Name: 의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 학습하세요 칸디다 질염 동물 모델에서 질 접종 및 샘플 수집 기법을 통해 진균 부담 정량화와 면역학적 분석 방법을 효율적으로 수행하는 전체 프로토콜을.

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이 작품은 R01 AI32556 (NIAID, 건강의 국립 연구소)에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 루이지애나 백신 센터와 Regents의 루이지애나위원회 주최 감염증 연구 남부 루이지애나 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 칸디다 albicans와 질 접종 <ol><li> 이전 접종에 사흘은 복부를 노출하기 위해 동물을 억제하면서, 낮은 복부에 subcutaneously β - estradiol의 0.1-0.5 MG를 포함 참기름 100 μl를 주입. 사출 사이트에서 누출을 최소화하기 위해 피부에 측면 5-10mm에 대한 바늘을 전진. 아래 복부에있는 에스 트로겐의 피하 행정부는 성기 요로에 근접으로 인해이 모델에 최적입니다. 효과적인 복용이 마우스 변종, 연령 또는 에스 트로겐 유도체에 따라 다를 수 있습니다. CBA - J (H - 2 κ), C3H/HeN (H - 2 κ), C57BL / 6 (H - 2 B), Balb / C (H - 2 D)를 사용하여 이전 연구에서, DBA / 2 (H - 이 D), 연령 6-8 주가 SJL (H - 2의) 마우스가 0.1 mg/100 μl가 효과가 있던 질 벽 농화에 의해 입증, 질 점액 및 감소상피 세포 sloughing 증가했습니다. 이상이 농도에서 에스 트로겐과 치료를 마우스는 칸디다와 일치하는 질 식민지를 나타냅니다. 다른 변종과 연령대의 생쥐에 접종 들어, 파일럿 연구는 수정된 조건에서 에스 트로겐의 효과를 보장하고 필요한 경우 에스 트로겐 복용을 증가하는 것이 좋습니다. 에스 트로겐 솔루션은 주입 당일에 매번 신선한 준비되어야합니다. 참기름에 에스 트로겐의 완전한 용해도를 보장하기 위해 철저하게 37 간헐적으로 소용돌이 믹서 및 열을 사용하여 솔루션을 믹스 ° C. 연구 기간에 걸쳐 매주 주사를 반복합니다. </li><li> inoculum를 준비하려면, C.의 loopful을 추가 0.1 %의 포도당과 보충 Phytone - 펩톤의 국물의 10 ML에 Sabouraud - 덱스 트로 오스 한천 (SDA)에 최근 subculture 준비에서 albicans blastoconidia. 25 ° 흔들어 물을 욕조에서 C 18 H에 대한 고정 단계로 국물 문화를 품어. </li><li> 부화 후, 일를 수집5 분 800 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 전자 국물 문화. 멸균 PBS로 두 번 펠렛 씻으십시오. </li><li> trypan 청색 색소 제외하여 hemocytometer에서 가능한 blastoconidia를 열거합니다. 2.5 세포 농도를 조절 X 10 멸균 PBS로 6 / ML (또는 원하는 inoculum의 농도). </li><li> 마우스를 안정화하기 위해, 두 손가락으로 꼬리의 기반을 잡고 위쪽으로하므로 질구가 (그림 1A) 방향으로 얼굴을 그 엉덩이를 리프트. 마우스가 마우스의 꼬리 구속에 대한 저항을 제공할 수 있도록 평평한 grated 표면 (예 : 케이지 상단)에 위치하는 경우 그것은 이상적입니다. </li><li> 질 루멘 (그림 1B)에 깊이 5mm에 대한 피펫 팁을 삽입하여 inoculum 서스펜션의 피펫 20 μl (20 μl을 초과하지 않는 원하는 볼륨). 마우스의 고통을 최소화하는 등 신속하고 부드럽게 가능한이 단계를 완료하십시오. </li></ol> 2. 질 lavages <ol><li> 다음 안락사 (또는 마취), H질구가 노출 될 수 있도록 두 손가락으로 꼬리의 기지에 의해 아래로 오래된 마우스. </li><li> 피펫 팁과 반복 열망과 동요와 함께 멸균 PBS 100 μl을 도입하여 질 루멘을 세척. 피펫 팁은 세포들로 가득 찼어 될 수 있습니다. 이 문제가 발생하면, 방해 세포를 분배하고 질에 남아 PBS와 lavaging 계속 진행합니다. microcentrifuge 튜브로 세척 유체를 수집합니다. </li><li> 또한, 질 lavages는 isoflurane 흡입 마취와 anesthetized 생쥐에서 수행할 수 있습니다. 이를 위해, 그들은 완전히 (~ 30 초). 회복될 때까지 isoflurane을 증발에 쥐를 노출. 꼬리의 기지에 의해 아래쪽으로 마우스를 잡고 부드럽게 멸균 PBS의 50 μl를 사용하여 질 루멘을 세척. 이 절차를 수행하는 동안 음부에 외상을 최소화하기 위해 피펫 팁과 거친 동요를 방지해야합니다. 