작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

다음 실험의 전반적인 목적은 2단계 친화성 정제 절차를 통해 매우 순수한 재조합 단백질을 생산하는 것입니다. 이를 위해 알부민 결합 도메인 기반의 이중 특이적 정제 태그를 표적 유전자가 포함된 발현 벡터에 클로닝한 후, e coli에서 융합 단백질을 발현시킵니다. 두 번째 단계로, 표적 단백질이 포함된 박테리아 용해물을 인간 혈청 알부민(HSA)이 고정된 크로마토그래피 컬럼으로 정제합니다.

이어서 staphylococcal protein A에서 유래된 고정화 Z 도메인이 포함된 MAB select superior resistance 또는 sure 컬럼을 사용하여 추가 정제를 수행합니다. 이를 통해 까다로운 응용 분야에 적합한 고순도의 생성물을 얻을 수 있습니다. 다음으로, 목적 단백질이 균질하게 성공적으로 정제되었는지 확인하기 위해 SDS page 및 필요한 경우 질량 분석법으로 순도를 평가합니다. 결과에 따르면, 본 프로토콜에서 활용된 새로운 이중 특이적 정제 태그를 사용한 단일 단계 정제와 비교했을 때 두 번의 연속적인 단계 이후 효율적인 정제가 이루어졌음을 보여줍니다. 1단계 친화성 정제와 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 타겟 단백질의 특성에 관계없이 단 하나의 친화성 핸들만을 이용하는 간단한 프로토콜로 순수 단백질을 얻을 수 있다는 점입니다.

이 방법은 매우 다양한 특성을 가진 단백질에 사용할 수 있습니다. 또한, 태그의 크기가 매우 작기 때문에 박테리아 숙주에 의해 쉽게 생성됩니다. 일반적으로 이 정제 과정을 처음 접하는 연구자들은 이 방법이 매우 간단하고 명확하다고 느낄 것입니다.

중요한 단계는 두 번째 컬럼에 로딩하기 전에 샘플의 pH를 조절하는 것입니다. streptococcal protein G에서 유래한 기존의 albumin binding domain에 추가 결합 부위를 통합함으로써, 두 가지 고유한 친화력을 가진 작은 정제 태그가 개발되었습니다. 46개의 아미노산으로 구성된 albumin binding domain은 안정적인 three helix bundle 구조로 접히며, 주로 두 번째 헬릭스에 위치한 human serum albumin 결합 부위를 포함합니다. 첫 번째와 세 번째 헬릭스에 위치한 11개의 표면 노출 아미노산을 유전적으로 무작위화하여 새로운 결합 표면을 설계하였으며, 파지에 발현된 조합 라이브러리를 사용하여 staphylococcal protein A 유래 Z domain에 대해 여러 차례의 biopanning을 수행한 결과, HSA와 Z domain 모두에 친화력을 가진 A BDZ one이라는 이중특이성 분자가 생성되었습니다. 이중특이성 융합 태그 발현 플라스미드를 준비하려면, 적절한 제한 효소 부위로 측면이 둘러싸인 A BDZ one 유전자의 PCR 단편을 준비하고, 발현 플라스미드 내 표적 유전자의 말단을 처리하십시오. 적절한 반응 버퍼 내에서 선택한 제한 효소를 사용하여 A BDZ one PCR 단편과 관심 유전자가 포함된 정제된 발현 벡터를 절단하고, ligation 전에 생성물을 정제하십시오.

다음으로, 제한효소로 절단된 A BDZ 단일 단편을 목적 유전자가 포함된 발현 벡터에 라이게이션하고, 라이게이션 산물을 e coli에 형질전환합니다. 형질전환된 세포를 선택에 적합한 항생제가 첨가된 아가 플레이트에 도말합니다. 몇 개의 콜로니를 PCR로 스크리닝하고, DNA 시퀀싱을 통해 결과 발현 카세트를 서열 확인합니다.

마지막으로, 서열이 확인된 콜로니의 하룻밤 배양액으로부터 플라스미드를 준비하고, 이를 선호하는 발현 균주에 형질전환하여 표적 단백질을 발현시킵니다. 말단에 새로운 태그가 융합된 단백질을 발현시키기 위해, 먼저 단일 박테리아 콜로니를 5 g/L의 효모 추출물과 적절한 항생제가 첨가된 10 mL의 tryptychs soy broth에 접종하고 150 RPM, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 100 mL의 신선한 배지에 접종하고 단백질 발현을 유도합니다.

세포가 대수 성장기에 도달하면, 단백질 유도 후 세포를 150 RPM, 25 °C에서 하룻밤 동안 배양하고 다음 날 원심분리로 세포를 수확합니다. A BDZ one 융합 단백질의 직교 친화성 정제는 HSA 또는 zoma가 고정된 컬럼을 이용한 1차 정제를 통해 이루어집니다. 이후 이중 특이적 태그의 두 번째 친화성을 이용해 연속적인 정제 단계를 수행합니다.

