Name: 작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 이중 친화성 태그를 이용한 단백질 정제법으로, E. coli에서 발현한 재조합 단백질을 HSA 및 Z 도메인 컬럼을 통해 고순도로 정제하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 특성의 단백질에 적용 가능합니다.

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이 프로젝트는 Knut와 앨리스 발렌 버그 재단과 스웨덴 연구위원회에 의해 투자되었다.

1. 대상 gene/ABDz1-tagged 융합의 복제가 구축 <ol><li> 플라스미드 표현의 대상 유전자 (플라스미드 포함 ABDz1이 물질 전송 계약을 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다)의 N - 터미널 내고 적합한 제한 사이트에 둘러싸인 ABDz1 유전자의 PCR 단편을 준비합니다. </li><li> 다니엘 정화 표현 벡터 및 적절한 반응 버퍼에서 선택한 제한 효소로 PCR 파편. 결합하기 전에 제품을 정화. </li><li> 관심의 유전자를 포함하는 발현 벡터에 제한 ABDz1 조각 Ligate와 E로 내고 제품을 변환 대장균 (원래 메서드에 RR1ΔM15 변형이 8 사용되었습니다). 선택에 적합한 항생제로 보충 한천 플레이트에 변형 세포를 확산. </li><li> PCR 화면 몇 식민지와 순서는 DNA 배열에 의해 결과 표현 카세트를 확인합니다. </li><li> 순서 verif의 야간 문화 플라스미드 준비처음엔 식민지와 선호하는 표현 스트레인 (인간 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생산을 향상시키기 위해 플라스미드 pRARE를 호스팅하는 로제 원래 방법 E. 대장균 (DE3)에 사용되었다)로 변환. </li></ol> 2. 단백질 표현 <ol><li> 5g / L 효모 추출물과 적절한 항생제로 보충 tryptic 간장 국물의 10 ML에 하나의 박테리아 식민지의 예방. ° C 야간 37 150 rpm으로 품어. </li><li> 100 ML 신선한 매체 숙박 문화의 한 ML을 예방하고 세포 로그 성장 단계에 도달했을 때 단백질 표현을 (LAC 오스 오 페론이 활용되었을 때 이소 프로필 - β - D - thiogalactoside 원래 1 ㎜) 유도. </li><li> 원심 분리에 의해 ° C 야간 및 수확 세포 25 150 rpm으로 품어. </li></ol> 3. 직교 친화 정화 <ol><li> 25 ML 실행 버퍼 (25 MM 트리스 - HCL, 200 MM NaCl, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.05 % (W / V) 십대 초반 20, 산도 8.0)에 펠렛을 Resuspend하고 일을 방해60 % 진폭 3 분 1.0/1.0 펄스에서 sonication하여 전자 세포. 샘플을 원심 더욱 정화하기 전에 뜨는을 (0.45 μm의)이있는 대상 단백질을 필터링합니다. </li><li> 적당한 단백질 정제 시스템 1 ML / 분 버퍼를 실행하는 10 열 볼륨 (CV)와 이전에 공급자의 권고에 따라 HSA와 결합 중 1 ML HSA 세파 로스 칼럼이나 보건국 활성화 열을, 평형. 0.5 ML / 분 세균성 lysate를로드하고 다음 유량 1 ML / 분 재설정하십시오. </li><li> 세척 버퍼 5 CV (5 MM NH 4 AC, 산도 5.5) 다음에 실행하는 버퍼의 5 CV와 컬럼을 씻으십시오. </li><li> 1 ML / 분 용출 버퍼 (0.5 M HAC, 산도 2.5)와 함께 샘플을 Elute 더욱 정화를위한 eluted 정상에서 분수를 선택하는 280 nm의에서 모니터 흡수를 분수를 수집합니다. </li><li> 최고의 단백질 농도와 풀 분수는 확실히 실행 버퍼에 두 번 희석 (20 MM 인산, 150 MM NaCl, 산도 7.2)와산도 주변 중립 있는지 확인하십시오. 