진정 마우스는 주위 공기에 노출을 30 초 이내에 마취에서 회복해야합니다. Isofluraneisoflurane 기화기와 O 2 (선호) 또는 표준 드롭 시스템 기화기 시스템 (호흡 곤란을 피하기 위해 진정제 동안 동물의 가까이 모니터링 필요)하지 않고 마취 챔버를 폐쇄를 사용하여 증발 수 있습니다. anesthetized 생쥐에 대한 질 lavages 같은 생쥐에 세로 세척 샘플 선택하는 방법해야합니다. 연속 lavaging 시간이 41여 곰팡이 부담의 평가에 영향을 미치지 않습니다. </li><li> 축축한 마운트 준비 들어, 유리 슬라이드에 세척 유체의 10 μl를 전송 가벼운 현미경으로 400 배율 1000x에서 관찰합니다. 또한, 세척 유체의 세포 분수는 세포와 핵 morphologies를 검토 스테인드 수 있습니다. 비방 준비 들어, 유리 슬라이드에 세척 유체의 10 μl를 전송하고 부드럽게 피펫 팁의 외벽을 사용하여 확산. CytoPrep의 정착액으로 얼룩 샘플을 보존 및 표준 Papanicolaou 기술에 의해 착색 (자궁 세포진 검사). 가벼운 현미경으로 400 × 확대 관찰. </li></ol> 3. 질 곰팡이 부담 부량 <ol><li> 96 잘 둥근 바닥 판, 그 칼럼의 다음과 같은 다섯 우물 (접시 아래)에 맨 윗줄과 멸균 PBS 180 μl 잘 하나에 세척 유체를 전송합니다. </li><li> 열에있는 다음 잘하는 유체의 20 μl를 전송하여 질 세척 유체의 1시 10분 시리얼 dilutions하십시오. 각 전송 전에 반복 흡인에 의해 철저히 섞는다. 12 세척 샘플 (한 전체 가로 행)까지 직렬 dilutions은 12 채널 피펫을 사용하여 동시에 수행할 수 있습니다. </li><li> 가장 낮은 희석부터 Sabouraud - 덱스 트로 오스 한천 (SDA)에 샘플 10 μl를 전송합니다. 최대 36 샘플의 도금은 격자 및 조정 간격 멀티채널 피펫과 사각형 배양 접시에 준비 SDA를 사용하여 한 접시에 수행할 수 있습니다. </li><li> 34에서 배양 후 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 열거 ° C F또는 48 H. </li></ol> 4. 질 조직 추출 <ol><li> 질 세척 절차에 따라, 그 뒷면에있는 euthanized 마우스를 틀어서 70 % 에탄올로 사타구니 영역을 포화. 포셉 한 켤레를 사용하여 상승하므로 질구가 노출되는 것을 요도 구멍 리프트. </li><li> 질 루멘으로 휘어져 포셉 한 켤레를 삽입하여 자궁 경부를 찾습니다. 포셉와 확고한 그립을 유지하면서, 질 캐비티 (그림 2A - C)를 통해 자궁 경부의 압축을 풉니다. </li><li> 질구의 기지에서 다음 소비세 질은 수술 가위로 질에서 자궁 경부를 제거합니다. 질 조직 (질 상피 쪽 내부 외부 노출) involuted는 것을 염두에 두십시오. 조직은 어느 측면 질의 원래 방향을 유지하기 위해 거꾸로 또는 측면 절개하여 시트에 열 수 있습니다. Excised 질 조직은 1) 사용할 수 있습니다 림프구 추출 다음의 합성histological 분석 25 nase의 소화 (~ 1 × 10 4 / 마우스) 40, 2) 상피 세포 절연 다음 dispase의 소화 (~ 5 × 10 4 / 마우스) 28, 3) 냉동 또는 파라핀 - 임베디드 준비. </li></ol> 5. 허리 림프절의 절단 <ol><li> 질 세척 절차에 따라, 그 뒷면에있는 euthanized 마우스를 틀어서 70 % 에탄올로 복부를 포화. 아래 복부에서 가슴에 시작 가로 절개를 만들고 내부 장기 노출. 양손의 집게 한 켤레를 사용하여 상승하므로 중앙 혈관이 표시되고 그 창자를 이동합니다. </li><li> 하부 대정 맥과 복부 대동맥을 찾습니다. 일반적으로 요추 림프절 한 쌍의는 복부 대동맥에 인접한 식별에 대한 중간 신장 및 일반 장골의 동맥에 39의 기원 사이에 위치해 있습니다. 이러한 림프절은 시각 탄성 질감에 의해 지방 조직에서 구분할 수및 지방 조직 (그림 3)에 비해 컬러로 가볍고 더 불투명하고 있습니다. 이러한 림프절은 uninoculated 동물에 비해 감염된 동물에서 눈에 띄게 큰 있습니다. </li><li> 절제 후 임파선 노드에서 microforceps을 배치하여 노드 및 조직을 주변에서 분리 부드럽게 올려. </li></ol> 6. 단일 셀 정지에 림프 세포의 분리 <ol><li> 행크스 '균형 소금 솔루션 ~ 10 ML (HBSS) (그림 4)를 포함하는 살균 유리 페트리 접시 내에 살균 철망 화면 (크기 약 3 X 3cm 2)로 림프절을 전송합니다. </li><li> 약간 경사 페트리 접시로, 주사기의 플런저 머리가 화면에 대한 림프절을 누르십시오. 노드의 비 세포 구성 요소 (즉, 세포막, 기질, 지방)가 화면에 남아있는 동안 노드의 휴대폰 내용이 화면에 통과되도록 모든 림프절을 휴식해야합니다. </li><li> 같은 플런저와 주사기, 기음 t를 사용그는 포함하는 세포를 HBSS. ~ 5 ML의 HBSS와 함께 화면을 씻고 15 ML 원뿔 관에 남아있는 유체를 수집합니다. </li><li> 10 분 800 XG에 원심 분리기. 