MA select sure와 같이 Z 도메인이 고정된 크로마토그래피 매체는 항체 정제에 널리 사용됩니다. 한편, HSA는 매체에 화학적으로 결합시켜 직교 친화성 정제를 진행하기 위한 두 번째 매트릭스로 제공될 수 있습니다. 펠릿을 25 milliliters의 러닝 버퍼에 현탁하십시오. 그런 다음 60% 진폭에서 1초 펄스와 1초 휴지를 반복하여 총 3분 동안 초음파 파쇄로 세포를 파쇄하십시오.

시료를 원심분리한 후, 추가 정제 단계에 앞서 표적 단백질이 포함된 상층액을 0.45 micron 필터로 여과합니다. 다음으로, 적절한 단백질 정제 시스템을 사용하여 1 mL HSA spheros 컬럼 또는 HSA가 결합된 NHS 활성화 컬럼을 running buffer 10 컬럼 부피로 1 mL/min의 속도로 평형화합니다. 평형화가 완료되면 박테리아 용해물을 0.5 mL/min으로 로딩하고, 유속을 1 mL/min으로 다시 설정한 후 running buffer 5 컬럼 부피와 이어서 washing buffer 5 컬럼 부피로 컬럼을 세척합니다.

분당 1 mL의 속도로 용리 버퍼를 사용하여 샘플을 용리하고 분획물을 수집합니다. 280 nm에서 흡광도를 모니터링하여 용리 피크의 분획물을 선택합니다. 추가 정제를 위해 단백질 농도가 가장 높은 분획물들을 모은 후 2배로 희석합니다.

러닝 버퍼를 준비하고 pH가 중성 부근인지 확인하십시오. 이 단계는 Z 도메인에 단백질이 결합하는 데 매우 중요합니다. 필요한 경우 pH를 높이기 위해 1 M Tris HCl pH 8을 첨가하십시오.

다음으로, 0.5 milliliters per minute의 속도로 샘플을 1 milliliter high trap MA sure column에 로딩하며, 이때 컬럼은 sure running buffer로 평형화되어 있어야 합니다. 유속을 1 milliliter per minute로 재설정한 후, sure running buffer 5 column volumes로 컬럼을 세척합니다. 그 후, 민감한 표적 단백질의 경우 pH 2.7의 0.2 molar acetic acid를 사용하여 단백질을 용출합니다.

EIT는 수집 즉시 T tris를 첨가하여 직접 중화할 수 있습니다. 단백질 순도는 H-C-L-S-D-S page를 사용하여 평가할 수 있습니다. A BDZ one 내의 유리 시스테인은 비환원 조건에서 생성물의 이량체화를 유발할 수 있으므로, 샘플을 완전히 환원시키는 것이 중요합니다.

마지막 단계로, HSA 컬럼과 이어서 MA select sure 컬럼을 이용한 직교 프로토콜로 정제한 후, 질량 분석법을 통해 정제된 생성물의 분자량을 분석할 수 있습니다. 여러 정제 지점에서 수집한 서로 다른 샘플들을 SDS page로 분석하였습니다. 샘플에는 A BDZ one 태그 단독 물질뿐만 아니라, 서로 다른 용해도 등급, 분자량 및 등전점을 나타내는 세 가지 서로 다른 인간 표적 단백질이 융합된 AB DZ one이 포함되었습니다.

1번부터 4번 레인은 세 가지 서로 다른 AB DZ one 융합 단백질과 AB DZ one 태그 자체의 정제 전 단백질 용해물을 보여줍니다. 5번부터 8번 레인은 해당 단백질들의 HSA 정제 단계 결과를 보여줍니다. 마지막으로 9번부터 12번 레인은 최종 mAbs select Sure 정제 단계의 결과입니다.

또한, 동일한 컬럼에서 역순으로 정제된 동일한 용해물로부터 얻은 샘플들을 여기서 분석하였습니다. 1번에서 3번 레인은 정제 전의 용해물을 나타내며, 4번에서 6번 레인은 MAB Select Sure 컬럼을 이용한 1차 정제 단계 후에 얻은 것입니다. 7번에서 9번 레인의 고순도 생성물은 최종 HSA 정제의 결과입니다.

결과는 이중 태그와 두 단계의 고특이적 정제 과정의 유용성을 분명하게 보여줍니다. 겔 분석에서 확인된 바와 같이 1차 정제 단계 후에도 합리적인 수준의 순도가 달성되지만, 이어지는 단계를 통해 매우 까다로운 응용 분야에 적합한 초고순도 생성물을 얻을 수 있습니다. 이 방법의 핵심인 정제 단계만 숙달하면, 한 사람이 수 시간 내에 수행하여 다양한 응용 분야에 적합한 고순도 재조합 단백질을 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 이 절차에 따라 정제된 생체 분자는 복합체의 결합 강도와 같은 질문에 답하기 위한 상호작용 연구 등 다른 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이러한 이중 친화성 태그를 활용하여 어떻게 실제로 순수한 단백질 생성물을 얻을 수 있는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.