산도 필요한 경우를 높이기 위해 1 M 트리스 - HCL pH를 8을 추가합니다. </li><li> 1 ML / 분 물론 실행 버퍼의 10 이력서와 equilibrated되었습니다 1 ML의 HiTrap의 MabSelect 물론 열을 0.5 ML / 분 샘플을로드합니다. 1 ML / 로딩 후 분 흐름 속도를 재설정합니다. </li><li> 물론 실행 버퍼 5 CV (5 단계)로 컬럼을 씻고 0.2 M HAC, 산도 2.7과 단백질을 elute. 민감한 대상 단백질에 대한 eluate는 트리스 - HCL를 추가하여 수령시 직접 무력화 수 있습니다. </li></ol> 색층 단계 MabSelect에서 eluate을 반대하는 경우에는 물론 열이 버퍼 (3.1 단계)을 실행에 희석하고 산도가 1 M 트리스 - HCL의 추가에 의해 주위에 8 증가 수 있습니다. 물론 매트릭스가 두 번째 단계에서 고용되었을 때 일반적으로 좁아 봉우리가 관찰됩니다. 4. 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (SDS - PAGE)에 의한 순도 평가 <ol><li> 에서 정화 분수로드원하는 경우, 질량 분석법에 의한 정화 제품의 분자량을 분석한 다음, SDS - PAGE을 감소합니다. 그것은 ABDz1에서 무료 시스테인이 아닌 감소 조건에서 제품의 dimerization을 일으킬 수 있으므로 충분히 샘플을 줄이는 것이 중요합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 원리의 증거로서, ABDz1 태그에 의해 용이 직교 친화 정화는 서로 다른 용해도 클래스, 분자 무게 및 isoelectric 포인트 (표 1)을 나타내는 세 인간의 목표 단백질에 대한 평가되었다. ABDz1 유전자가 유전자 대상 유전자에 융합되었고 구조가 E. 대장균으로 표현했고 그림 2는 연속적 방법의 모든 단계에 대한 플로우 차트를 보여줍니다. 직교 프로토콜에 의해 정화에 따라 다른 지점에서 수집된 샘플을 SDS - PAGE (그림 3)에 의해 분석되었다. 결과는 명확하게 듀얼 태그와 두 매우 구체적인 정화 단계의 유틸리티를 보여줍니다. 합리적인 순결은 AC하더라도로 젤에서 본 최초의 정화 단계 이후 hieved, 연속 단계는 물론 매우 까다로운 애플 리케이션에 적합한 매우 순수한 제품을 산출. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. bispecific ABDz1 태그의 선택에 사용되는 조합 도서관의 디자인. 46 아미노산 알부민 결합 도메인 안정적인 세 나선 번들로 폴드 그리고 그것은 주로 두 번째 나선형에있는 인간 혈청 알부민에 대한 구속력이 사이트가 포함되어 있습니다. 유전자 첫 번째와 세번째에 위치하고 나선 열한 표면에 노출된 아미노산을 randomizing함으로써, 소설 바인딩 표면은 설계되었습니다. 열한 위치는 그림에 표시된 및 Kraulis 외에 따라 번호가 9.되었습니다. 파지에 대한 표현 조합 도서관은, bispecific ABDz1 분자가 확인되었다 포도상 구균 단백질의 Z - 도메인의 이합체에 대한 biopanning 따라. <img files> 그림 2. 직교 친화 정화 프로토콜에 대한 단순 플로우 차트. ABDz1 시퀀스를 포함하는 PCR - 단편은 적절한 발현 벡터에 대한 관심의 유전자와 (N - 말기) 출혈도 잡았 있습니다. 내고 제품은 E.으로 변환됩니다 순서 확인 및 플라스미드 준비 대장균. 표현 호스트로 변환 후, 재조합 단백질 표현을위한 대규모 문화는 초기 야간 문화에서 설정됩니다. 