유체 폐기하기 전에 피펫으로 유체의 상단에있는 지방 예금 기음. HBSS와 세포 펠렛을 세 번 씻으십시오. trypan 청색 색소 제외 의해 HBSS하고 열거 가능한 세포의 1 ML에 펠렛을 Resuspend. </li></ol> 7. 대표 결과 : &gt; 4 일 주사 생쥐에서 질 세척 유체의 세포 분수는 일반적으로 칸디다, 상피 세포 및 세포 infiltrates (그림 5)로 이루어져 있습니다. 축축한 마운트 현미경으로, 칸디다는 시각 균사의 존재뿐만 아니라 효모 (그림 5A)로 확인할 수 있습니다. 질 세척 유체의 비방 준비가 주요 세포 트라이 nucle 식별 neutrophils되어있는 상피 세포 침투 leukocytes을 검사 Papanicolaou 기술로 물들일 수있다AR 돌출부 (그림 5B). 거의 neutrophils가있는 경우, 41 uninoculated 생쥐 (그림 5C)에 감지됩니다. 질 곰팡이 부담의 예제는 그림 6에 표시됩니다. 특정 시간 지점에서 수집된 질​​ 세척 유체는 CFU 열거 (그림 6A)에 대한 양식입니다. 칸디다가 아닌 에스 트로겐 - 대우 주사 생쥐 (그림 6C)의 질 식민지를 확립하는 데 실패하면서 칸디다와 질 식민지 / 감염, 에스 트로겐 - 치료 주사 생쥐 (그림 6B)의 주간 지속. 에스 트로겐 - 처리 uninoculated 생쥐는 시간 (데이터가 표시되지 않음)을 통해 칸디다에 대한 부정적 남아있다. 또한, 질 lavages는 각 시점 또는 길이 방향 마취하에 동일한 생쥐에서 별도의 생쥐에 중 한 번만 수행할 수 있습니다. 허리 임파선은 성기 요로와 질 도전하는 체계 면역 응답을 평가할 수있는 가장 관련성이 높은 사이트의 기본 배수 림프절입니다. N그들은 일반적으로 uninoculated 생쥐에서 매우 작은 나타나는 반면 이러한 림프절은 주사 생쥐에 확대 될 수 ote. 백혈구 세포 recoveries는 일반적으로 8 일부터 다양한 × 10 5 / uninoculated 마우스로 5 × 10 6 / 주사를 마우스. 허리 림프절 이외에도, 사타구니와 오금 mesenteric 림프절도 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig1.jpg"> 그림 1. 칸디다와 질 접종. A) 마우스 접종에 감금. 마우스는 와이어 케이지 삽입에 위치하고 약간 위쪽 다리를 들고와 질구를 노출, 꼬리의 기지에 의해 개최됩니다. 그것은 꼬리 구속에 저항하는 시도로 마우스의 엉덩이는 같은 손으로 안정 수 있습니다. 질 루멘에 inoculum의 B) 소개. 피펫 팁은 부드럽게 질 루멘에 깊이 5mm에 대한 삽입됩니다. 서스펜션 inoculum 그러면 입금됩니다. 그림 2. 질 조직 추출. 자궁 경부의 AB) 추출. 자궁 경부는 곡선 집게와 함께 위치하고 질 캐비티를 통해 밖으로 노출됩니다. 일단 밖으로 질 구멍의 자궁 경부가 더욱 완벽하게 음부 노출 밖으로 뽑아입니다. 질 C) 추출. 질은 가위로 외음부에서 excised 수 있습니다. 일단 분리된, 음부에서 자궁 경부를 제거합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig3.jpg"> 그림 3. 요추 림프절의 식별. 골반 주변에 주변 장기 / 혈관 중에서 요추 림프절의 위치가 표시됩니다. A, 복부 대동맥. B, 방광. C, 공통 장골의 동맥. 난 장의. L, 간. R, 직장. S, 비장. U, Uteri. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig4.jpg"> 그림 4. 와이어 메쉬 화면에 배치 허리 림프절. 림프절은 HBSS있는 페트리 접시에 배치 화면에 풀링하고 있습니다. 림프절은 단일 셀 정지에 림프 세포를 얻기 위해 주사기의 플런저와 함께 화면에 대해 누르면됩니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig5.jpg"> 그림 5. 주사 생쥐에서 질 세척 유체의 세포 분수. 질 세척 샘플) 습식 마운트 및 B) 자궁 세포진 검사의 준비는 uninoculated 생쥐에서) 사일 포스트 접종 및 C를 수집. 이미지는 1,000 × (A) 또는 400 × 표시됩니다 (B, C) 확대. B의 삽입은 1000 ×의 질 neutrophils의 핵 형태를 보여줍니다. 칸디다 효모 (Y)와 균사 (H), 상피 세포 (EC)와 neutrohils (N)이 표시됩니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig6.jpg"> 그림 6. 감지질 곰팡이 부담의 이온. A) C. albicans 대표의 식민지가 SDA의 접시에 성장. 여섯 가지 주사 생쥐 (맨 윗줄)에서 스트레이트 (N) 세척 샘플은 순차적으로 희석하여 CFU 열거를위한 교양되었습니다. B)에서 질 곰팡이 부담 부량 에스 트로겐 - 취급 C) 비 에스 트로겐 - 처리 쥐. 주사 생쥐에서 세척 유체의 CFU/100 μl는 지정된 시간 포인트에서 평가되었다.

