의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

본 절차의 전반적인 목표는 질 칸디다증의 실험 동물 모델을 사용하여 질 내 진균 부하량을 정량화하고, 면역학적 및 조직학적 분석과 같은 특정 분석법에 질 세포 또는 림프구 세포를 사용하는 것과 관련된 구체적인 절차적 쟁점들을 입증하는 것입니다. 이를 위해 먼저 에스트로겐 처리된 마우스를 대상으로 질 내 접종 기술을 시연합니다. 그다음, 마우스를 안락사시킨 후 질 세척을 수행하여 칸디다를 회수합니다.

그 다음 질 조직 및 또는 질 배액 림프절을 추출합니다. 세척액을 현미경으로 관찰하여 질 상피 세포와 연관된 칸디다를 확인하거나, 한천 배지에 도말하여 질 내 진균 부하량을 정량화할 수 있습니다. 세포 분획의 도말 표본은 상피 세포와 림프구 세포의 염색에 사용할 수도 있습니다.

본 기술을 시연하는 주요 목적은 질염 동물 모델 사용자들이 이를 가장 효율적이고 효과적으로 수행할 수 있도록 하기 위함입니다. 이 기술을 통해 해결하고자 하는 핵심 질문들은 질염 및 생태학 분야에 있으며, 숙주의 면역 반응, 세포 분포, 약물 효능, 면역 치료 효능, 그리고 면역화의 효과 및 기술 시연과 같은 핵심 질문들에 답하는 것입니다. 오늘은 저희 실험실의 대학원생인 junco yano가 beta estradiol 주입 3일 후 마우스에 C albicans를 감염시키는 과정을 보여줄 것입니다.

마우스가 잡을 수 있도록 평평한 gRED 표면 위에서 마우스를 안정시키는 것으로 시작합니다. 그런 다음 두 손가락으로 꼬리 기부를 잡고 엉덩이 부분을 위로 들어 올려 질 입구가 사용자 쪽을 향하게 합니다. 피펫 팁을 질강 내로 약 5 mm 깊이까지 삽입하고 접종액 현탁액을 20 µL까지 피펫팅하여 흡입합니다.

마우스의 스트레스를 최소화하기 위해 이 단계를 최대한 빠르고 부드럽게 완료하십시오. 원하는 배양 시간이 지난 후, 해당 시설의 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다. 그런 다음 두 손가락으로 꼬리 기저부를 잡아 마우스를 아래로 고정하여 피펫으로 질 입구가 노출되도록 합니다.

질강 내로 100 µL의 멸균 PBS를 주입하고, 반복적인 흡입과 교반을 통해 세척을 수행합니다. 피펫 팁이 세포로 인해 막힌 경우, 막고 있는 세포를 배출하고 남은 PBS로 세척을 계속합니다. 세척액은 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.

질 세척 절차를 마친 후, 마우스의 배가 위로 향하게 눕히고 서혜부 부위를 70% ethanol로 충분히 적십니다. 핀셋을 사용하여 요도구를 위로 들어 올려 질 입구가 노출되게 합니다. 곡선형 핀셋을 질강 내로 삽입하고 핀셋으로 단단히 잡은 상태에서 자궁경부를 찾습니다.

질강을 통해 자궁경부를 추출하고, 질 입구 기저부에서 질을 절제한 후 수술용 가위로 질에서 자궁경부를 분리합니다. 질 조직은 함입되어 있으므로, 원래의 방향을 유지하기 위해 이를 뒤집거나, 동물을 배측으로 눕힌 상태에서 요추 림프절 절제를 위해 측면 절개를 가해 시트 형태로 펼칩니다. 복부를 70% ethanol로 적십니다.

하복부에서 흉부까지 측면 절개를 실시하고, 양손에 포셉을 사용하여 내부 장기를 노출시킵니다. 중앙 혈관이 보일 수 있도록 장을 위쪽으로 이동시킵니다. 하대정맥과 복부 대동맥의 위치를 확인합니다.

신동맥과 총장골동맥의 기점 사이 중간 지점쯤에 위치한 복부 대동맥 인근에서 한 쌍의 요림프절을 확인할 수 있습니다. 이 림프절은 탄력 있는 질감으로 인해 지방 조직과 시각적으로 구별되며, 지방 조직에 비해 색이 더 밝고 불투명합니다. 또한, 접종되지 않은 동물에 비해 감염된 동물에서 눈에 띄게 더 큽니다.

마이크로 포셉을 림프절 아래에 배치한 후, 주변 조직에서 조심스럽게 들어 올려 림프절을 적출합니다. 조직을 적출한 후, 약 10 milliliters의 Hank's balanced salt solution이 담긴 멸균 유리 페트리 접시 내부의 멸균 와이어 메시 스크린 위로 림프절을 옮깁니다. 림프구 세포를 분리하려면 서면 프로토콜을 참조하십시오.

최소 4일 전에 접종한 마우스의 질 세척액 세포 분획은 여기 습식 마운트 현미경 관찰 결과와 같이 일반적으로 칸디다 상피 세포와 세포 침윤물로 구성됩니다. 칸디다는 효모뿐만 아니라 PHA의 존재로 확인할 수 있습니다. 여기서는 질 세척액의 도말 표본을 염색하였습니다.

pap smear 기법을 사용하여 상피 세포와 침윤된 백혈구를 검사하며, 이 중 주요 세포는 핵의 분엽으로 식별 가능한 호중구입니다. 접종되지 않은 마우스에서는 호중구가 거의 또는 전혀 검출되지 않습니다. 이 그림은 질 내 진균 수치의 예시를 보여줍니다.

질 세척액을 특정 시점에 수집하여 CFU 수치를 측정하기 위해 배양합니다. 본 예시에서는 접종 후 5일째에 세척액을 수집하여 단계별로 희석 및 도말한 후 48시간 동안 배양하였습니다. 이후 콜로니 수를 측정하여 질 내 진균 부하량을 계산하며, 에스트로겐을 처리하고 접종한 마우스의 경우 candida의 질 내 정착 또는 감염이 수주 동안 지속됩니다.

에스트로겐을 처리하지 않은 접종 쥐에서는 칸디다(candida)의 질 내 정착이 실패하는 반면, 에스트로겐을 처리한 비접종 쥐는 관찰 기간 내내 칸디다 음성 상태를 유지합니다. 또한, 질 세척(vaginal lavage)은 각 시점마다 서로 다른 쥐를 대상으로 한 번만 수행하거나, 마취 상태에서 동일한 쥐를 대상으로 종단적으로 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 질에 외상이 생기지 않도록 동물을 안전하게 보정하는 것이 중요하며, 질 조직을 추출할 때 정확한 질 내 진균 부하량을 얻기 위해 충분한 시간을 들여 철저히 세척하시기 바랍니다.

탈수를 방지하기 위해 정지 상태의 PBS를 사용하고, 림프절을 제거할 때 주요 정맥과 동맥이 손상되지 않도록 주의하십시오. 림프절 세포를 처리하는 동안에는 세포 생존력을 유지하기 위해 얼음 위 또는 4°C에서 보관하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 칸디다 질염 실험 마우스 모델을 사용하여 질 내 진균 부하를 재현성 있게 정량화하고, 특정 면역학적 또는 조직학적 분석을 위해 질 또는 림프 조직을 절제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.