박테리아는 원심 분리에 의해 수확 및 대상 단백질을 포함하는 박테리아 lysate를 만들어 sonication하여 lysed 있습니다. 잔류 고체 입자를 제거하는 여과 단계 후, lysate는 연속 두 정화 단계를 진행하여 액체 처리 시스템에 직교 친화 정화를 받게됩니다. 모두 정화 단계에서 Eluted 봉우리는 샘플과 정결을 평가하기 위해 SDS - PAGE에 의해 평가하고 t에 비해 아르그는 정화하기 전에 lysate. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 표명과 ABDz1과 융합의 정화 대상 단백질의 SDS - PAGE 분석. 다른 속성을 나타내는 ABDz1, 그리고 ABDz1 태그 자체 융합으로 표현 세 단백질의 세균성 lysate에서 가져온 샘플은 물론 열 MabSelect 다음 HSA - 열에 정화에서 해당 봉우리에서 샘플과 함께 수집된 (A) . 레인 1-4 9-12 MabSelect 물론 정화 (두 번째 단계)에서 정화, HSA - 정화의 차선 5-8 (첫 단계)와 골목길 전에 lysates에서 샘플을 나타냅니다. ABDz1 - 141377, ABDz1 - HT875, ABDz1 - HT2375과 ABDz1 : 샘플은 다음과 같은 순서로로드됩니다. 또한, 동일한 컬럼에 대한 역순으로 정화 같은 lysates로부터 얻은 샘플을 분석했다 (B). 레인은 정화, 차선 4-6 F 전에 lysates에서 샘플을 1-3 대표롬 MabSelect 진짜로 정화 (첫 단계)와 HSA - 정화 (두 번째 단계)에서 레인 7-9. 샘플은 (A)하지만 태그 자체가 포함되지 않은에서와 같은 순서로로드했습니다. 그 결과는이 두 단계 방법에 관계없이 단계가 적용되는 순서의 고도 정화 단백질을 산출 것이 분명하다. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 B </td><td> 대상 단백질 Uniprot C </td><td> 분자 중량 (kDa) </td><td> 용해도 클래스 D </td><td> 분자량 융합 제품의 (kDa) </td><td> Isoelectric 지점 융합 제품의 </td></tr><tr><td> 141,377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17.4 </td><td> 4 </td><td> 23.7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10.8 </td><td> 3 </td><td> 17.1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15.2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> 혼자 ABDz1 태그의 분자량 6.3 kDa, isoelectric 포인트 6.7입니다. </li><li> 대상 단백질은 Uniprot 단백질의 일부​​를 나타냅니다. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> N - 터미널과 단백질 조각 그의 6 ABP 10 용해도 클래스. </li></ol> 표 1. ABDz1 태그와 대상 단백질과 융합 제품은 원칙적으로 연구의 증거로 평가. 다양한 분자량, 용해도 및 isoelectric 포인트 세 가지 독특한 인간의 단백질은 직교 친화 방식에 의해 표현과 정화를 위해 선택되었습니다.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 직교 친화 정화 프로토콜은 표적 단백질의 광범위한 효율적인 정화 수 있습니다. 소설 바인딩 표면과 알부민 결합 도메인의 고유 바인딩 사이트를 결합하여, 작은 bispecific 단백질 태그가 개발되었다. 그것이 단순히 어떤 선호하​​는 발현 벡터에 대한 관심의 단백질로 복제 및 융합 표현 할 수 있기 때문에 태그를 활용하는 것은 매우 간단합니다. 