이미징을위한 간단한 방법 Arabidopsis는 Infiltrative 영상 매체로 Perfluorodecalin를 사용하여 잎

이 절차의 전반적인 목표는 식물 잎의 공기로 인한 생물학적 이미지의 저하를 최소화하여 잎 내의 살아있는 세포에 대한 보다 선명한 이미지를 획득하는 것입니다. 잎이 수성 장착 매체에 장착되고 형광단이 레이저에 의해 여기되는 경우, 주황색으로 표시된 조직 내의 채워지지 않은 많은 공기 공간과 굴절률의 변화는 결과 이미지에서 조직 내부 깊숙한 곳에서 오는 신호의 강도를 제한합니다. 잎이 대신 플루오로 델린 또는 PFD에 장착되면 플루오로포어의 결과 레이저 여기가 감쇠가 줄어들고 방출된 신호를 더 잘 전송할 수 있습니다.

궁극적으로, PFD 마운팅 매체와 함께 스캐닝 레이저 컨포칼 현미경을 사용하면 수성 장착 매체를 사용할 때 가능한 깊이의 두 배 이상의 깊이에서 식물 잎 내부의 살아있는 세포에 대한 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 잎 및 수성 매체의 고정 또는 장착과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 메조 충전 내의 굴절을 줄이고 문제가 될 수 있는 잎 내부의 더 깊은 곳에서 살아있는 세포를 보다 정확하게 이미징할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 기본적인 식물 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 이 방법은 메조 채우기, 세포 생물학 및 생체 내 신호 전달, 병원균에 의한 잎 집락화 및 병원체 채우기 상호 작용과 같은 식물 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그것은 또한 통찰력 나선 또는 척추 동물 폐와 같은 공기에서 부유한 다른 높게 굴절하는 조직에(서)적용될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 George Littlejohn 박사가 To Mount Leaf입니다. PFD의 샘플은 폴리 디메틸 슬론(poly dimethyl Sloane) 또는 P-D-M-S-P-D-M-S의 가스 투과성 개스킷이 있는 현미경 슬라이드를 준비하여 실험 요구 사항에 맞는 챔버를 제공하도록 성형할 수 있는 점탄성 폴리머입니다.

공기가 채워진 병에서 소량의 PFD를 흔들어 PFD를 공기와 평형을 이룹니다. 이것은 PFD를 통해 공기를 버블링하고 PFD를 열린 페트리 접시에 디캔팅하고 전체 묘목 또는 소비세 잎을 액체에 5분 동안 띄우는 것으로도 달성할 수 있습니다. 조직은 유리화 된 조직을 연상시키는 반투명해야합니다.

나뭇잎은 조명 조건과 사용된 조직의 나이에 따라 PFD에 노출되기 전보다 더 어둡거나 밝게 보일 수 있습니다. 마지막으로, PDMS 챔버를 공기역학 PFD로 채우고 배양 페트리 접시의 조직 샘플을 PDMS 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 덮개, 슬립 및 이미지로 슬라이드를 밀봉합니다.

실험적 요구 사항에 따라 개월 잎을 재조합 녹색 형광 단백질 또는 GFP의 현탁액에서 5분 동안 배양했습니다. PFD에서 PFD에서 배양된 잎 샘플의 현미경 검사는 대부분의 공기 공간이 PFD에 현탁된 재조합 GFP로 가득 차 있음을 보여줍니다. GFP는 녹색이고 빨간색은 엽록소, 로또 형광 및 delits 메소 채우기 세포를 나타냅니다.

PFD로 배양할 때 잎이 침수되는 것은 분명하지만 때때로 공기 주머니가 남아 있을 수 있습니다.이러한 조건에서는 물이 잎에 넘치지 않습니다. 여기서, 세포질에 국한되는 YFP의 변형인 Venus를 발현하는 opsys 잎을 배양하여 공기, 물 또는 PFD 레이저 스캐닝에 장착합니다. 샘플의 컨포칼 현미경 검사는 이미징 깊이가 약 2배 증가하면서 공기와 물에 대한 PFD의 이점을 보여줍니다.

PFD와 물을 비교할 때 한 번 마스터하면 이 기술을 제대로 수행하면 5분에서 10분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 주변 델린은 네일 바니시와 테프론을 용해시키지만 실리콘 그리스와 호환된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 식물 잎 세포에서 이미징을 개선하기 위한 장착 매체로 per fluro delin을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

per fluoro delin은 독성이 없지만 이 절차를 수행할 때 표준 안전 관행을 채택하는 것이 좋습니다.