높은 명령으로 Nanosheets에 Peptoid 폴리머 및 자기 조립의 고체 상 합성 Submonomer

이 절차의 전반적인 목표는 고체상 펩타이드 합성을 위한 간단하고 효율적인 방법과 펩타이드를 고도로 정렬된 나노 시트로 수성 자체 조립하는 방법을 설명하는 것입니다. 폴리펩타이드와 구조적으로 유사한 펩타이드는 곁사슬이 알파 탄소가 아닌 질소에 부착되는 치환된 글리신 중합체에 있습니다. 이 과정은 다른 sub monomer 방법을 통해 특정 펩타이드 서열을 합성하는 것으로 시작됩니다.

서브 모노머 방법은 각 모노머를 순차적으로 사슬에 도입하는 두 가지 간단한 화학 단계로 구성됩니다. 먼저, 고체 지지체에 부착된 아민은 브로모 아세틸화됩니다. 둘째, 브로마이드는 1차 아민으로 치환됩니다.

이러한 단계는 원하는 사슬 길이가 달성될 때까지 반복됩니다.사슬 신장 후, 펩타이드는 고체 지지체에서 절단되고 생성된 미처리 펩타이드 오일은 HPLC에 의해 정제되고 펩티드의 나노 시트로의 자체 조립을 시작하는 것을 특성화합니다. 펩타이드의 묽은 수성 완충 용액을 유리 바이알에 준비하고 부드럽게 혼합합니다. 마지막 단계로.

나노 시트는 현미경으로 검사됩니다. 결과는 두 가지 간단한 화학 단계의 반복 주기가 나노 시트로 자발적으로 자체 조립되는 시퀀스 특정 폴리머를 생성할 수 있음을 보여줍니다. 펩타이드는 단백질과 기존 고분자 사이의 특성을 가진 새로운 종류의 생체 영감 고분자입니다.

기존 폴리머와 같이 견고하고 합성 다재다능할 뿐만 아니라 단백질 및 DNA 펩타이드와 같이 고도로 조정 가능하고 염기서열 특이적이며, 생체 활성 약물의 식별 또는 인공 단백질의 설계와 같은 생물 의학 및 재료 과학의 주요 문제를 해결하기 위한 고급 재료로 부상하고 있습니다. 펩타이드의 주요 장점으로는 정밀한 염기서열 제어, 매우 다양한 구성 요소의 가용성, 효율적인 합성 및 프로테아제 안정성이 있습니다. 기본 장비 및 시판되는 시약을 포함하는 일반적인 펩타이드 수동 합성 방법이 요약되어 있어 대부분의 실험실에서 펩타이드를 쉽게 합성할 수 있습니다.

합성 단계의 시각적 시연은 매우 중요하며 고체상 합성 분야에 진입하는 개인에게 귀중한 참고 자료 역할을 합니다. 여기에서 처음으로 양친매성 펩타이드 36 mers의 정제 및 특성화와 고도로 정렬된 나노 시트로의 자체 조립을 설명했습니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 실험 장치를 설정하여 이 프로토콜을 시작합니다.

다음 단계는 명확성을 위해 일회용 폴리프로필렌 프릿 카트리지 대신 유리 반응 용기에서 수행됩니다. 100 밀리그램의 R 아미드 수지를 프릿 반응 용기에 설정 한 후 2 밀리리터의 디메틸 형태 아미드 또는 DMF를 첨가하여 수지를 팽창시키고 10 분 동안 버블링하여 교반합니다. 그런 다음 진공으로 용액을 배출하여 팽창 된 수지를 분리합니다.

다음으로, DMF에 20% 완전 메틸 피리딘 1ml를 첨가하여 FM O 그룹을 보호합니다. 2분 동안 저어주고 물기를 뺍니다. 이 과정을 12분 동안 반복한 다음 2ml의 DMF를 넣고 15초 동안 교반한 후 물기를 빼서 수지를 헹굽니다.

브로모 아세틸화(bromo acetylation) 및 치환 단계를 포함하는 첫 번째 sub monomer cycle로 펩타이드 사슬을 성장시키기 시작합니다. 브로모 아세틸화의 경우 DMF에 0.6몰 브로모 아세트산 1밀리리터와 86마이크로리터의 디 이소프로필 카보 진드기를 첨가합니다. 30분 동안 교반한 후 물기를 빼고 DMF 2ml로 헹굽니다.