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 표준 장비는 두 단계 단백질 정화에 대한 고용 수 있습니다. ABDz1 태그의 기능을 효율적으로 두개의 바인딩 표면을 노출하기 위해 도메인의 올바른 접힘에 의존 때문에, 방법은 용해 형태로 표현 단백질로 제한하고 denaturing 조건 하에서 purifications 적합하지 않습니다. 그들은 MabSelect 물론 매트릭스에서 Z - 도메인에 ABDz1의 바인딩을 방해 이후 감소 요원도 피해야한다. 직교 친화 purifica기는 매우 여러 까다로운 응용 프로그램에서 단백질을 정제의 요구 사항을 충족하기 위해 전통적인 방법에 대한 유용한 대안을 제공합니다. 동시에,이 방법은 다른 정화 전략이 연속적으로 사용되는 조합 태그에 대한 필요가 없습니다. 기본 목표 단백질을 필요로하는 어플 리케이션의 경우, 프로 테아제의 절단 사이트는 가능한 ABDz1 태그 11 효소 제거를 렌더링 도입 수 있습니다. 또한 ABDz1 태그는 날짜 설명한 최초의 bispecific 중소 접힌 단백질 도메인이다. 그 두 대상 특정 친화 상호 작용에 따라 정화 전략을 제공하는 지 유일하다. 앞으로 그것은 쉽게 사용할 수 있으며 저렴한 색층 수지와 호환되는 새로운 바인딩 표면을 가지고 소설 bispecific 태그를 개발하여이 개념을 확장하는 흥미로운 것입니다. 예를 들어, 태그가 호환 기본 잔류물와 알부민 바인딩에 관련된 아미노산을 대체하여교환 크로마 토그래피에 도달 수 있습니다. 이와 유사한 개념은 각각 Z 산 12 음이온과 양이온 교환과 호환 Z 기본 13으로 알려진 태그를 생성하기 위해 Z - 도메인을 담당 엔지니어링에 의해 효과가 입증되었습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> E. 대장균 RR1ΔM15 </td><td> 미국 유형 문화 수집 </td><td> 35,102 </td></tr><tr><td> 로제 E. 대장균 (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70,954 </td></tr><tr><td> Tryptic 콩 국물 </td><td> Difco </td><td> 211,822 </td></tr><tr><td> 효모 추출물 </td><td> Difco </td><td> 212,720 </td></tr><tr><td> Vibra 셀 sonicator </td><td> Sonics 및 자료 </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA 세파 로스 </td><td> Pharmacia 생명 공학 </td><td> 전 제품 </td></tr><tr><td> 물론 HiTrap MabSelect </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap 보건국 - 활성화 HP 칼럼 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

작은 bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

프로토콜은 합리해야 재조합 단백질의 정화와 관련된 높은 비용으로 인해. 높은 처리량 노력 타겟 단백질 특정 최적화 1 필요하지 않은 일반적인 방법에 대한 수요가있다. 이것을 달성하기 위해, 유전자의 관심 유전자에 융합 될 수있는 정화 태그는 일반적으로 2 사용됩니다. 가장 널리 사용되는 화성 처리 기본 및 denaturing 조건 하에서 3 모두 정화에 적합합니다 hexa - 히스티딘 태그입니다. 태그를 생산을위한 대사 부담이 낮은이지만, 경쟁 친화 크로마 토그래피 기반 전략 1,2 높은 특이성으로 제공하지 않습니다. 