니다 &lt;/&gt;를 한모금. rAAV (약 4.7 KB)의 포장 용량은 아마도 이러한 바이러스 벡터에서 표현할 수있는 유전자의 관점에서 가장 제한 요소입니다. 그러나, 최근 연구는 이것이 부분적으로 별도의 rAAV 벡터에 큰 분할 또는 유전자 발현 카세트에 의해 극복하고 virions이 같은 세포 16 감염시 유전자 발현을 시작, 다리 순서를 소개 할 수있는 것으로 나타났습니다. rAAV 벡터에 의해 운반 유전자의 표현 수준도 크게 자체 무료 rAAV 벡터 17를 사용하여 향상된 수 있습니다. rAAV 벡터의 Stereotaxic 주사는 특정 지역과 관련된 방식으로 유전자 발현을 유도를위한 신속하고 저렴한 가격과 강력한 방법을 제공합니다. 조합 2 차 생성 RNA 간섭 전략 18 rAAVs 또한 특정 지역과 관련된 다운 유전자 노크 사용할 수 있습니다. rAAVs는 회로 및 셀 타입을 달성하기 Cre - 유전자 변형 생쥐 또는 셀 타입의 특정 발기인과 함께 조합하여 사용할 수예 : tet 시스템과 피팅 rAAVs가 바이러스 매개 유전자 발현 22,23 이상의 시간적 제어를 추가하면서, 높은 공간 해상도 2,19-21와 유전자 조작을 허용 특정 유전자의 표현. 이러한 예제는 이러한 벡터의 거대한 조합 가능성을 설명하고 올 년간 rAAV 기반 연구의 급속한 증가를 예측했다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 원심 필터 </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100,000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco의 수정 독수리 중간 (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> 10% FCS와 10 대 / ML penicillin/100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보충 </td></tr><tr><td> Hek293 세포 </td><td> 미국 유형 문화 수집 </td><td> CRL - 1573 </td><td> 통로 30에서 사용 </td></tr><tr><td> HEPES는 염분 버퍼 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 51,558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap 헤파린 카트리지 </td><td> 시그마- 올드 리치 </td><td> 54,836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove의 수정 Dulbecco의 중간 </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> 5% FCS와 보충 </td></tr><tr><td> 나트륨 deoxycholate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D5670 </td><td> 각 일괄 처리를위한 신선한 솔루션을 확인하십시오 </td></tr><tr><td> 15cm의 조직 문화 요리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 157,150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 유능한 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon 솔루션 </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC9821357 </td><td> 폐기가 유출되기 전에 하룻밤 소독에 맡겨 </td></tr></tbody></table> 프로토콜에 필요한 표 1. 특정 시약

재조합 adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 titering

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

최근에는 재조합 adeno는 - 관련 바이러스 벡터 (AAV) 동물의 생체내 연구에 대해 점점 더 가치가 있고, 또한 현재 인간 임상 실험에서 테스트되고 있습니다. 야생 형 AAV는 parvoviridae 제품군의 비 병원성 회원 본질적으로 복제 - 결함이다. 광범위한 도입 프로필, 낮은 면역 반응뿐만 아니라 이러한 벡터와 달성 강하고 영구 transgene 표현들을 체외 및 생체내 유전자 전달에 대한 인기와 다양한 도구를 만들었습니다. rAAVs이 쉽고 저렴 실험실에서 생산하고, 자신의 유리한 안전 프로파일에 따라 수, 일반적으로 낮은 안전 등급 부여됩니다. 여기서 우리는 AAV1와 AAV2 모두의 capsid 단백질을 포함하는 키메라 rAAVs의 생산과 titering하는 방법을 설명합니다. 이러한 이른바 키메라 벡터의 사용은 높은 titres 주식 (AAV1)와 정화로 모두 부모 serotypes의 장점을 결합친화성 크로마 토그래피 (AAV2)에 의해. 이러한 AAV의 serotypes 모든 AAV의 serotypes의 연구 최고이며, 개별적으로 광범위한 감염 패턴을했습니다. 여기에서 설명한 키메라 벡터 AAV1과 AAV2의 전염성 속성을해야하기 때문에 신경, 골격 근육, 췌장, 다른 사람 사이에 신장을 포함하여 조직의 넓은 범위를 감염 것으로 기대하실 수 있습니다. 방법은 헤파린 열 정화를 사용하여 여기에 설명된 내용, 방법은 세슘 염화물 기울기 원심 분리를 통해 다른 정화 방법보다 높은 바이러스 titer와 청소기 바이러스 준비를 제공 믿었다. 또한, 우리는 이러한 벡터가 쉽고 빠르게 생산 감염성 입자의 수​​를 정확하게 읽기를 제공 titered 수있는 방법에 대해 설명합니다.

재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고 있습니다<em&gt; 생체내에</em&gt; 동물의 연구. 우리는 rAAVs는 실험실에서 생산되는 수 있으며, 어떻게 이러한 벡터가 생성 전염성 입자의 수​​를 정확하게 읽기를 제공 titered 수있는 방법에 대해 설명합니다.

