이미징을위한 간단한 방법 Arabidopsis는 Infiltrative 영상 매체로 Perfluorodecalin를 사용하여 잎
2012년 1월 16일
우리는 infiltrative 설치 매체로 perfluorodecalin의 사용을 설명합니다. 이것이 영상의 깊이를 개선하기위한 간단한 방법입니다 Arabidopsis thaliana 잎 조직.
이 절차의 전반적인 목표는 식물 잎의 공극으로 인해 발생하는 생물학적 이미지의 품질 저하를 최소화하여 잎 내부의 살아있는 세포에 대한 더 선명한 이미지를 획득하는 것입니다. 잎을 수성 마운팅 매질에 고정하고 레이저로 형광체를 여기시킬 경우, 주황색으로 표시된 조직 내의 수많은 빈 공극과 굴절률의 변화로 인해 결과 이미지에서 조직 깊은 곳으로부터 오는 신호의 강도가 제한됩니다. 대신 잎을 perfluoro decalin 또는 PFD에 고정하면, 형광체의 레이저 여기 시 감쇠가 적게 일어나 방출되는 신호의 투과율이 향상됩니다.
결과적으로, PFD 마운팅 매질을 이용한 공초점 레이저 주사 현미경(scanning laser confocal microscopy)을 사용하면 수성 마운팅 매질을 사용했을 때보다 두 배 이상 깊은 깊이에서 식물 잎 내부의 살아있는 세포의 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 고정법이나 잎 마운팅 및 수성 매질과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 엽육 조직(mesophyll) 내의 굴절을 줄여, 그동안 문제가 되었던 잎 깊숙한 곳의 살아있는 세포를 더욱 정확하게 이미징할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 엽육 세포 생물학 및 생체 내(in vivo) 신호 전달, 병원균의 잎 침투 및 병원균-엽육 상호작용과 같이 식물 과학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움을 줄 수 있으며, 기초 식물 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
이 방법은 달팽이관이나 척추동물의 폐와 같이 공기층이 풍부하고 굴절률이 높은 다른 조직에도 적용될 수 있습니다. 이 절차의 시연은 제 연구실의 George Littlejohn 박사가 진행하겠습니다. PFD 샘플 준비는 먼저 폴리디메틸실록산(poly dimethyl siloxane) 또는 PDMS의 가스 투과성 가스켓을 사용하여 현미경 슬라이드를 준비하는 것으로 시작합니다. PDMS는 실험 요구 사항에 맞게 챔버를 제작할 수 있는 점탄성 폴리머입니다.
공기가 채워진 병에 소량의 PFD를 넣고 흔들어 PFD를 공기와 평형 상태로 만듭니다. 이는 PFD에 공기를 버블링하여 수행할 수도 있습니다. 그다음, PFD를 개방형 페트리 접시에 붓고 전체 묘목이나 절단한 잎을 액체 위에 5분 동안 띄웁니다. 조직은 유리화된 조직과 유사하게 반투명해져야 합니다.
조명 조건과 사용된 조직의 연령에 따라 잎이 PFD 노출 전보다 더 어둡거나 밝게 보일 수 있습니다. 마지막으로, PDMS 챔버를 공기 포화된 PFD로 채우고 배양용 페트리 접시에서 조직 샘플을 PDMS 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 슬라이드를 커버슬립으로 밀봉하고 이미지를 촬영합니다.
실험 요구 사항에 따라, 월동 잎을 재조합 녹색 형광 단백질(GFP) 현탁액에서 5분 동안 배양하였습니다. PFD 현미경 관찰 결과, PFD로 배양한 잎 샘플의 대부분의 공극이 PFD에 현탁된 재조합 GFP로 채워져 있음을 확인하였습니다. GFP는 녹색으로 표시되며, 적색은 엽록소의 자동 형광과 울타리 조직 및 해면 조직 세포를 나타냅니다.
PFD와 함께 배양하면 잎이 완전히 잠기지만, 간혹 공기 주머니가 남아 있을 수 있다는 점이 분명합니다. 이러한 조건 하에서는 물이 잎을 완전히 채우지 못합니다. 여기서는 세포질에 국소화되는 YFP 변이체인 Venus를 발현하는 opsys 잎을 공기, 물 또는 PFD에서 배양하고 장착한 후 레이저 스캐닝을 수행합니다. 샘플의 공초점 현미경 관찰 결과, PFD가 공기나 물보다 유리하며 이미지 촬영 깊이가 약 2배 정도 증가함을 보여줍니다.
PFD와 물을 비교했을 때, 이 기술을 완전히 익히면 적절히 수행할 경우 5분에서 10분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 peripheral delin은 네일 바니시와 테플론을 용해시키지만, 실리콘 그리스와는 호환된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 식물 잎 세포의 이미징을 개선하기 위해 per fluro delin을 마운팅 매질로 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.
per fluoro decalin은 독성이 없지만, 이 절차를 수행할 때는 표준 안전 수칙을 준수할 것을 권장합니다.