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<li>Taylor, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+virulence+of+Candida+albicans+isolates+causing+mucosal+infections+in+people+infected+with+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus.</a> J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).</li>
<li>Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Th1%2FTh2+cytokine+production+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis.</a> Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

칸디다 질염의 실험 마우스 모델, 설립 역사적 3,4,11,13,16,17,19,21,24 antifungal 요법을 테스트뿐만 아니라 칸디다에 점막 호스트 응답을 연구하기 위해 지난 몇 십년에 사용되고 있습니다 25,37. 프로토콜은 여기 효율적이고 덜 노동 집약적인 방법 통합, 그리고 칸디다 질염의 가장 최적화된 모델 시스템 중 하나가 날짜 설명한 것으로 나타날 제시. 이 기술은 질 표본의 곰팡이 부담과 컬렉션의 급속한 부량을 가능하게합니다. 또한, 이전의 연구는 생쥐 여러 haplotypic 변종 (N = 13) 테스트 및 다양한 시간 점 포스트 접종은 칸디다 2,6,41와 질 식민지에 곰팡이 부담 및 호스트 응답 변화의 유사한 수준을 보였다. 따라서,이 모델은 마우스 종자에 대한 제한이나 감염의 기간없이 기존의 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 그러나, 하나는 인식해야한다는질 곰팡...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 여자 CBA / J 마우스 </td><td> 찰스 리버 연구소 </td><td> 01C38 </td><td> 나이 5-6주 </td></tr><tr><td> 칸디다 albicans (3153A) </td><td> 병원성 곰팡이 국립 수집, 영국 </td><td> NCPF3153 </td><td></td></tr><tr><td> 향유 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S3547 </td><td> 사용하기 전에 미리 소독을 할 필요가 없다 </td></tr><tr><td> Β - estradiol 17 - valerate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E1631 </td><td> 참깨 기름에 0.1 - 0.5mg </td></tr><tr><td> Phytone 펩톤 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 211,906 </td><td> 0.1 % 포도당과 보충 </td></tr><tr><td> Trypan 푸른 솔루션 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> 덱스 트로 오스 Sabouraud 한천 </td><td> Becton 딕inson </td><td> 211,584 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 유형 IV </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C5138 </td><td> 0.25 % </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Invitrogen </td><td> 17105-041 </td><td> 1.7 U / ML </td></tr><tr><td> 와이어 메쉬 스크린 </td><td> TWP </td><td> 060X060S0065W36T </td><td> 번호 60 메쉬, 스테인레스 </td></tr><tr><td> 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td></td></tr><tr><td> CytoPrep 정착액 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-570-10 </td><td> 얼룩 슬라이드를 보존 </td></tr><tr><td> Papanicolaou는 EA - 65 얼룩 </td><td> EMD 화학 </td><td> 7054X 85 </td><td></td></tr><tr><td> Papanicolaou는 OG - 6 얼룩 </td><td> EMD 화학 </td><td> 7052X 85 </td><td></td></tr><tr><td> 해리스 &#39;명반의 hematoxylin </td><td> EMD 화학 </td><td> 638A - 85 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> 박스터 헬스케어 </td><td> NDC 10019-773-60 </td><td> isoflurane 기화기 또는 드롭 시스템에서 사용되는 마취 챔버 폐쇄 </td></tr></table>