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

최근 몇 년 동안 재조합 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터는 동물 대상 인비보(in vivo) 연구에서 그 가치가 점점 더 높아지고 있으며, 현재...

이 프로시저의 목적은 효율적인 in vitro 또는 in vivo 외래유전자 전달을 위한 재조합 아데노-부속 바이러스(recombinant adeno-associated viruses, r AAVs)를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 외래유전자와 바이러스 유전자를 인코딩하는 DNA 플라스미드로 HEK 293 세포를 형질전환함으로써 이루어집니다. 이후 형질전환된 세포를 긁어내고 용해하여 조립된 rAAV 입자를 회수합니다.다음으로, 헤파린 컬럼 정제를 통해 세포 용해물로부터 R AAV를 정제합니다. 마지막 단계는 바이러스 스톡을 농축하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경 관찰을 통해 강력하고 지속적인 바이러스 매개 트랜스 유전자 발현 결과가 나타납니다.이 단계에서 RA AAV는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 응용에 사용할 준비가 되었습니다. 세슘 클로라이드 구배 정제와 같은 다른 정제 방법보다 본 기술을 사용할 때 얻을 수 있는 주요 장점은 초원심분리기나 독성 물질을 사용할 필요가 없다는 점입니다. 또한, 더 높은 수율의 순수한 바이러스 벡터를 얻을 수 있습니다.본 프로토콜을 시작하기 전에, 서면 프로토콜에 기술된 대로 고품질의 플라스미드와 DNA 스톡을 준비하고 무결성을 확인하십시오. 시작하려면, 80% 합류도(confluence)에 도달한 150 cm² 플라스크의 HEK 293 세포 2개를 5개의 지름 15 cm 조직 배양 접시에 분주하여 세포를 배양합니다. 배양에는 10% 태아 송아지 혈청(fetal calf serum)이 함유된 저포도당 표준 DMEM을 사용하며, 분주 후 약 48시간이 지난 transfection 당일, transfection 3시간 전 세포의 합류도는 70~80%가 되어야 합니다.DMEM을 제거하고 얼음에 보관된 modified CHO's medium 또는 5% fetal calf serum이 포함된 IMDM으로 교체합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 단일 배치의 바이러스를 위한 transfection 혼합물을 준비합니다. 2급 조직 배양 후드 내에서 transfection 혼합물을 50 milliliter 튜브에 멸균 여과하며, 용액을 볼텍싱하는 동안 13 milliliters의 2배 HEPES buffered saline을 빠르게 첨가합니다.50 milliliter 튜브의 뚜껑을 닫고 15초 동안 계속해서 볼텍싱합니다. 1분 45초 동안 그대로 둡니다. 그러면 흰색 침전물이 형성됩니다. 각 15 centimeter 조직 배양 접시에 transfection 용액 5 milliliter를 천천히 첨가합니다.16시간 동안 배양한 후, 플레이트를 흔들어 섞어줍니다. IMDM을 제거하고 DMEM으로 교체한 후 세포 배양을 계속합니다. R AAV를 수확하려면.세포 배양 플레이트에서 배지를 제거합니다. 형질전환 72시간 후에 수행하며, 폐기물은 항상 vercon 용액 또는 기타 적절한 소독제로 처리해야 합니다. 따뜻한 phosphate buffered saline으로 세포를 한 번 부드럽게 세척합니다.각 플레이트에 25 milliliters의 따뜻한 PBS를 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 제거합니다. 50 milliliter 튜브에 현탁액을 수집한 후, 800 times G에서 10분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 상층액을 버리고 펠렛을 재현탁합니다.조직 배양 플레이트당 150 millimolar 염화나트륨 완충액 10 milliliters 내에서, 현탁액을 두 개의 50 milliliter 튜브에 나누어 담습니다. 다음으로 10%Sodium deoxy coate 신선 조제 용액으로 세포를 용해합니다. 그 후 핵산을 제거하기 위해 benzoate nuclease를 첨가합니다.튜브를 충분히 혼합한 후 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 3000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거합니다. 헤파린의 차단을 방지하기 위해 모든 세포 부스러기가 제거되었는지 확인하며 상층액을 새 50 mL 튜브로 옮깁니다.재조합 AAV 정제를 위한 컬럼. 10 milliliters의 염화나트륨 완충액을 시린지에 넣고, 페리스타틱 펌프를 사용하여 용액이 분당 1 milliliter의 속도로 컬럼을 통과하도록 하이트랩 헤파린 컬럼을 설정합니다. 헤파린 컬럼에 기포가 유입되지 않도록 하는 것이 중요합니다.150 millimolar 염화나트륨 완충액 10 milliliters로 컬럼을 평형화합니다. 바이러스 용액 50 milliliters를 컬럼에 도포하고 용액이 통과하도록 둡니다. 그다음 100 millimolar 염화나트륨 완충액 20 milliliters로 컬럼을 세척합니다.5 mL 주사기를 사용하여 컬럼을 1 mL의 20 mM sodium chloride 버퍼로 세척한 후, 이어서 1 mL의 300 mM 버퍼로 세척합니다. 이때 통과액은 버립니다.5 mL 주사기를 사용하여 서서히 압력을 가하면서, 고농도의 용리 버퍼를 점진적으로 적용해 컬럼에서 바이러스를 용리시킵니다. 용리액은 15 mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 100,000 MWCO(분자량 컷오프)의 AmCon Ultra 4 원심 필터 장치를 사용하여 벡터를 농축합니다.컬럼 용출액 4 mL를 농축기에 넣고 2000 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리를 반복하면 농축 부피는 약 250 µL가 되어야 합니다. 통과액을 버리고 남은 바이러스 용액을 농축기에 다시 넣습니다.바이러스에 PBS 250 µL를 추가하여 최종 부피를 500 µL로 맞춘 후 농축기에서 꺼냅니다. 마지막 단계로, 벡터를 직경 13 mm, 0.2 µm 시린지 필터로 여과하여 바이러스 스톡을 정제합니다. Cree 의존성 R AAV의 타이트레이션을 위해 HEC 2 9 3 세포를 파종하여 합치도가 40~50%가 되도록 polyol lysine 코팅된 유리 커버슬립 18개를 준비합니다.Cre recombinase를 안정적으로 발현하는 HEC 2 9 3 세포를 사용하십시오. 서면 프로토콜에 설명된 대로 RAAV 벡터를 연속 희석하여 각 웰에 감염시키며, 희석 배수당 3개의 웰을 사용합니다. 72시간 배양 후, 배지에 동일 부피의 4% formaldehyde를 첨가하여 실온에서 10분 동안 HEC 2 9 3 세포를 고정합니다. 그 후 세포를 PBS로 3회, 증류수로 1회 헹굽니다. 그런 다음 마운팅 용액을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드 위에 올립니다.세포 면을 아래로 향하게 합니다. 감염된 세포가 남아 있으면서 희석 배수가 가장 높은 세 개의 웰에서 트렌칭된 세포 수를 측정합니다. 이들의 평균값을 구한 뒤 희석 배수를 곱하여, 마이크로리터당 감염 단위 수를 산출합니다. 강화 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 바이러스로 형질전환된 HEC 2 9 3 세포가 나타나 있습니다.일반적으로 마이크로리터당 약 6 × 10⁶ 개의 감염성 입자 정도의 일관된 타이터(titer)가 얻어집니다. 여기는 성체 par albumin Cre 형질전환 마우스의 서로 다른 뇌 영역에 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 Cre 의존적 rAAV를 정위 고정 주입한 사례들을 보여줍니다. 바이러스성 녹색 형광 단백질 발현은 서로 다른 표적 영역 내의 Cre 발현 뉴런으로 제한됩니다.이 예시에서는 망상 시상과 담구팔리두스, 치상회 및 해마의 CA1 영역에서 녹색 형광 단백질 면역 반응성을 보여줍니다. 숙달된 후라면, 적절히 수행했을 때 바이러스 생산에 7~8일, 역가 측정에 3일이 소요됩니다.

