Name: 리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 리프트 밸리 열병 바이러스 MP-12 변이체를 역방향 유전학으로 생성하고 특성을 분석하여 백신 개발을 촉진하는 방법입니다. BHK-T7-9 세포를 이용한 바이러스 회복 및 Vero E6 세포에서의 증폭 기술을 익히세요.

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이 작품은 부여 5 번 우수 서양 지역 센터 (WRCE)를 통해 U54 AI057156 - 07, 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 1 R01 AI08764301 - A1, 그리고 대학에서 백신 개발을위한 Sealy 센터에서 내부 자금으로 투자되었다 텍사스 의료 지점.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

RVFV에 대한 유전학 시스템을 리버스는 T7 프로 모터 2,4,5 드나 마우스 3 인간 4 POL - I 프로 모터를 이용하여 여러 그룹에 의해 개발되었습니다. 이 원고에서는, 우리는 BHK/T7-9 세포 15되는 안정 표현 T7 RNA 효소를 사용하여 재조합 RVFV MP - 12 계통을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 바이러스 복구의 효율 BHK/T7-9 세포의 상태에 따라 다양, plasmids의 양을, transfected 세포 등등의 번호입니다. 우리는 항상 실험에 대한 높은 titer의 바이러스 주식을 취득 Vero E6 세포에서 P0 바이러스를 증폭. 이러한 인간의 폐 diploid (MRC - 5) 세포와 같은 타입 - I IFN - 관할 세포는 NSS 입력 - I IFN이나 PKR 포함한 억제 항바이러스 활동으로 효율적인 바이러스 복제를 지원하는 기능을 경우에만 바이러스 증폭에 사용될 수 있습니다. <p class="jove...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 최소 필수 중간 (가상) - 알파 </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 최소 필수 배지 </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> 수정 독수리 중간 (가상 2X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Cellgro </td><td> 30-240 - CR </td><td></td></tr><tr><td> Tryptose 인산 국물 </td><td> MP의 biomedicals </td><td> 1,682,149 </td><td></td></tr><tr><td> 귀족 한천 </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> 대중 교통 - LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti - 가상 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> 에어로졸 꽉 뚜껑 </td><td> Eppendorf </td><td> C - 2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> 0.33 % 중성 빨간색 솔루션 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> N2889 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF 세포 </td><td> InvivoGen </td><td> mef - c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> InvivoGen </td><td> 개미 - BL - 1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> InvivoGen </td><td> 개미 - zn - 1 </td><td></td></tr><tr><td> QUANTI - 블루 </td><td> InvivoGen </td><td> 담당자 - qb1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 세포 15 </td><td> 기후 대학, 일본 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vero E6 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL - 1586 </td><td></td></tr></table>

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 mp - 12 스트레인의 nss 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