개요
본 논문은 *Arabidopsis thaliana* 잎 조직의 이미징 깊이를 향상시키기 위해 침투성 마운팅 매질로서 perfluorodecalin을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 생세포 이미지의 선명도를 높이는 동시에 생리학적 영향은 최소화합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 식물 생물학
- 이미징 기술
- 세포 생물학
배경
- 식물 잎의 공극은 생물학적 이미지의 질을 저하시킵니다.
- 수성 봉입제는 이미징 시 신호 강도를 제한합니다.
- Perfluorodecalin (PFD)은 굴절을 줄여 이미징 성능을 향상시킵니다.
- 이 기술은 굴절률이 높은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.
연구 목적
- 식물 잎 내 살아있는 세포의 이미징 깊이를 개선하기 위함입니다.
- 식물 생물학 연구를 위해 더 선명한 이미지를 제공하기 위함입니다.
- 세포 생물학 및 병원체 상호작용 연구를 용이하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 가스 투과성 PDMS 챔버 준비.
- PFD의 공기 평형화.
- PFD 내 잎 샘플 배양.
- 공초점 레이저 주사 현미경을 이용한 이미징.
주요 결과
- PFD는 방출된 신호의 투과율을 높여줍니다.
- 이미징 깊이가 수성 매체와 비교했을 때 두 배 이상 깊습니다.
- 잎의 대부분의 공기 공간이 PFD로 채워집니다.
- 해당 기술을 빠르고 효과적으로 수행할 수 있습니다.
결론
- Perfluorodecalin는 이미징을 위한 효과적인 마운팅 매질입니다.
- 이 방법은 식물 내 살아있는 세포 연구를 향상시킵니다.
- 절차 수행 중 표준 안전 수칙을 준수해야 합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
살아있는 식물 조직의 고해상도 이미징은 종종 굴절률 불일치와 공기층으로 인해 제한되며, 이는 신호의 품질과 깊이를 저하시킵니다. 침투성 이미징 매질로 perfluorodecalin(PFD)을 사용하면 생리학적 손상 없이 살아있는 세포를 더 깊고 선명하게 시각화할 수 있습니다. 이러한 역량은 초기 발견 및 분석 개발 단계에서 더욱 예측 가능하고 신뢰할 수 있는 생물학적 통찰력을 제공합니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 생리적으로 관련이 있는 온전한 식물 조직 내에서 세포 프로세스 및 신호 전달의 조사를 가능하게 합니다.
- 광학적 아티팩트를 줄여 복잡한 생물학적 매트릭스에서 더 정확한 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 이미징으로 인한 아티팩트를 최소화하여 하위 생물학적 가설에 대한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 정량적 이미징 분석을 위해 광학적 접근이 가능한 살아있는 샘플의 준비를 용이하게 합니다.
- 굴절률 불일치와 신호 감쇄를 최소화하여 재현 가능한 이미징 조건을 지원합니다.
- 스크리닝 워크플로우에서 형광 리포터와 세포 마커의 견고한 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 다른 공극이 많은 조직에도 적용 가능하여, 식물 및 잠재적으로 동물 모델에서의 중개 연구 연속성을 지원합니다.
- 전임상 연구를 위해 in vivo와 유사한 이미징 조건을 제공함으로써 메커니즘적 리스크를 완화합니다.
- 신약 발굴 단계의 이미징 결과물과 전임상 모델 요구 사항 간의 정렬을 개선합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
PFD 기반 이미징은 초기 발견과 분석법 개발의 접점에서 통합되어, 가설 검증부터 전임상 모델 검증에 이르기까지 고충실도 시각화를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 살아있는 조직의 심부 이미징에서 아티팩트를 최소화하여 가설 기반 연구를 지원합니다.
- 스크리닝: 실험 조건의 비교 분석을 위해 재현 가능하고 정량적인 이미징 결과물을 제공합니다.
- 분석학: 심부에서의 신호 손실과 광학적 왜곡을 줄여 측정 신뢰도를 높입니다.
- 중개 연구: 공기층이 교란 요인이 되는 식물 및 동물 시스템 간의 이미징 방법론을 연결합니다.
- 기업적 재활용: 심부 조직 시각화가 필요한 다양한 생물학적 모델에 광범위하게 적용 가능한 이미징 개선 방법을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 살아있는 조직 이미징에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 이미징 워크플로를 표준화하고 실험 간 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 파이프라인 초기 단계에서 더 높은 품질의 생물학적 데이터를 제공함으로써 보다 정보에 기반한 진행/중단(go/no-go) 결정을 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 복잡한 조직에서의 기술적 이미징 장벽을 낮춤으로써 위험 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 공초점 현미경 사용 및 perfluorocarbon 배지 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- PFD가 일부 플라스틱과 바니시를 용해하므로, 이에 적합한 이미징 챔버와 재료가 필요합니다.
- 이미징 프로토콜 및 시료 준비를 위한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 조직별 요구 사항을 고려하여 Arabidopsis 잎 외에도 공기 층이 풍부한 다양한 조직에 적용 가능합니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 간헐적으로 발생하는 잔류 기포와 재료 호환성 제약이 있습니다.