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt;1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.

대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산

본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.

바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 임상 및 전임상 유전자 전달에 널리 사용됩니다. rAAV의 과소평가된 용도는 정제 없이 배양된 세포의 강력한 transduction입니다. rAAV를 처음 접하는 연구자를 위해 transgene cassette 클로닝, 미정제 벡터 생산 및 세포 배양 transduction을 위한 프로토콜을 제공합니다.

Unpurified Recombinant Adeno-associated Viral Vectors를 사용한 배양 세포에서의 전이유전자 발현

아데노 관련 바이러스는 현탁 세포 배양에서 생성되며 이중 요오드화놀 밀도 구배 원심분리로 정제됩니다. 총 바이러스 수율을 높이고, 바이러스 침전의 위험을 줄이고, 최종 바이러스 산물을 더욱 농축하기 위한 단계가 포함되어 있습니다. 예상되는 최종 역가는10,12 바이러스 입자/mL에 도달하며 전임상 in vivo 사용에 적합합니다.

In Vivo 응용 분야를 위한 Iodixanol Density Gradient Centrifugation에 의한 아데노 관련 바이러스의 현탁 배양 생산 및 정제

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

유전자 치료 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 문제를 해결할 수 있는 혁신적인 방법에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 여기에서는 cell factory 플랫폼을 사용하여 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하여 in vivo 연구의 품질 표준을 충족하는 고유한 방법을 제시합니다.

Cell Factory Platform을 활용하여 고역가, 고품질 아데노 관련 바이러스 벡터를 생성하기 위한 간소화되고 표준화된 절차

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 게놈 복제의 정확한 정량화는 매우 중요하지만 표준화된 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈 역가를 신뢰성 있게 정량화하기 위해 정제된 AAV 샘플을 준비하고 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd_PCR)을 수행하기 위한 검증된 방법을 설명합니다.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

학습하세요 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산 및 정제 방법을. 헤파린 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 고순도 바이러스를 얻고, 면역형광 현미경으로 정확한 타터 측정을 수행합니다.

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

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