의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

칸디다 종에 의한 Vulvovaginal 칸디다 증 (VVC)은, 그들의 생식 년 18,32-34 동안 달리 건강한 여성의 약 75 %에 영향을 미치는 낮은 여성의 성기 요로의 곰팡이 감염입니다. Predisposing 요인 항생제 사용, 통제 당뇨병 방해 생식 호르몬 수준에 임신으로 인해, 경구 피임약이나 호르몬 대체 요법 33,34을 포함합니다. 연간 세 개 이상의 에피소드로 정의된 재발성 VVC (RVVC)는없고 predisposing 요인 33 여성의 8 %를 별도의 다섯 영향을 미칩니다. VVC의 실험 마우스 모델은 설립 pathogenesis과 칸디다 3,4,11,16,17,19,21,25,37에 점막 호스트 응답을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 모델은 또한 생체내 13,24 잠재적인 antifungal 치료를 테스트하기 위해 고용되었습니다. 모델 동물에 대한 선택 pseudoestrus의 상태로 유지합니다imal 칸디다 식민 / 감염 6,14,23. 이러한 조건에서, 주사 동물 개월 주 동안 질 곰팡이 부담을 감지합니다. 과거 연구는 면역 및 생리 특성 3,16,21에 상대적인 동물 모델과 인간 사이의 감염이 매우 높은 병렬을 보여줍니다. 차이점은, 그러나, 정상적인 질 식물로 칸디다의 부족과 생쥐의 중립 질 산도를 포함합니다. 여기에서 우리는 질 접종, 질 표본의 신속한 수집, 질 곰팡이 부담 평가 및 세포 추출 / 격리에 대한 조직 준비를 포함하는 마우스 질염 모델의 주요 방법의 일련 보여줍니다. 이것은 질 세척 유체, 곰팡이 부담, 그리고 배수 림프절의 백혈구의 수율의 성분에 대한 대표적인 결과는 다음입니다. anesthetics의 사용으로 세척 샘플의 길이 평가를 위해 같은 생쥐에 여러 시간 지점에서 수령 가능감염 / 식민지. 또한,이 모델은 정의된 호스트 조건 하에서 면역 연구를 허용, 감염을 시작하는 데 아무런 immunosuppressive 요원을 필요하지 않습니다. 마지막으로, 모델 및 각 기술은 여기에 잠재적으로 낮은 여성의 성기 요로 (바이러스성, 기생, 세균)과 각 지역 또는 체계 호스트 방어의 다른 감염증을 조사하는 방법론의 사용에 상승을 줄 수 소개했다.