다음으로, 배양 후 30-120 분 동안 메틸 파이로 제논 배양 끝에 1-2 몰 아민 1 밀리리터를 첨가하여 변위를 수행하고 2 밀리리터의 DMF로 배수 및 헹굽니다. 다시, sub monomer 주기를 반복해서 펩티드 사슬을 성장하는 것을 계속하십시오. 최종 변위가 완료된 후 2ml의 DMF로 헹굽니다.

이를 따라 디오라 메탄 세척 캡을 사용하고 분열 될 때까지 반응 용기를 보관하십시오. 절단을 시작하려면 건조된 모든 수지를 후드 내부에서 작동하는 20ml 섬광 유리 바이알로 옮기고 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 섬광 유리 바이알과 캡에 4ml의 트리플루오로 아세트산 또는 TFA 절단 칵테일을 추가합니다. 실온에서 10분에서 2시간 동안 단단히 저어줍니다.

또는 회전식 셰이커를 사용하여 용액을 혼합합니다. 일회용 폴리프로필렌 프릿 카트리지를 통해 수지를 여과하여 미리 계량된 20ml 섬광 유리 바이알에 넣어 TFA 절단 용액을 수집합니다. 다음으로, 1ml의 신선한 분열 칵테일을 추가하여 수지를 헹구고 잔류 펩타이드를 수집합니다.

이것을 반복하고 두 번 헹굽니다. 부드러운 질소 흐름을 불어넣거나 비오 충전을 사용하여 TFA를 증발시킵니다. V 10 증발기 빨간색은 원유를 1 대 1 아세토 니트릴과 물의 6 밀리리터에 용해시킵니다.

그런 다음 샘플을 동결하고 동결 건조합니다. 이 과정은 두 번째 동결 건조 후 한 번 더 반복해야 합니다. 곰팡이가 핀 분석용 HPLC 및/또는 전기 분무 LCMS의 조합을 통해 섭씨 영하 20도의 건조 분말로 원제품 저장소의 무게를 기록합니다.

조제품의 순도와 원하는 분자량이 존재하는지 여부는 텍스트에 설명된 절차에 따라 결정할 수 있습니다. 그런 다음 조질 펩타이드 혼합물을 서면 절차에 따라 역상 분취 HPLC로 정제할 수 있습니다. 이 섹션에서는 단일 사슬 서열 특이적 양친매성 36 me 펩타이드에서 시트를 형성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 가닥을 합성, 정제 및 동결 건조한 후, 생성된 백색 분말을 DMSO에 용해시켜 2밀리몰 스톡 용액을 만듭니다. 다음으로, 20 마이크로몰 펩타이드 용액을 준비하기 위해 하나의 Dr.Glass 파일을 얻습니다. 먼저 445마이크로리터의 milli Q 물과 50마이크로리터의 10 x 시트 형성 버퍼를 추가합니다.

혼합할 바이알을 소용돌이치십시오. 그런 다음 5마이크로리터의 2밀리몰 펩타이드 스톡 용액을 넣고 부드럽게 부풀립니다. 생성된 용액 시트는 묽은 수성 펩타이드 용액의 부드러운 교반에 의해 형성됩니다.

뚜껑이 있는 유리 바이알을 수평 위치에서 수직 위치로 천천히 기울입니다. 시트가 부드럽게 흔들리고 시트도 생성됩니다. 그러나 시트는 더 작고 많은 고품질 시트에 대해 직선 모서리가 적은 경향이 있습니다.

튜브 로테이터 또는 나노 시트의 형광 염색을 위한 맞춤형 로커를 사용하여 하루 동안 수평 축을 중심으로 유리 바이알을 천천히 회전하고 100마이크로몰 나일 레드 1마이크로리터를 나노 시트 용액 100마이크로리터에 첨가하여 1마이크로몰 나일의 최종 농도를 얻습니다. 빨간색은 환경에 민감한 염료로, 소수성 환경에 국한될 때 형광 강도가 증가합니다. 다음으로 뜨거운 물에 1%aros 용액을 만들고 플라스틱 페트리 접시에 붓습니다.

aros 용액의 두께가 약 1/8인치인지 확인하고 용액이 평평한 표면에서 방해받지 않고 냉각되도록 합니다. 아로스가 굳은 후 주걱을 사용하여 1cm x 1cm 정사각형으로 자릅니다. 그런 다음 자른 사각형을 유리 슬라이드로 옮겨 동일한 평면에서 시트를 수집하고 aros 조각에 1마이크로리터의 시트 용액을 놓습니다.

