November 28th, 2011
Craniofacial 연골은 다른 조직들과 긴밀한 접촉을 개발하고 살아있는 동물의 조작 어렵습니다. 우리는 초기 배아 효과를 우회하면서 craniofacial 골격의 성장하는 동안 분자 도구를 제공하는 electroporation을 사용하고 있습니다. 이러한 접근 방식은 우리가 효율적으로 후보 분자를 테스트하실 수 있습니다 생체내 인치
이 절차의 전반적인 목표는 하전된 거대 분자를 두개골 안면 간엽으로 전기 작동시키는 것입니다. 이는 먼저 마취된 28기 배아를 전기천공실 내에 배치함으로써 이루어집니다. 다음 단계는 하전된 거대분자를 포함하는 용액을 C 두개안면 간엽에 미세하게 주입하는 것입니다.
이것은 빠르게 전류의 적용으로 이어지며, 그로 인해 전하 뉴클레오티드를 다른 세포에 도입합니다. 절차의 마지막 단계는 형광 현미경으로 전기천공된 조직을 시각화하는 것입니다. 궁극적으로 두개골 안면 조직의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
이러한 결과는 형광, 현미경 또는 면역조직화학을 사용하여 생체 내 또는 고정 조직에서 분석할 수 있습니다. 미세주입 및 돌연변이와 같은 기존 방법에 비해 전기천공법의 주요 장점은 분자 도구의 조직 및 시간 제어이며, 오늘 우리의 절차는 제 연구실의 박사후 연구원인 Jackie Tabler가 시연할 것입니다. 이 절차에 필요한 한 쌍의 L 자형 전극은 각 전극에 대해 고순도 0.4mm 텅스텐 와이어로 만들어지며 먼저 8cm의 와이어를 절단합니다.
그런 다음 파란색 압정과 같은 퍼티를 사용하면 텅스텐 와이어의 중간 지점에 있는 1밀리리터 주사기에 영향을 주어 주사기 끝에서 4cm의 와이어가 노출됩니다. 끝을 끝에서 1cm 떨어진 L자 모양으로 구부립니다. 끝의 길이가 0.5cm가 되도록 팁을 자릅니다.
이 팁은 전극 말단이 주사기와 평행하게 여분의 텅스텐 와이어를 실행합니다. 두 번째 전극이 만들어진 후 전극 펄스 발생기를 연결하는 데 사용됩니다. 테이프를 사용하여 한 쌍의 전극을 서로 고정하여 전극 단자 I가 1cm 간격으로 평행하게 실행되도록 합니다.
마지막으로 DC 케이블을 통해 구형파 펄스 발생기에 전극을 연결합니다. 맞춤형 전기천공설실을 준비하려면 90mm 접시 바닥에 약 5mm의 무독성 석고 장면 모델링 점토를 깔아줍니다. 접시에 전기천공 매체를 채워 석고 장면을 담그십시오.
그런 다음 5번 워치메이커의 집게를 사용하여 석고 장면에 T자 모양의 우물을 조각하여 전기천공법을 형성합니다. 글쎄요, 우물의 긴 면은 약 2mm x 2mm x 10mm여야 하고 짧은 면은 2mm x 2mm x 5mm여야 합니다. 이 절차를 위한 마이크로 피펫은 규산염 유리 모세관으로 만들어집니다.
바늘 풀러를 사용하여 8-12mm 길이의 테이퍼와 미세한 팁으로 마이크로 피펫을 준비하고, 집게를 사용하여 팁에서 약 2mm 떨어진 팁을 부수어 들쭉날쭉한 브레이크를 만들어 마이크로 피펫을 설정합니다. 먼저, 약 1마이크로리터의 주사 용액으로 채우는데, 이 용액에는 형광 표지된 올리고뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 다음으로, 마이크로 피펫을 탁상에서 50도 각도로 마이크로 매니퓰레이터 각도로 고정합니다.