출혈성 발열, 신경 장애 또는 인간의 실명 및 고속 낙태와 ruminants 1 태아의보기 흉한 것의 원인이 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)는, 선택한 에이전트 및 위험 그룹 3 병원체를 중복 HHS / USDA으로 분류되었습니다. 그것은 가족 Bunyaviridae에 속 Phlebovirus에 속한이 가족의 가장 악성 멤버 중 하나입니다. RVFV MP - 12 백신 스트레인 2,3뿐만 아니라 ZH548 및 ZH501를 포함한 야생 형 RVFV의 변종 4-6에 대한 몇 가지 역방향 유전 시스템은 2006 년부터 개발되었습니다. MP - 12 변형은 (위험 그룹 2 병원체가 아닌 선택 대리인되는) 몇몇은의 돌연변이 M과 L - 세그먼트로 높은 감쇠 있지만, 여전히 기능 독기를 인코딩 악성 S - 세그먼트 RNA 3, 운반 요소, NSS. 그것으로 effic 복제하면서 rMP12 - C13type (C13type)는 NSS ORF의 삭제 - 프레임의 69 % 나르는 것은, 모든 알려진 NSS 기능을 결여ient는 VeroE6 세포의 MP - 12 타입 - I IFN에 부족 않습니다. NSS는 인터페론 (IFN) - 베타 mRNA 7,8를 포함하여 호스트 전사의 종료 - 오프를 유도하고 사후 translational 수준에서 두 번 좌초 RNA - 의존 단백질 키나제 (PKR)의 저하를 추진하고 있습니다. 9,10 IFN - 베타 transcriptionally입니다 인터페론 규제 요인 3 (IRF - 3), NF - KB 및 활성 단백질 1 (AP - 1) 및 IFN-alpha/beta 수용체에 IFN - 베타의 바인딩 (IFNAR)에 의해 upregulated는 IFN - 알파의 전사를 촉진 NSS에 의한 IFN - 베타 유전자를 포함하여 호스트 전사 억제 바이러스는 복제에 대한 응답으로 그 ISGs의 유전자 upregulations을 방지 반면, 호스트 항바이러스 활동을 유도 유전자 또는 다른 인터페론 자극 유전자 (ISGs) 11, 비록 IRF - 3, NF - KB와 활성제 단백질 1 (AP - 1) RVFV7에 의해 활성화될 수 있습니다. . 따라서, NSS 추가 MP - 12을 자제하고, IFN - 베타 억제 기능을 폐지하여 호스트 타고난 면역 반응을 향상시킬 수있는 좋은 대상입니다. 여기에우리는 재조합 MP - 12 인코딩 변이된 NSS 창출을위한 프로토콜을 설명하고, IFN - 베타 mRNA 합성을 억제하는 기능을 부족한 NSS 돌연변이를 확인하기 위해 검사 방법의 예를 제공합니다. 타고난 면역에 그 본질적인 역할뿐만 아니라, 입력 - I IFN이 돌기 세포 및 적응 면역 반응의 유도 12-14의 성숙을 위해 중요합니다. 따라서, NSS의 돌연변이 타입 - I IFN을 유도하는 것이 더 감쇠 있지만, 동시에 접종 방식에 적합하게 후보자 야생 형 MP - 12보다 자극 호스트 면역 반응에 더 효율적입니다.

리프트 밸리 열병 바이러스 MP - 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP - 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

인간에게 출혈열, 신경계 질환 또는 실명을 유발하고, 가축에게는 높은 비율의 유산 및 태아...을 일으키는 리프트 밸리열 바이러스(Rift Valley fever virus, RVFV)는...