2 분 후, aros는 버퍼를 흡수하여 시트를 표면에 남겨 두어야합니다. 15분 이내에 시트를 이미지화합니다. 또는 이미지 시트 및 용액을 위해 유리 슬라이드의 20mm 직경 0.12mm 개스킷 내부에 15마이크로리터를 로드합니다.

샘플을 커버 슬립으로 덮고 며칠 이내에 이미지를 만들어 나노 시트의 SEM을 수행합니다. 첫 번째 플라즈마 에칭 실리콘 칩은 나노 시트의 흡수를 돕습니다. 그런 다음 플라즈마 처리된 실리콘 기판에 20마이크로리터의 펩타이드 시트 용액을 떨어뜨리고 3분 후에 용액을 그대로 두고, 김 와이프 피펫 끝으로 20마이크로리터의 물을 표면에 놓고 여분의 용액을 다시 흡수하여 버퍼와 염을 제거합니다.

또는 펩티드 시트 용액을 물에 대해 투석하여 완충액과 염을 제거합니다. 이 경우, 20마이크로리터의 투석된 시트 용액을 플라즈마 처리된 실리콘 기판에 떨어뜨리고 공기 중에서 건조시킬 수 있습니다. 플라즈마 처리된 실리콘 기판에서 시트 용액이 건조된 후, 시트는 1킬로볼트에서 5킬로볼트 사이의 빔 에너지에서 렌즈 검출기를 사용하여 SEM으로 이미지화할 수 있습니다.

고도로 정렬된 2차원 나노 시트로 접히는 염기서열 특이적 36 me 블록 전하 펩타이드의 합성 특성화 및 정제가 수행되었습니다. 36 me 블록 전하 펩티드의 합성을 사용하는 아민은 에틸렌 디아민을 페네틸, 아민 및 t 부틸 베타 알라닌으로 복킹합니다. 합성 후, 조질 펩타이드는 95 % 수성 TFA로 수지에서 절단되었다.

TFA 용액을 수집하여 증발시킨 후. 조잡한 36 me 블록 전하 펩타이드를 역상 HPLC로 정제했습니다. 정제 된 블록 전하 펩타이드의 질량은 곰팡이가 핀 것으로 확인되었다.

관측된 질량 4981.2는 계산된 질량 4981.74와 밀접하게 일치합니다. 동결건조된 분말을 DMSO에 용해시켜 2밀리몰의 원액을 만들고 섭씨 4도에서 보관하였다. 시트는 앞서 언급한 프로토콜과 형광 광학 현미경으로 이미지를 준비했습니다.

최대 300미크론에 이르는 피처 크기를 가진 다양한 모양이 관찰되며 특히 직선 모서리가 두드러집니다. SEM은 또한 두드러진 직선 가장자리를 유사하게 드러내는 시트를 이미지화하는 데 사용되었습니다. 이 비디오는 펩타이드의 고체면 합성과 펩타이드를 나노 시트로 수성 자가 조립하기 위한 간단하고 효율적인 프로토콜에 대해 설명합니다.

말 그대로 수백 am의 빌딩 블록은 쉽게 사용할 수 있고 이 프로토콜에서 사용할 수 있기 때문에 폴리펩티드로 접근할 수 있는 설계 공간은 실질적으로 무제한입니다. 펩타이드는 합성 유연성, 견고성 및 주문성으로 인해 생물 의학 및 나노 과학 연구에 유망한 재료입니다. 특히 원자 수준에서 나노 시트는 2차원 디스플레이 스캐폴드, 멤브레인 모방, 생물학적 센서, 단백질 모방 및 장치 제조를 위한 잠재적인 플랫폼 역할을 합니다.

트리오르, 아세트산 및 브로모 아세트산과 같은 부식성 시약으로 작업하는 것은 부상을 방지하고 배기 후드에서 모든 반응을 수행하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 데 매우 위험합니다.