여기, 46 아미노산에 두 개의 서로 다른 바인딩 사이트 bispecific 정화 태그는, 작은 단백질 도메인이 개발되었습니다. 알부민 결합 도메인 구균 단백질 G에서 파생된 인간 혈청 알부민에 강한 고유의 친화력을 가지고있다(HSA). 일레븐 표면 노출 알부민 결합 사에 관여하지 아미노산, 조합 라이브러리를 생성하는 유전자 무작위를했다. 무작위로 결합 표면 (그림 1) 배열의 소설과 단백질 라이브러리는 파지 디스플레이 기술에 의해 바인더의 선택을 촉진하는 파지 입자에 표현했습니다. dimeric에 대한 biopanning의 여러 라운드를 통해 포도상 구균 단백질 5 HSA와 소설 대상을 6 밝혀졌으며 모두 친화력이있는 작은 bispecific 분자에서 파생된 Z - 도메인. ABDz1로 불리는 소설 단백질 도메인, 다른 분자량, 용해도 및 isoelectric 포인트 대상 단백질의 선택에 대한 정화 태그로 평가되었다. 세 대상 단백질들은 N - 테르에 융합하고 이후 친화력이 정화 소설 태그 Escherishia 대장균으로 표현했다. 고정 HSA 또는 Z - 도메인 중 열을 초기 정화는 relati 결과vely 순수한 제품. bispecific 태그로 2 단계 친화 정화는 단백질 순도의 상당한 개선 결과. Z - 도메인 색층 미디어 확실히 예 MabSelect위한 고정화 항체의 정화를 위해 즉시 사용 가능하며 HSA 쉽게 화학적으로 두 번째 매트릭스를 제공하는 미디어에 결합하실 수 있습니다. 복구 대상 단백질의 순도에 대한 높은 수요가있을 때이 방법은 특히 유리한 것입니다. 표현 호스트의 신진 대사 부담이 태그의 작은 크기로 인해 제한되는 동안 태그의 bifunctionality는 두 가지 색층 단계가 사용할 수 있습니다. 그것은 여러 개의 태그를 조합하여 1,7에 사용 어디에 조합 태그라는 경쟁력있는 대안을 제공합니다.

소설과 고효율 두 단계 친화도 크로마 토그래피 프로토콜이 개발되었고 자세하게 설명되어 있습니다. 방법은 두 개의 본질적 동질성과 작은 정화 태그를 기반으로하고 다른 특성을 가진 대상 단백질의 다양한 적용됩니다.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

재조합 단백질 정제와 관련된 높은 비용으로 인해 프로토콜의 합리화가 필요합니다. 고처리량 연구를 위해서는 ...

다음 실험의 전반적인 목적은 2단계 친화성 정제 절차를 통해 매우 순수한 재조합 단백질을 생산하는 것입니다. 이를 위해 알부민 결합 도메인 기반의 이중 특이적 정제 태그를 표적 유전자가 포함된 발현 벡터에 클로닝한 후, e coli에서 융합 단백질을 발현시킵니다. 두 번째 단계로, 표적 단백질이 포함된 박테리아 용해물을 인간 혈청 알부민(HSA)이 고정된 크로마토그래피 컬럼으로 정제합니다.이어서 staphylococcal protein A에서 유래된 고정화 Z 도메인이 포함된 MAB select superior resistance 또는 sure 컬럼을 사용하여 추가 정제를 수행합니다. 이를 통해 까다로운 응용 분야에 적합한 고순도의 생성물을 얻을 수 있습니다. 다음으로, 목적 단백질이 균질하게 성공적으로 정제되었는지 확인하기 위해 SDS page 및 필요한 경우 질량 분석법으로 순도를 평가합니다. 결과에 따르면, 본 프로토콜에서 활용된 새로운 이중 특이적 정제 태그를 사용한 단일 단계 정제와 비교했을 때 두 번의 연속적인 단계 이후 효율적인 정제가 이루어졌음을 보여줍니다. 1단계 친화성 정제와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 타겟 단백질의 특성에 관계없이 단 하나의 친화성 핸들만을 이용하는 간단한 프로토콜로 순수 단백질을 얻을 수 있다는 점입니다.이 방법은 매우 다양한 특성을 가진 단백질에 사용할 수 있습니다. 