평가에 사용되는 주요 기술<em&gt; 칸디다</em실험 동물 모델에서&gt; 질염이 설명되어 있습니다. 방법은 허리 림프절을 배수의 질 표본 및 lymphocytes의 급속한 컬렉션을하실 수 있습니다. 이 기술은 여성의 낮은 성기 요로에있는 다른 질병의 마우스 모델에 상승을 줄 수 있습니다.

Candida 종에 의해 발생하는 외음질 칸디다증(Vulvovaginal candidiasis, VVC)은 여성 하부 생식관의 진균 감염으로, 약 75%의 ...

본 절차의 전반적인 목표는 질 칸디다증의 실험 동물 모델을 사용하여 질 내 진균 부하량을 정량화하고, 면역학적 및 조직학적 분석과 같은 특정 분석법에 질 세포 또는 림프구 세포를 사용하는 것과 관련된 구체적인 절차적 쟁점들을 입증하는 것입니다. 이를 위해 먼저 에스트로겐 처리된 마우스를 대상으로 질 내 접종 기술을 시연합니다. 그다음, 마우스를 안락사시킨 후 질 세척을 수행하여 칸디다를 회수합니다.그 다음 질 조직 및 또는 질 배액 림프절을 추출합니다. 세척액을 현미경으로 관찰하여 질 상피 세포와 연관된 칸디다를 확인하거나, 한천 배지에 도말하여 질 내 진균 부하량을 정량화할 수 있습니다. 세포 분획의 도말 표본은 상피 세포와 림프구 세포의 염색에 사용할 수도 있습니다.본 기술을 시연하는 주요 목적은 질염 동물 모델 사용자들이 이를 가장 효율적이고 효과적으로 수행할 수 있도록 하기 위함입니다. 이 기술을 통해 해결하고자 하는 핵심 질문들은 질염 및 생태학 분야에 있으며, 숙주의 면역 반응, 세포 분포, 약물 효능, 면역 치료 효능, 그리고 면역화의 효과 및 기술 시연과 같은 핵심 질문들에 답하는 것입니다. 오늘은 저희 실험실의 대학원생인 junco yano가 beta estradiol 주입 3일 후 마우스에 C albicans를 감염시키는 과정을 보여줄 것입니다.마우스가 잡을 수 있도록 평평한 gRED 표면 위에서 마우스를 안정시키는 것으로 시작합니다. 그런 다음 두 손가락으로 꼬리 기부를 잡고 엉덩이 부분을 위로 들어 올려 질 입구가 사용자 쪽을 향하게 합니다. 피펫 팁을 질강 내로 약 5 mm 깊이까지 삽입하고 접종액 현탁액을 20 µL까지 피펫팅하여 흡입합니다.마우스의 스트레스를 최소화하기 위해 이 단계를 최대한 빠르고 부드럽게 완료하십시오. 원하는 배양 시간이 지난 후, 해당 시설의 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다. 그런 다음 두 손가락으로 꼬리 기저부를 잡아 마우스를 아래로 고정하여 피펫으로 질 입구가 노출되도록 합니다.질강 내로 100 µL의 멸균 PBS를 주입하고, 반복적인 흡입과 교반을 통해 세척을 수행합니다. 피펫 팁이 세포로 인해 막힌 경우, 막고 있는 세포를 배출하고 남은 PBS로 세척을 계속합니다. 세척액은 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.질 세척 절차를 마친 후, 마우스의 배가 위로 향하게 눕히고 서혜부 부위를 70% ethanol로 충분히 적십니다. 핀셋을 사용하여 요도구를 위로 들어 올려 질 입구가 노출되게 합니다. 곡선형 핀셋을 질강 내로 삽입하고 핀셋으로 단단히 잡은 상태에서 자궁경부를 찾습니다.질강을 통해 자궁경부를 추출하고, 질 입구 기저부에서 질을 절제한 후 수술용 가위로 질에서 자궁경부를 분리합니다. 질 조직은 함입되어 있으므로, 원래의 방향을 유지하기 위해 이를 뒤집거나, 동물을 배측으로 눕힌 상태에서 요추 림프절 절제를 위해 측면 절개를 가해 시트 형태로 펼칩니다. 복부를 70% ethanol로 적십니다.하복부에서 흉부까지 측면 절개를 실시하고, 양손에 포셉을 사용하여 내부 장기를 노출시킵니다. 중앙 혈관이 보일 수 있도록 장을 위쪽으로 이동시킵니다. 하대정맥과 복부 대동맥의 위치를 확인합니다.