Name: 감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 배우세요 감지 개구리 정자 화학적 유인을 평가하는 두 가지 분석법을 통해 생식 생물학 연구를 수행하는 방법을 알아보세요. 이 기법은 수정 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 그들의 비디오 현미경 작업 스테이션의 사용을 위해 WM 중사님의 Bioimaging 연구소 주셔서 감사합니다. 이 연구는 NSF 부여 이븐 - 0,615,435에 의해 지원되었다.

<ol><li>Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+Arbacia+punctulata+spermatozoa+to+resact%2C+a+peptide+from+the+egg+jelly+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer.</a> J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).</li>
<li>Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+velocity+and+induction+of+chemotactic+response+in+mouse+spermatozoa+by+follicular+and+oviductal+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids.</a> J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).</li>
<li>Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+capacitated+rabbit+spermatozoa+to+follicular+fluid+revealed+by+a+novel+directionality-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay.</a> Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).</li>
<li>Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+multimer+formation+of+allurin%2C+a+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+laevis+egg+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).</li>
<li>Al-Anzi, B., Chandler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+egg+jelly+releases+a+sperm+chemoattractant+during+spawning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning.</a> Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).</li>
<li>Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+attraction+to+a+follicular+factor%28s%29+correlates+with+human+egg+fertilizability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).</li>
<li>Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemotaxis+when+the+fraction+of+responsive+cells+is+small--application+to+mammalian+sperm+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small--application to mammalian sperm guidance.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).</li>
<li>Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+spikes+in+the+flagellum+control+chemotactic+behavior+of+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm.</a> EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).</li>
<li>Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+bursts+occur+around+a+local+minimal+concentration+of+attractant+and+trigger+sperm+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).</li>
<li>Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+jelly+proteins+stimulate+directed+motility+in+Xenopus+laevis+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).</li>
<li>Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbaigar%2C+T+%22J.+Androl%22">J. Androl</a>. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal+analysis+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fractal analysis of capacitating human spermatozoa.</a> Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).</li>
<li>Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+locating+the+female+gamete%3A+the+importance+of+measuring+sperm+trajectories+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).</li>
<li>Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors+and+olfactory-like+signaling+mechanisms+in+mammalian+sperm.Mol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol.</a> Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).</li>
<li>Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+Ca2%2B+dynamics+correlate+with+diverse+behavioral+phenotypes+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm.</a> J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).</li>
<li>Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+Xenopus+laevis+sperm+exhibits+multiple+gears+and+its+duration+is+extended+by+egg+jelly+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents.</a> Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).</li>
<li>Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis.</a> Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).</li>
<li>Riffell, J. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+flow%3A+the+consequences+of+fluid+shear+for+sperm-egg+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions.</a> J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).</li>
<li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+sperm+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).</li>
<li>Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+as+revealed+with+live+and+synthetic+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs.</a> Biol Bull. 220, 1-5 (2011).</li>
<li>Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+species-specificity+in+mammalian+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis.</a> Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).</li>
<li>Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+from+the+cumulus+cells+is+the+sperm+chemoattractant+secreted+by+the+rabbit+oocyte+cumulus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex.</a> PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).</li>
<li>Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+chemoattractant+secreted+from+human+cumulus+cells+is+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone.</a> Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).</li>
<li>Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+human+sperm+chemotaxis+mediated+by+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone.</a> PLoS One. 4, 8211-82 (2009).</li>
<li>Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+pattern+of+movement+during+chemotactic+re-orientation+towards+a+progesterone+source%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source.</a> Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).</li>
<li>Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte chemotaxis.</a> Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+human+follicular+fluid+contains+a+chemoattractant+for+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+induces+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Progesterone induces human sperm chemotaxis.</a> Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).</li>
<li>Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. llurin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+21+kD+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+egg+jelly%2C+is+homologous+to+mammalian+sperm-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

amoeboid 운동이나 flagella 구동 수영에 의해 움직이는 세포의 Chemotaxis은 많은 생물 학적 문맥에서 발견하고이 현상의 연구는 실용적이고 안정적​​인 assays의 가용성을해야합니다. 이러한 성게 계란이나 fruiting기구를 형성 점액 금형 세포의 모임에 정자의 매력으로 현상의 몇 가지 예입니다, 즉각적인 시각적 영향을 미칠. 이러한 현상의 Quantitation는 Eisenbach 18에서 설명한대로 다양한 방법으로 수행되었습니다. 이러한 assays는 모세 혈관은 Makler 챔버는 정자와 chemoattractant에 대한 우물을 가질 그라디언트 및 사용을 만들 저수지에 가입 모세 혈관을 사용 정자를 유치 가득 chemoattractant의 사용을 포함합니다. 본 논문은 이제 더 자주 사용되는 두 개의 &quot;2 세대&quot;assays을 설명합니다. 이러한 assays 아직도 그들은 여러 가지 새로운 기능을 통합 그라디언트를 만들 필요가에 의존하지만. 첫째, 두 챔버 분석은...