또한, 태그의 크기가 매우 작기 때문에 박테리아 숙주에 의해 쉽게 생성됩니다. 일반적으로 이 정제 과정을 처음 접하는 연구자들은 이 방법이 매우 간단하고 명확하다고 느낄 것입니다.중요한 단계는 두 번째 컬럼에 로딩하기 전에 샘플의 pH를 조절하는 것입니다. streptococcal protein G에서 유래한 기존의 albumin binding domain에 추가 결합 부위를 통합함으로써, 두 가지 고유한 친화력을 가진 작은 정제 태그가 개발되었습니다. 46개의 아미노산으로 구성된 albumin binding domain은 안정적인 three helix bundle 구조로 접히며, 주로 두 번째 헬릭스에 위치한 human serum albumin 결합 부위를 포함합니다. 첫 번째와 세 번째 헬릭스에 위치한 11개의 표면 노출 아미노산을 유전적으로 무작위화하여 새로운 결합 표면을 설계하였으며, 파지에 발현된 조합 라이브러리를 사용하여 staphylococcal protein A 유래 Z domain에 대해 여러 차례의 biopanning을 수행한 결과, HSA와 Z domain 모두에 친화력을 가진 A BDZ one이라는 이중특이성 분자가 생성되었습니다. 이중특이성 융합 태그 발현 플라스미드를 준비하려면, 적절한 제한 효소 부위로 측면이 둘러싸인 A BDZ one 유전자의 PCR 단편을 준비하고, 발현 플라스미드 내 표적 유전자의 말단을 처리하십시오. 적절한 반응 버퍼 내에서 선택한 제한 효소를 사용하여 A BDZ one PCR 단편과 관심 유전자가 포함된 정제된 발현 벡터를 절단하고, ligation 전에 생성물을 정제하십시오.다음으로, 제한효소로 절단된 A BDZ 단일 단편을 목적 유전자가 포함된 발현 벡터에 라이게이션하고, 라이게이션 산물을 e coli에 형질전환합니다. 형질전환된 세포를 선택에 적합한 항생제가 첨가된 아가 플레이트에 도말합니다. 몇 개의 콜로니를 PCR로 스크리닝하고, DNA 시퀀싱을 통해 결과 발현 카세트를 서열 확인합니다.마지막으로, 서열이 확인된 콜로니의 하룻밤 배양액으로부터 플라스미드를 준비하고, 이를 선호하는 발현 균주에 형질전환하여 표적 단백질을 발현시킵니다. 말단에 새로운 태그가 융합된 단백질을 발현시키기 위해, 먼저 단일 박테리아 콜로니를 5 g/L의 효모 추출물과 적절한 항생제가 첨가된 10 mL의 tryptychs soy broth에 접종하고 150 RPM, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 100 mL의 신선한 배지에 접종하고 단백질 발현을 유도합니다.세포가 대수 성장기에 도달하면, 단백질 유도 후 세포를 150 RPM, 25 °C에서 하룻밤 동안 배양하고 다음 날 원심분리로 세포를 수확합니다. A BDZ one 융합 단백질의 직교 친화성 정제는 HSA 또는 zoma가 고정된 컬럼을 이용한 1차 정제를 통해 이루어집니다. 이후 이중 특이적 태그의 두 번째 친화성을 이용해 연속적인 정제 단계를 수행합니다.MA select sure와 같이 Z 도메인이 고정된 크로마토그래피 매체는 항체 정제에 널리 사용됩니다. 한편, HSA는 매체에 화학적으로 결합시켜 직교 친화성 정제를 진행하기 위한 두 번째 매트릭스로 제공될 수 있습니다. 펠릿을 25 milliliters의 러닝 버퍼에 현탁하십시오. 그런 다음 60% 진폭에서 1초 펄스와 1초 휴지를 반복하여 총 3분 동안 초음파 파쇄로 세포를 파쇄하십시오.시료를 원심분리한 후, 추가 정제 단계에 앞서 표적 단백질이 포함된 상층액을 0.45 micron 필터로 여과합니다. 다음으로, 적절한 단백질 정제 시스템을 사용하여 1 mL HSA spheros 컬럼 또는 HSA가 결합된 NHS 활성화 컬럼을 running buffer 10 컬럼 부피로 1 mL/min의 속도로 평형화합니다. 