이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서 발광 생물 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내 이미징을 통해 시간이 지남에 따라 정량적으로 따를 수 있는 신경교종의 두개내 모델을 만드는 것입니다. 이는 첫 번째 수확을 통해 이루어지며, 발광 미러링 신경교종 세포에 의해 배양하고, 10에서 7 밀리리터당 7번째 세포의 1-2배의 세포 현탁액을 준비함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 수확된 세포를 쥐 뇌의 오른쪽 전두엽에 정위 이식하는 것입니다.

그 다음에는 루시퍼를 동물에 피하 주사하고 루시퍼 발현을 위한 운동 곡선을 생성합니다. IVUS 스펙트럼 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 절차의 마지막 단계는 동물을 연속적으로 이미징하고 종양 성장을 추적하는 것입니다. 궁극적으로, IVUS 스펙트럼 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 검출할 수 있는 생물 발광 신호를 통해 종양 세포 성장 및 종양의 3D 국소화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

MRI와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 생물 발광 영상이 살아있는 종양 세포만 식별하고 특별히 훈련된 MRI 기술자가 필요하지 않다는 것입니다. 또한 더 짧은 시간에 동물을 동시에 이미지화할 수 있습니다. 이 방법은 뇌종양에 대한 새로운 치료법의 효능이 무엇인지와 같은 신경 종양학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

생체 내에서, 이 방법은 뇌종양에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 폐암, 전립선암, 간암과 같은 다른 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 준비하기 위해 최소 3마이크로리터의 신경교종 세포 접종물을 26게이지 베벨 바늘이 있는 10마이크로리터, 50mm 주사기에 로드합니다.

세포가 뭉쳐 있지 않은지 확인하거나 주사기를 다시 로드해야 할 수 있습니다. 마취된 마우스는 정위 프레임에 배치되고 마우스 머리는 이 그림과 같이 마우스 클램프를 사용하여 고정됩니다. 장전된 주사기를 마이크로 인젝터에 놓습니다.

수술을 시작하려면 15 사이즈 면도날과 치아 집게를 사용하여 피부를 절개합니다. 동물의 눈 사이를 10-15mm 절개하여 동물의 귀 쪽으로 이동하여 bgma를 노출시킵니다. bgma를 올바르게 식별해야 합니다.

bma의 원위부에 있는 부비동 영역과 쉽게 혼동될 수 있습니다. 16 게이지 1.5인치 바늘로 두개골이 관통되고 뇌가 노출될 때까지 비틀면서 바늘에 약간의 압력을 가하여 버 구멍을 관상 봉합사 0.1mm, 정중선 오른쪽으로 2.3mm 만들고 두개골이 관통되어 뇌가 노출될 때까지 비틀면서 바늘에 약간의 압력을 가하고 마이크로 인젝터를 사용하여 주사 바늘이 뇌 표면에 닿을 때까지 움직입니다. 이 위치에서 바늘을 3mm 깊이로 전진시킵니다.

바늘을 3분 동안 제자리에 두십시오. 다음으로, 바늘을 뇌 표면 아래 2.6mm의 총 깊이로 0.4mm 빼냅니다. 이것은 적절한 배치와 깊이를 보장하기 위해 세포를 주입할 작은 포켓을 만듭니다.

바늘 깊이의 X-ray 이미지는 C-arm을 사용하여 촬영할 수 있으며, 분당 667 NANOLITERS의 주입 속도로 2000 나노리터의 부피로 설정된 마이크로 인젝터를 사용하여 3 분 동안 세포 현탁액을 주입 할 수 있습니다. 주입 후 주입 부위에서 누출을 방지하기 위해 2분 동안 바늘을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 천천히 바늘을 완전히 빼냅니다.

바늘을 빼내면 Penfield 해부기를 사용하여 뼈 왁스로 버 구멍을 덮습니다. 마지막으로, 4개의 비드릴 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합하고 피부에 큰 틈이 남지 않도록 합니다. 생체 내에서.

생물 발광 이미징은 IVIS Spectrum 이미징 시스템을 사용하여 수행됩니다. 라이브 이미지 소프트웨어를 시작하고 제어판의 오른쪽 하단에 있는 IVIS 시스템 초기화 버튼을 클릭하여 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 초기화합니다. 제어판의 왼쪽 상단에서 발광 이미징 모드를 선택하여 생물 발광 이미징의 최적 시간을 결정합니다.

동물에 루시퍼 주사를 한 후, 먼저 이미징 챔버에서 진정제를 투여한 동물을 대상으로 동역학 연구를 수행해야 합니다. 루시퍼 주입 후 약 5분 후에 첫 번째 이미지를 촬영하여 루시퍼 발현을 위한 운동 곡선을 생성합니다. 최대 1시간 동안 3분마다 이미지를 촬영하는 시퀀스를 만듭니다.

제어판에서 시퀀스 설정 버튼을 클릭합니다. 제어판에서. 시퀀스의 첫 번째 생물 발광 이미지에 대한 설정을 중간 베닝 및 자동 노출로 시작하여 지정합니다.

최적의 노출을 결정하려면 시간을 사용하는 것이 좋습니다. 시퀀스 편집기에서 지연 버튼을 선택하고 각 수집 사이에 3분의 지연 시간을 지정합니다. 시퀀스 편집기에서 추가를 클릭하면 획득 매개변수가 테이블에 추가됩니다.