<table border="1"><tbody><tr><td> 항목의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 24 잘 접시 </td><td> Becton - Dickenson </td><td> 1,147분의 35 </td><td></td></tr><tr><td> 12 μm의 기공 멤브레인와 12mm 외경 삽입 </td><td> Millipore </td><td> PIXP01250 </td><td> 우리는 이전에 Costar - 코닝 transwell 플레이트 # 3403 - 지금은 중단하는데 </td></tr><tr><td> Zigmond 챔버 </td><td> Neuroprobe </td><td> Z02 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 오일 </td><td> 제너럴 일렉트릭 </td><td> SF1154 </td><td> 다우 코닝 550의 유체에 해당 </td></tr><tr><td> 이미지 J 소프트웨어 </td><td> 웨인 Rasband, 연구 서비스 지점, 정신 건강의 국립 연구소 </td><td> 에서 무료 다운로드 http://rsbweb.nih.gov/ij </td><td> 윈도우 린에서 실행되는 자바 프로그램UX 및 Mac </td></tr><tr><td> MtrackJ 소프트웨어 </td><td> 에릭 Meijering / Imagescience / <a href="http://www.bigr.nl/">바이오 메디컬 이미징 그룹</a> , Erasmus MC - 대학 의료 센터 로테르담 </td><td> 사이트에서 무료로 다운로드할 <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/</a> </td><td> 윈도우, 리눅스 및 Mac에서 실행되는 자바 프로그램 </td></tr><tr><td> 가상 재녹음 소프트웨어 </td><td> <a href="http://www.virtualdub.org/gpl.html">GNU 일반 공중 라이센스</a> 소프트웨어 </td><td> 를 통해 무료 다운로드 <a href="http://www.virtualdub.org/index.html">http://www.virtualdub.org/index.html</a> </td><td> 플러그인에서 이미지 J 웹사이트에서 설치 지침, 전용 Windows 용 </td></tr><tr><td> cellSens 소프트웨어 </td><td> 올림포스 산 </td><td> : 홈페이지 참조 <a href="http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070">http://www.olympusamerica.com/seg_section/p을</a>roduct.asp? 제품 = 1,070 </td><td> 컨트롤 및 카메라의 다양한 이미지를 얻습니다. 또한 이미지 처리 능력을 가지고 </td></tr></tbody></table>

감지 개구리 정자 chemoattraction에 대한 assays 두 종류의

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

무척추 동물의 정자 chemoattraction 하나는 정자 서스펜션에 매력적인 펩티드를 포함하는 피펫을 배치하고 미세 피펫 1 시경 정자 축적을 시각화 수있는 충분한 강력한하실 수 있습니다. 같은 개구리, 설치류 동물과 인간과 같은 척추 동물의 정자 chemoattraction 감지하기가 더 어렵습하고 양적 assays가 필요합니다. chemoattractant의 소스, 이른바 정자의 누적 assays, 실제로 개별적인 정자의 수영 궤도를 추적 assays하기 위해 정자의 움직임을 quantitate assays - 이러한 assays는 크게 두 가지 유형의 수 있습니다. 정자의 누적 assays하므로 선량 반응 곡선 및 시간 코스가 상대적으로 빠르게 진행 될 수 있도록 비교적 빠른 있도록 수십 또는 하루에 할 수 assays 수백 있습니다. assays 이러한 종류의 많은 잘 설립 chemoattraction 시스템을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되었습니다 - BAC에 예를 들어, 호중구은 chemotaxisfollicular 유체에 terial 펩티드와 정자의 chemotaxis. 정자 추적 assays 집중보다 노동 수 있지만 chemoattractancts 실제로 정자가 들어있는 수영장 경로를 변경 방법에 대한 자세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 분석의이 유형은 chemoattrractant 그라데이션 축에 비해 정자 운동의 방향을 설명하고 특성을 전환하거나 달걀에 가깝게 정자를 가지고 방향의 변화를 시각화하기 위해 필요합니다. 여기 assays 이러한 두 가지 유형의 각각의 사용 방법을 설명합니다. 활용 정자 축적 분석은 &quot;두 챔버&quot;분석이라고합니다. 수륙 양용의 정자는 12 μm의 직경의 모공을 가진 폴리 카보 네이트 필터 층과 조직 문화 플레이트 삽입에 배치됩니다. 정자와 삽입물은 버퍼와 신중하게 바닥이 벽을 (그림을 참조하십시오. 1) &#39;요건을 충족하고 잘 하단에 pipetted chemoatttractant를 포함하는 조직 문화 판 우물에 게재됩니다. 부화 후, 정자 저수지를 포함하는 상위 삽입은 신중하게 r이된다막 통과가 아래쪽 챔버에 emoved, 그리고 정자가 제거 pelleted 후 hemocytometer 또는 흐름 cytometer로 계산됩니다. 정자 추적 분석은 원래 호중구의 chemotaxis을 준수를위한 개발 Giojalas 동료 2,3에 의해 정자의 관찰에 대한 수정 Zigmond 챔버를 사용합니다. 챔버는 두 세로 골짜기가 가공되어이있는에 두꺼운 유리 슬라이드로 구성되어 있습니다. 이들은 1mm 폭 전망대로 구분됩니다. 커버 유리, 정자의 응용 프로그램을 하나의 구유에로드되고 나면, 개별 정자의 다른과 운동으로 chemoattractant 에이전트 비디오 현미경에 의해 시각. 비디오 영상은 다음 각 정자의 궤도를 형성 시간 (xyt 데이터 세트)의 함수로 XY 평면에 2 차원 세포 움직임을 파악하는 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