신동맥과 총장골동맥의 기점 사이 중간 지점쯤에 위치한 복부 대동맥 인근에서 한 쌍의 요림프절을 확인할 수 있습니다. 이 림프절은 탄력 있는 질감으로 인해 지방 조직과 시각적으로 구별되며, 지방 조직에 비해 색이 더 밝고 불투명합니다. 또한, 접종되지 않은 동물에 비해 감염된 동물에서 눈에 띄게 더 큽니다.마이크로 포셉을 림프절 아래에 배치한 후, 주변 조직에서 조심스럽게 들어 올려 림프절을 적출합니다. 조직을 적출한 후, 약 10 milliliters의 Hank's balanced salt solution이 담긴 멸균 유리 페트리 접시 내부의 멸균 와이어 메시 스크린 위로 림프절을 옮깁니다. 림프구 세포를 분리하려면 서면 프로토콜을 참조하십시오.최소 4일 전에 접종한 마우스의 질 세척액 세포 분획은 여기 습식 마운트 현미경 관찰 결과와 같이 일반적으로 칸디다 상피 세포와 세포 침윤물로 구성됩니다. 칸디다는 효모뿐만 아니라 PHA의 존재로 확인할 수 있습니다. 여기서는 질 세척액의 도말 표본을 염색하였습니다.pap smear 기법을 사용하여 상피 세포와 침윤된 백혈구를 검사하며, 이 중 주요 세포는 핵의 분엽으로 식별 가능한 호중구입니다. 접종되지 않은 마우스에서는 호중구가 거의 또는 전혀 검출되지 않습니다. 이 그림은 질 내 진균 수치의 예시를 보여줍니다.질 세척액을 특정 시점에 수집하여 CFU 수치를 측정하기 위해 배양합니다. 본 예시에서는 접종 후 5일째에 세척액을 수집하여 단계별로 희석 및 도말한 후 48시간 동안 배양하였습니다. 이후 콜로니 수를 측정하여 질 내 진균 부하량을 계산하며, 에스트로겐을 처리하고 접종한 마우스의 경우 candida의 질 내 정착 또는 감염이 수주 동안 지속됩니다.에스트로겐을 처리하지 않은 접종 쥐에서는 칸디다(candida)의 질 내 정착이 실패하는 반면, 에스트로겐을 처리한 비접종 쥐는 관찰 기간 내내 칸디다 음성 상태를 유지합니다. 또한, 질 세척(vaginal lavage)은 각 시점마다 서로 다른 쥐를 대상으로 한 번만 수행하거나, 마취 상태에서 동일한 쥐를 대상으로 종단적으로 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 질에 외상이 생기지 않도록 동물을 안전하게 보정하는 것이 중요하며, 질 조직을 추출할 때 정확한 질 내 진균 부하량을 얻기 위해 충분한 시간을 들여 철저히 세척하시기 바랍니다.탈수를 방지하기 위해 정지 상태의 PBS를 사용하고, 림프절을 제거할 때 주요 정맥과 동맥이 손상되지 않도록 주의하십시오. 림프절 세포를 처리하는 동안에는 세포 생존력을 유지하기 위해 얼음 위 또는 4°C에서 보관하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 칸디다 질염 실험 마우스 모델을 사용하여 질 내 진균 부하를 재현성 있게 정량화하고, 특정 면역학적 또는 조직학적 분석을 위해 질 또는 림프 조직을 절제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

protocols-for-vaginal-inoculation-sample-collection-experimental

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Morrill, SR, et al. 혐기성 성장 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 항생제 내성 혐기성 박테리아를 사용하여 마우스의 질 집락화를 모델링하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 상피 감수성을 증가시키기 위한 호르몬 치료로 시작하여 혐기성 조건에서 질 접종 및 동시 접종이 이어집니다. 이 절차는 박테리아 집락화 및 생물막 형성을 평가하기 위한 접종 후 샘플링 및 배양으로 마무리됩니다.