곡선이 설정되면 시퀀스의 각 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다. 최적의 이미징 시간은 가장 강력하고 정확한 신호를 얻기 위해 신호 강도 대 시간을 플로팅하여 결정할 수 있습니다. 동물은 생체 내 광자 수가 가장 높은 시간, 즉 이 곡선에서 볼 수 있듯이 루시퍼 주입 후 약 25분 후에 이미지화해야 합니다.

실험 동물의 이미지를 획득하려면 획득 시간에서 auto 옵션을 사용합니다. 이를 통해 소프트웨어는 bin과 이미지를 수집하기 위한 최적의 시간 길이를 결정할 수 있습니다. 프로그램 파일과 후속 이미지 주석을 사용자의 컴퓨터 디렉토리에 저장합니다.

3D 이미징을 시작하려면 이미징 마법사를 사용하여 반딧불이 리포터 프로브를 선택합니다. bioluminescence delit 창에서 next를 선택하면 획득할 6개의 스펙트럼 선택이 화면에 나타나고 획득 시퀀스를 선택하면 surface topography 탭 아래의 해당 설정을 사용하여 이미지가 촬영됩니다. 도구 팔레트에서 동물의 윤곽에 맞게 사진을 마스크합니다.

동물의 표면 지형에 대한 재구성된 메시를 생성하려면 도구 팔레트의 DLI 3D 재구성 탭으로 이동하여 신호 재구성을 위한 적절한 이미지 획득을 선택합니다. muscle은 tissue properties 아래에 나열되어 있고 firefly는 source spectrum 아래에 나열되어 있는지 확인하십시오. 분석 탭에서 재구성을 클릭하면 동물 표면의 3D 재구성과 신호 소스의 해당 재구성이 나타납니다.

데이터 분석은 이미지를 획득하고 저장한 후 시작할 수 있으며, 찾아보기 버튼을 클릭하고 파일을 선택하여 프로그램 파일에 액세스할 수 있습니다. 이미지 정보는 이미지 정보 보기에서 찾을 수 있습니다. 관심 영역 또는 ROI 도구 버튼을 선택하여 신호의 강도를 정량화합니다.

Photon을 선택하여 Photon 모드에서 이미지가 분석되었는지 확인합니다. 이미지 제어판의 왼쪽 상단 모서리에 있는 드롭다운 목록의 유형 드롭다운 목록에서 측정 ROI 버튼을 선택하고 관심 있는 ROI 모양을 선택합니다. 옵션에는 circle, square 및/또는 grid가 포함됩니다.

ROI 형상 선택을 생물 발광 신호가 포함된 영역으로 끌어 ROI 위치를 설정합니다. 획득한 이미지의 모든 강도 영역을 커버해야 합니다. 마지막으로 측정 버튼을 클릭하여 ROI의 신호 강도를 계산합니다.

ROI 레이블이 표시됩니다. 이식된 세포가 Luck 또는 Luck Two 유전자로 transfection되었는지 여부에 관계없이 수술 당일 생물 발광 영상으로 이식된 세포를 감지할 수 있을 때 세포 이식의 강도가 분명합니다. 이 그래프는 GL 2 6 1 행운 종양 세포 성장을 추적하며, 알비노 C 57 블랙 식스 마우스에서 3일마다 생물 발광을 측정하고 이식 후 일수 대비 생체 내 광자 수로 표시했습니다.

사진은 다양한 시점에서 생물 발광을 보여줍니다. 착색은 종양 세포 수에 상대적인 생물 발광을 나타냅니다. 동물은 질병이 발생하거나 복지가 좋지 않을 때 안락사됩니다.

이러한 분석의 표준 부분은 아니지만 뇌를 해부할 수 있고 루시퍼를 국소적으로 추가하여 성 생체 이미지를 얻을 수 있습니다. 이것은 생물 발광 반응이 TP를 필요로 하기 때문에 동물을 희생시킨 직후에 수행되어야 합니다. 이 그래프는 GL 2 6 1 lux 세포와 GL 2 6 1 L 2 세포에서 생성된 종양에서 얻은 광자 수를 비교합니다. 평균 5마리의 동물에서 얻은 결과는 L 2 유전자가 더 높은 수준의 생물 발광을 제공한다는 것을 보여줍니다.

다음 그림은 마우스, 골격 및 뇌와 함께 등록된 GL 2 6 1 L 두 개의 세포의 두개내 이식의 3차원 재구성에 대한 여러 보기를 보여줍니다. 루시퍼 주사 후 3분 후에 피하 및 복강내 주사의 동역학 비교도 수행되었으며, 마우스는 최대 1시간 동안 3분마다, 그리고 그 후에는 6분마다 진정 및 영상화를 수행하여 생물 발광의 운동 곡선을 생성했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 빨간색으로 표시된 루시퍼 투여의 피하 뿌리는 검은색으로 표시된 복강 내 주사보다 우수하며, 동물을 이미지화할 수 있는 최적의 시간은 루시퍼 주사 후 약 25분입니다.

일단 숙달되면 수술 기법이 제대로 수행되면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 MRI 또는 형광 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 종양 주변에 부종이 있는지 또는 종양 내부와 주변에서 어떤 다른 분자 또는 생화학적 변화가 일어나고 있는지 여부입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 진흙 신경교종 세포의 두개내 이식 및 3D 생체 내 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.