본 절차는 역전사 유전학을 통해 변이된 NSS를 인코딩하는 재조합 리프트 밸리 열병 바이러스(rift valley fever virus) MP 12 균주를 생성하며, 백신 개발을 위한 표현형 특성을 규명하는 것을 목표로 합니다. 먼저, T7 RNA polymerase를 안정적으로 발현하는 Bhk T79 세포의 형질전환 시스템을 사용하여 재조합 MP 12 균주 변이체를 회복시킨 후, 회복된 재조합 MP 12 균주 변이체를 Vero E6 세포에서 증폭하고 플라크 분석법으로 증폭된 MP 12 변이체의 역가를 측정합니다. 본 절차의 마지막 단계는 변이된 NS 단백질에 의한 인터페론 알파(interferon alpha) 또는 베타(beta) 억제 능력의 결여 여부를 스크리닝하는 것입니다.궁극적으로, 이러한 결과는 역유전학 시스템을 통한 리프트 밸리열(Rift Valley Fever) 후보 생백신 제조를 용이하게 할 수 있습니다. 화학적 질소 사용이나 연속 계대 배양을 통해 바이러스 게놈에 무작위로 돌연변이를 도입하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 유전 시스템을 사용하여 바이러스 게놈에 지정된 돌연변이를 도입할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 백신 후보의 면역원성에서 주요 외피 인자인 NSS의 중요성과 같이 리프트 밸리열 백신 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 rift valley fever virus가 형태적으로 블록을 형성하며, 블록의 시각화에 최적화된 기술이 필요하기 때문입니다. 이 방법에 대한 단계별 프로토콜이 보고되지 않았기 때문에, 바이러스 회수 및 수화 단계 학습이 어려우며 따라서 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 6 cm 디쉬에 T7 RNA polymerase를 안정적으로 발현하는 T79 baby hamster kidney 세포를 분주하고, 세포 밀도가 70%에서 80%가 되도록 인큐베이터에 배양합니다. 이후 hygromycin B가 포함되지 않은 완전 MEM alpha 배지로 교체합니다. 한 시간 이내에 rift valley fever virus 회수를 위한 트랜스펙션 과정을 시작합니다.전장 바이러스 RNA 발현을 위해 바이러스 게놈 RNA를 인코딩하는 플라스미드 한 세트와 바이러스 단백질 발현을 위해 바이러스 유전자 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 두 번째 세트를 제작합니다. 이제 1.5 milliliter 튜브에 30 microliters의 transit LT one과 385 microliters의 Optum을 추가합니다. 짧게 볼텍싱하고 5분 동안 배양합니다.실온에서, 생성된 리포좀을 피펫팅으로 가볍게 혼합한 10 µg 플라스미드 세트에 천천히 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 형질전환 혼합물을 BHK-21 cells에 한 방울씩 첨가하고 24시간 동안 배양합니다. 배양 상층액을 complete MEM alpha로 교체하고 4일 더 배양합니다. 배양 상층액을 50 mL 튜브에 수확하고 원심분리를 통해 세포 잔해를 제거합니다.이제 상층액을 5 mL 스크류 캡 크라이오 튜브에 옮기고, 후속 실험을 용이하게 하기 위해 이 P0 바이러스 스톡을 -80 °C에서 보관하십시오. 인터페론 알파 및 베타 유전자가 결핍된 세포에서 P0 바이러스를 증폭시키기 위해, 완전 DMEM에서 80% 밀도로 성장시킨 Vero E6 배양액의 배지를 희석된 P0 바이러스로 교체하고 1시간 동안 배양하십시오.접종물을 제거하고 완전 DMEM 10 mL에서 Vero E6 세포의 세포병변효과(cytopathic effect)가 나타날 때까지 3~4일 동안 배양합니다. 앞서 설명한 방식대로 상층액을 수확하고 해당 샘플을 E6 P1으로 지정합니다. 6-웰 플레이트를 사용하여 Vero E6 세포를 완전 DMEM에서 80% 밀도로 배양합니다. Vero E6 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고, 10배 연속 희석한 E6 P1 바이러스 준비액 400 µL를 첨가한 후 1시간 동안 배양합니다.그동안 한천 오버레이 튜브용 15 milliliter 튜브 두 개를 준비합니다. 튜브 A에는 증류수에 1.2% noble agar를 녹인 용액 7 milliliter를 넣고, 튜브 B에는 2 x complete MEM과 10% trip dose phosphate broth 7 milliliter를 넣습니다. 항온수조에서 15분간 가열한 후, 튜브 B의 내용물을 튜브 A로 붓고 피펫을 사용하여 함께 섞습니다. 바이러스 접종액을 튜브 A와 B를 1:1로 혼합한 용액 2 milliliter/well로 교체합니다. 세포를 3~4일 동안 계속 배양합니다.튜브 A에 1.2% noble agar, 2x complete MEM 및 neutral red를 추가하여 auger 오버레이를 준비하고, 튜브 B와 neutral red라고 표시된 세 번째 튜브도 동일하게 준비합니다. 튜브 A는 42 °C 항온수조에, 나머지 두 튜브는 37 °C 항온수조에 15분 동안 넣습니다. 그 다음 튜브 A 7 mL, 튜브 B 7 mL 및 neutral red 0.5 mL를 함께 혼합합니다. 이 혼합액 2 mL를 6-well 플레이트의 각 웰에 분주하고 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 mL당 platforming unit의 수를 결정합니다. C 57 야생형 마우스 배아 섬유아세포는 NF kappa B 및 IRF 3 또는 7에 의해 유도 가능한 분비형 embryonic alkaline phosphatase 유전자를 인코딩합니다.본 실험에서는 선천 면역 반응에 의해 유도된 seep 활성을 분석합니다. 12-well 플레이트에 배양된 sub-confluent 세포에 NS 돌연변이가 인코딩된 재조합 MP 12 또는 MP 12 대조군을 감염시키고 1시간 동안 배양합니다. 접종물을 제거하고 well당 1 mL의 complete DMEM을 첨가한 후 14시간 동안 배양합니다. seep 분석을 위해 배양 상청액을 수집합니다. 96-well 플레이트의 각 well에 200 µL의 quantum blue를 넣고 각 샘플 50 µL를 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.플레이트 리더를 사용하여 650 nanometers에서 OD를 측정합니다. 리프트 밸리열 바이러스는 MP 12 균주의 NSS와 비교하여 SM 및 L 세그먼트로 명명된 3분체 음성 가닥 RNA 게놈을 가지고 있습니다. C 13 타입의 오픈 리딩 프레임은 69% 절단되어 있습니다. 일반적으로 역유전학 시스템은 C 13 타입 바이러스의 경우 milliliter당 10 to the six PFU 이상의 타이터를 가진 생존 가능한 재조합 MP 12 바이러스를 생성합니다.N 단백질의 기능이 결여된 경우 거대하고 혼탁한 플라크를 형성하는 반면, MP 12는 감염 14시간 후 모의 감염된 세포와 비교하여 다양한 크기의 투명한 플라크를 형성했습니다. MP 12에 감염된 C 57 야생형 생쥐 세포는 배양액 내 seep 수치를 증가시키지 않았습니다.반면, C 13 유형 감염은 감염 후 14시간까지 seep 수준의 증가를 유도합니다. 마우스 ISG 56 mRNA에 특이적인 RNA 프로브를 사용한 northern blot 분석 결과, N'S 발현이 없는 상태에서 ISG 56 mRNA의 상향 조절이 확인되었습니다. 마우스 면역화 및 중화 항체 테스트와 유사한 방법으로 이 절차를 수행하면 NSS 돌연변이의 면역원성과 같은 질문을 조사할 수 있습니다. 이 기술은 콕시디오이데스 진균증(Valley Fever) 분야의 연구자들이 감염된 세포 및 동물 내에서 비구조 단백질 유전자의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.감염성 바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 에어로졸 흡입을 방지하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 이 영상을 시청한 후에는 재조합 MP 12 균주를 회복 및 역가 측정하는 방법과 인터페론 알파 베타 억제 기능이 결여된 NSs 돌연변이체를 스크리닝하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

