의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

이 절차의 전반적인 목표는 질 진균 부담을 정량화하는 수단으로 질 칸디다증의 실험 동물 모델을 사용하는 것과 관련된 특정 절차적 문제를 입증하고 면역학 및 조직학적 분석과 같은 특정 분석에서 질 또는 림프 세포를 사용하는 것입니다. 이것은 먼저 에스트로겐 처리 마우스에서 질 접종 기술을 시연함으로써 달성 될 것입니다. 다음으로, 마우스를 안락사 한 후 칸디다균을 회복하기 위해 질 세척을 수행합니다.

그런 다음 질 조직 및/또는 질을 배출하는 림프절을 추출합니다. 세척액은 질 상피 세포와 관련된 칸디다를 보여주기 위해 현미경으로 보거나 질 진균 부담을 정량화하기 위해 한천에 도금할 수 있습니다. 세포 분획의 도말은 상피 세포와 림프 세포를 염색하는 데에도 사용할 수 있습니다.

따라서이 기술을 시연하는 주요 이점은 질염의 동물 모델 사용자가 가장 효율적이고 효과적으로 수행 할 수 있다는 것입니다. 그리고 이 기술을 통해 답변되고 있는 주요 질문은 질염 및 생태학 분야이며 숙주 면역 반응, 세포 분포, 약물의 효능, 면역 치료 효능, 면역 요법 효능 및 면역 효과와 같은 주요 질문에 답하고 기술을 시연합니다. 오늘은 내 연구실의 대학원생, junco yano, 베타 estradiol의 주사를 투여 한 후 3 일 후에 C albicans로 마우스를 감염시킵니다.

먼저 마우스를 잡을 수 있도록 평평한 gRED 표면에 고정합니다. 그런 다음 두 손가락으로 꼬리 아랫부분을 잡고 엉덩이를 위로 들어 올려 질 입구가 당신을 향하도록 합니다. 피펫 팁을 질 내강에 약 5mm 깊이로 삽입하고 접종 현탁액의 최대 20마이크로리터까지 피펫팅합니다.

마우스의 고통을 최소화하기 위해 가능한 한 빠르고 부드럽게 이 단계를 완료하십시오. 원하는 잠복기가 끝나면 시설의 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다. 그런 다음 두 손가락으로 꼬리 밑부분을 아래쪽으로 잡고 질 입구가 피펫으로 노출되도록합니다.

100마이크로리터의 멸균 PBS를 질 내강에 주입하고 흡인과 교반을 반복하면서 세척을 수행합니다. 피펫 팁이 세포로 막히면 막힌 세포를 분주하고 남은 PBS를 계속 파괴하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브에 세척액을 모읍니다.

질 세척 절차에 따라 마우스를 등을 대고 눕히고 사타구니 부위를 70% 에탄올로 포화시킵니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 질 입구가 노출되도록 요로구를 위로 들어 올립니다. 한 쌍의 구부러진 집게를 질 내강에 삽입하고 집게를 단단히 잡은 상태에서 자궁 경부의 위치를 찾습니다.

질강을 통해 자궁경부를 추출하고 질 입구 기저부에서 질을 절제한 다음 수술 가위로 질에서 자궁경부를 제거합니다. 질 조직은 복잡하기 때문에 원래 방향을 유지하기 위해 뒤집거나 동물을 등에 업고 요추 절제를 위해 측면 절개를 하여 시트로 엽니다. 복부를 70% 에탄올로 포화시킵니다.

하복부에서 가슴까지 측면 절개를 하고 양손에 한 쌍의 집게를 사용하여 내부 장기를 노출합니다. 중앙 혈관이 보이도록 장을 위쪽으로 움직입니다. 하대정맥과 복부 대동맥을 찾습니다.

쌍의 요추 림프절은 신장 동맥과 총장골 동맥의 기원 사이의 약 중간에 위치한 복부 대동맥에 인접하여 확인할 수 있습니다. 이 림프절은 탄력 있는 질감으로 인해 지방 조직과 시각적으로 구별할 수 있으며 지방 조직에 비해 더 가볍고 색이 불투명합니다. 또한 접종하지 않은 동물에 비해 감염된 동물에서 눈에 띄게 더 큽니다.

동물들은 림프절 아래에 미세한 집게를 놓아 림프절을 절제한 다음 부드럽게 위로 당겨 주변 조직과 분리했습니다. 조직을 절제한 후, 약 10ml의 행크스 밸런스 소금 용액이 들어 있는 멸균 유리 페트리 접시 안에 놓인 멸균 철망 스크린으로 림프절을 옮깁니다. 림프 세포를 분리하려면 서면 프로토콜을 참조하십시오.

최소 4일 전에 접종한 마우스의 질 세척액의 세포 분획은 일반적으로 습식 마운트 현미경 검사에 의해 표시된 바와 같이 칸디다, 상피 세포 및 세포 침윤으로 구성됩니다. 칸디다균은 PHA와 효모의 존재로 식별할 수 있습니다. 여기에 질 세척액의 도말 제제가 얼룩져 있습니다.

자궁경부 도말 기법을 사용하여 상피 세포와 침윤 백혈구를 검사하며, 그 주요 세포는 호중구이며, 이는 traclear loves로 식별할 수 있습니다. 호중구가 있는 경우, 접종되지 않은 마우스에서 검출되는 호중구는 거의 없습니다. 이 그림은 질 진균 부담의 예를 보여줍니다.

질 세척액은 특정 시점에 수집되어 CFU 계수를 위해 배양됩니다. 이 예에서는 접종 후 5일째에 액체를 수집하여 연속적으로 희석하고 도금하고 48시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 집락을 세고 질 곰팡이 부담을 계산하고 질 집락화 또는 칸디다에 의한 감염은 에스트로겐 치료를 받은 마우스에서 몇 주 동안 지속됩니다.

칸디다균은 에스트로겐을 투여하지 않은 접종된 마우스에서 질 집락화를 확립하지 못하지만, 에스트로겐 투여되지 않은 접종된 마우스는 해당 기간 동안 칸디다균에 대해 음성으로 남아 있습니다. 또한, 질 세척은 각 시점에서 별도의 마우스에서 한 번 또는 마취 상태에서 동일한 마우스에서 종방향으로 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 질에 외상이 가해지지 않도록 동물을 단단히 구속하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 질 조직을 추출할 때 정확한 질 곰팡이 부담을 얻기 위해 필요한 시간을 들여 철저히 세척하십시오.

탈수를 방지하기 위해 스틸 PBS를 사용하고, 림프절을 제거할 때 및 림프절 세포를 처리하는 동안 주요 정맥과 동맥이 손상되지 않도록 주의하고 세포 생존력을 유지하기 위해 얼음 위에 보관하거나 4도로 유지하십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 칸디다 질염의 실험적 마우스 모델을 사용하여 질 진균 부담을 재현 가능하게 정량화하고 특정 면역학적 또는 조직학적 분석을 위해 질 또는 림프 조직을 절제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.