혐기성 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델링

출처: 오브라이언, V.P. 외 가드네렐라 진공 방광 노출로 유발된 재발성 대장균 요로 감염. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 반복성 요로 감염의 마우스 모델을 구축하기 위해 Gardnerella vaginalis 접종체를 준비하는 과정을 보여줍니다.

쥐의 반복성 요로 감염을 모델링하기 위한 Gardnerella vaginalis 접종 제제

출처: 파트라스, K. A., 도란, K. S. B 군 연쇄상구균 질 정착의 쥐 모델. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 B 그룹연상구균 에 감염된 호르몬 처리된 암컷 쥐의 준비 및 질 접종 과정을 시연하여 감염을 모델링합니다. 박테리아를 배양하고 준비하는 방법, 질 내강에 접종을 투여하는 방법, 그리고 성공적인 감염을 보장하는 방법을 설명합니다.

질 그룹 B 연쇄상구균 감염의 마우스 모델 구축

이 비디오는 경요도 카테터 점안을 통해 암컷 마우스 방광에서 요병원성 대장균 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 주입된 박테리아는 방광 내에서 요로 감염을 성공적으로 확립하여 요로와 관련된 의료 관련 질병을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

암컷 마우스의 요로 감염 모델 구축

이 비디오는 피하 조직에서 칸디다 알비칸스의 생물막 형성을 연구하기 위한 생체 내 마우스 모델의 개발을 보여줍니다. 이 실험은 생물막 발달을 위해 동물의 등 부위에 칸디다균에 감염된 장치를 이식하는 것을 포함합니다.

칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

숙주 면역 저항을 연구하기 위해 칸디다 감염 모델을 사용할 수 있지만, 칸디다 감염과 관련하여 T 세포 매개 면역병리학을 연구하기 위한 모델은 없습니다. 여기에서는 면역결핍 마우스에서 구강 칸디다 감염과 관련된 Th17 면역병리학을 확립하는 방법을 설명합니다.

면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델

이 프로토콜의 목적은 쥐 모델에서 인간의 B 군 연쇄상 구균 (GBS) 질 식민지를 모방하는 것입니다. 이 방법은 숙주의 면역 반응 및 GBS 질 지속성에 기여 박테리아 인자를 조사 할뿐 아니라 치료 전략을 시험하기 위해 사용될 수있다.

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

여기에서, 우리는 독특하게 디자인된 온난화/억제 장치를 사용하여 설치류 꼬리 정맥 주사를 위한 효과적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 혈관 확장 및 억제 과정의 개시를 간소화함으로써,이 프로토콜은 최소한의 고통을 가진 동물의 큰 그룹의 정확하고 적시에 정맥 주사를 허용합니다.

뮤린 곰팡이 패혈증 모델에서 효율적인 꼬리 정맥 주사를위한 현대 온난화 / 억제 장치

이 프로토콜은 혐기성 배양 된 인간 질 박테리아를 사용한 질 식민지화의 마우스 모델을 제시합니다. 우리는 Gardnerella vaginalis에 초점을 맞추고 Prevotella bivia 및 Fusobacterium nucleatum에 대한 제안을 포함합니다. 이 프로토콜은 또한 질 접종 및 다른 혐기성 성장 박테리아의 실행 가능한 회복을위한 지침으로 사용될 수 있습니다.

혐기성 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델

우리는 카테터에 생물막이 형성되고 C.albicans와 숙주 간의 상호 작용이 임상 CRI와 잘 상관되는 C.albicans 관련 카테터 관련 감염(CRI)의 마우스 모델을 확립합니다. 이 모델은 C.albicans 생물막 관련 CRI에 대한 치료법을 스크리닝하여 임상 혁신을 위한 토대를 마련하는 데 도움이 됩니다.

마우스의 카테터 관련 칸디다 알비칸스 감염 모델

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마우스의 상승하는 질 감염, 조산 및 신생아 이환율 모델링

학습하세요 칸디다 질염 동물 모델에서 질 접종 및 샘플 수집 기법을 통해 진균 부담 정량화와 면역학적 분석 방법을 효율적으로 수행하는 전체 프로토콜을.

의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

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