using-reverse-genetics-to-manipulate-nss-gene-rift-valley-fever-virus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Noroviruses들이 특성화를위한 위장염 아직 분자 기술의 주요 원인은 아직 비교적 새로운입니다. 여기 murine 노로 바이러스 (MNV), 세포 배양에서 증식 수있는이 속의 유일한 구성원의 효율적인 복구를위한 두 개의 역방향 유전학 방법을보고합니다.

감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

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의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

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우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

칠면조 (HVT)의 herpesvirus 조류 질병의 숫자에 대 한 재조합 백신의 세대에 대 한 벡터 플랫폼으로 널리 사용 됩니다. 이 문서는 통합된 NHEJ-CRISPR/Cas9 및 Cre Lox 시스템을 사용 하 여 재조합 형 HVT 벡터화 백신의 세대에 대 한 간단 하 고 빠른 접근을 설명 합니다.

CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

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리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화

이는 재조합 바이러스의 호스트 범위 선택 및 시각적 식별을 사용하여 "무소" 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법이다.

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이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

배우세요 리프트 밸리 열병 바이러스 MP-12 변이체를 역방향 유전학으로 생성하고 특성을 분석하여 백신 개발을 촉진하는 방법입니다. BHK-T7-9 세포를 이용한 바이러스 회복 및 Vero E6 세포에서의 증폭 기술을 익히세요.

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

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