주입 압력을 20PSI로 설정하고 펄스당 30리터를 주입하도록 마이크로피펫을 보정합니다. 전기천공을 준비하기 위해 28기 이종 유충을 5분 동안 배양하여 마취합니다. 0.1%Benzocaine를 포함하는 정상적인 양서류 매체인 electroporation 매체에서는, 전기공법 약실로 마취한 올챙이 이동
.그것은 electroporation 매체로 채워져 있습니다. 절차에서 가장 까다로운 부분은 마이크로 펫을 올챙이에 삽입하는 것입니다. 따라서 성공을 보장하려면 배아를 단단히 고정한 다음 마이크로 주입 후 전류를 빠르게 적용해야 합니다.
머리가 T 접합부에 놓이도록 긴 웰 내에 배아를 배치합니다. 등쪽이 아래를 향하고 복부 쪽이 노출된 상태에서 집게를 사용하여 머리를 꼬리에 비해 약간 높여야 하며 주변 석고 장면과 함께 우물에 올챙이를 부드럽게 고정해야 합니다. 올챙이가 안면 조직에 심각한 손상을 줄 수 있는 전기천공 중에 경련을 일으키지 않도록 올챙이를 고정하는 것이 중요합니다.
이 절차를 시작하려면 마이크로 피펫 팁을 시멘트 샘 바로 뒤쪽과 안면 기계에 삽입하십시오. 30 나노 리터의 용액을 중간엽에 주입하고 마이크로 피펫을 집어 넣습니다. 전극 끝을 배아의 머리와 평행하게 빠르게 정렬하고 50밀리초 20밀리볼트 제곱 펄스를 8회 적용합니다.
그런 다음 집게를 사용하여 전극을 집어넣습니다. 우물에서 올챙이를 조심스럽게 풀어줍니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 올챙이를 밀리리터당 0.025밀리그램으로 3/4 놈으로 옮깁니다.
겐타마이신 올챙이는 이 배지에서 하룻밤 또는 24시간 후에 더 오래 배양할 수 있습니다. 효율적인 전기천공법을 위해 형광 현미경으로 올챙이를 스크리닝합니다. 형광 분자를 사용하면 전기천공된 배아를 쉽게 스크리닝할 수 있습니다.
이 그림은 전기천공법 후 약 1248시간 및 96시간 후에 morph oligonucleotide 전기천공된 올챙이의 일반적인 배치를 보여줍니다. 스테이지 30, 34, 44에서 각각 형광 형태 올리고뉴클레오티드는 30단계와 34단계에서 두개골 안면 내에서 시각화할 수 있습니다.
44단계에서는 흰색 화살촉으로 표시된 연골에서 형광을 감지할 수 있습니다. 고도의 자가형광 영역은 장입니다. 이 절차에 따라 전기 세포의 계통과 관심 단백질에 대한 분자 요구 사항을 추적할 수 있습니다.
이 접근 방식은 라이브 이미징 기술과 결합하여 두개안면 발달 중 시간 경과에 따른 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.
이 연구는 배아 발달 동안 전하를 띤 거대분자를 두개안면 중간엽에 도입하기 위한 전기 투과법의 사용을 탐구합니다. 이 기술을 사용하여 연구자들은 초기 배아 효과를 우회하고 후보 분자를 생체 내에서 효율적으로 테스트하는 것을 목표로 합니다.
Electroporation of craniofacial mesenchyme in Xenopus enables precise, temporally controlled delivery of nucleic acids and macromolecules into soft tissues, supporting early-stage target validation in vertebrate development. This approach provides a robust in vivo system for interrogating gene function and molecular pathways relevant to craniofacial biology, with direct implications for predictive confidence in discovery-stage R&D. The method's spatial and temporal specificity enhances mechanistic de-risking and supports translational continuity from discovery through preclinical research.
This electroporation method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and functional validation in a vertebrate model system.