평형화가 완료되면 박테리아 용해물을 0.5 mL/min으로 로딩하고, 유속을 1 mL/min으로 다시 설정한 후 running buffer 5 컬럼 부피와 이어서 washing buffer 5 컬럼 부피로 컬럼을 세척합니다.분당 1 mL의 속도로 용리 버퍼를 사용하여 샘플을 용리하고 분획물을 수집합니다. 280 nm에서 흡광도를 모니터링하여 용리 피크의 분획물을 선택합니다. 추가 정제를 위해 단백질 농도가 가장 높은 분획물들을 모은 후 2배로 희석합니다.러닝 버퍼를 준비하고 pH가 중성 부근인지 확인하십시오. 이 단계는 Z 도메인에 단백질이 결합하는 데 매우 중요합니다. 필요한 경우 pH를 높이기 위해 1 M Tris HCl pH 8을 첨가하십시오.다음으로, 0.5 milliliters per minute의 속도로 샘플을 1 milliliter high trap MA sure column에 로딩하며, 이때 컬럼은 sure running buffer로 평형화되어 있어야 합니다. 유속을 1 milliliter per minute로 재설정한 후, sure running buffer 5 column volumes로 컬럼을 세척합니다. 그 후, 민감한 표적 단백질의 경우 pH 2.7의 0.2 molar acetic acid를 사용하여 단백질을 용출합니다.EIT는 수집 즉시 T tris를 첨가하여 직접 중화할 수 있습니다. 단백질 순도는 H-C-L-S-D-S page를 사용하여 평가할 수 있습니다. A BDZ one 내의 유리 시스테인은 비환원 조건에서 생성물의 이량체화를 유발할 수 있으므로, 샘플을 완전히 환원시키는 것이 중요합니다.마지막 단계로, HSA 컬럼과 이어서 MA select sure 컬럼을 이용한 직교 프로토콜로 정제한 후, 질량 분석법을 통해 정제된 생성물의 분자량을 분석할 수 있습니다. 여러 정제 지점에서 수집한 서로 다른 샘플들을 SDS page로 분석하였습니다. 샘플에는 A BDZ one 태그 단독 물질뿐만 아니라, 서로 다른 용해도 등급, 분자량 및 등전점을 나타내는 세 가지 서로 다른 인간 표적 단백질이 융합된 AB DZ one이 포함되었습니다.1번부터 4번 레인은 세 가지 서로 다른 AB DZ one 융합 단백질과 AB DZ one 태그 자체의 정제 전 단백질 용해물을 보여줍니다. 5번부터 8번 레인은 해당 단백질들의 HSA 정제 단계 결과를 보여줍니다. 마지막으로 9번부터 12번 레인은 최종 mAbs select Sure 정제 단계의 결과입니다.또한, 동일한 컬럼에서 역순으로 정제된 동일한 용해물로부터 얻은 샘플들을 여기서 분석하였습니다. 1번에서 3번 레인은 정제 전의 용해물을 나타내며, 4번에서 6번 레인은 MAB Select Sure 컬럼을 이용한 1차 정제 단계 후에 얻은 것입니다. 7번에서 9번 레인의 고순도 생성물은 최종 HSA 정제의 결과입니다.결과는 이중 태그와 두 단계의 고특이적 정제 과정의 유용성을 분명하게 보여줍니다. 겔 분석에서 확인된 바와 같이 1차 정제 단계 후에도 합리적인 수준의 순도가 달성되지만, 이어지는 단계를 통해 매우 까다로운 응용 분야에 적합한 초고순도 생성물을 얻을 수 있습니다. 이 방법의 핵심인 정제 단계만 숙달하면, 한 사람이 수 시간 내에 수행하여 다양한 응용 분야에 적합한 고순도 재조합 단백질을 얻을 수 있습니다.예를 들어, 이 절차에 따라 정제된 생체 분자는 복합체의 결합 강도와 같은 질문에 답하기 위한 상호작용 연구 등 다른 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이러한 이중 친화성 태그를 활용하여 어떻게 실제로 순수한 단백질 생성물을 얻을 수 있는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Biology

생물학

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