달걀 주위에 계란과 세포외 코팅 자주 정자와 통신이이를 수정을 홍보 계란 그들을 안내하는 것을 펩티드, 단백질, 작은 분자를 놓습니다. 정자의 누적 assays와 정자 추적 assays - 우리가 정자 chemoattraction를 감지하는 데 사용되는 assays 두 가지 클래스를 설명하고 비교 개구리 정자를 사용하여.

감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의

무척추동물의 정자 화학주성은 충분히 강력하여, 유인 펩타이드가 포함된 피펫을 정자 현탁액 속에 배치하는 것만으로도...

본 연구에서는 2-챔버 분석법(two chamber assay)을 통해 정자의 화학주성을 평가하는 두 가지 서로 다른 방법을 설명합니다. 먼저 활성화된 개구리 정자를 24-웰 플레이트의 웰에 설치된 다공성 막 바닥의 인서트에 분주합니다. 정자가 배치되면, 화학유인물질을 웰 바닥에 조심스럽게 첨가하여 화학주성 구배를 형성합니다.다음으로, 화학주성 기울기에 반응하여 세포가 다공성 막을 통과할 수 있도록 정자를 배양합니다. 마지막으로, 인서트를 제거하고 2-챔버 분석법(two chamber assay)을 통해 웰 바닥으로 이동한 정자의 수를 혈구계수기로 측정합니다. 궁극적으로, 예를 들어 지그만 챔버 추적 분석(zigman chamber tracking assay)의 용량 반응 곡선 분석을 통해 정자 화학 유인제의 활성을 비교하고 정량화할 수 있습니다.먼저 실리콘 오일을 사용하여 커버 글라스를 zigman 챔버에 부착한 후, 이를 현미경의 원형 개구부 위에 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 챔버의 한쪽 구획을 활성화된 개구리 정자로 채웁니다. 다음으로, 반대쪽 구획을 화학 유인 물질 용액으로 채웁니다.5분 후 화학 촉성 구배가 형성되며, 이때 정자가 구배를 따라 수영하는 모습을 비디오로 촬영할 수 있습니다. 최종적으로 zigmund 챔버 추적 분석을 통해 획득한 영상은 정자의 속도와 화학 유인제 구배에 반응하는 정자의 화학 운동 패턴 및 이동 경로를 결정하기 위해 분석될 수 있습니다. 정자의 화학 촉성을 검출하는 이 두 가지 방법은 상호 보완적이며 서로 다른 유형의 데이터를 생성합니다.2-챔버 분석법은 정자가 다공성 막을 통과하게 함으로써 화학 유인 물질에 대한 정자의 반응을 정량화할 수 있게 합니다. 초기 단계의 정자 및 화학 유인 물질 첨가 과정과 마지막 단계의 정자 및 인서트 제거 과정에서 마이크로 피펫의 정밀한 조작이 필요하므로, 2-챔버 분석법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. zigmund 챔버 분석법은 비디오를 사용하여 화학 촉성 구배 내에서 정자가 유영하는 모습을 기록합니다.이를 통해 속도 및 방향과 같은 동적 파라미터를 결정할 수 있습니다. zigmund 챔버 추적 분석법이 2-챔버 분석법보다 유리한 주된 점은 정자의 수영 모습을 시각화하고 여러 동적 파라미터로 분석할 수 있다는 것입니다. 개구리 정소의 한쪽 끝에 구멍을 뚫고 반대쪽 끝에서 주사기와 바늘로 완충액을 주입하여 정자를 씻어내십시오.개구리 정소에서 정자를 씻어낸 후, 혈구계로 수집된 세포 수를 추산합니다. 그런 다음, 정자 저장액을 난자 링거 완충액(oocyte ringer's buffer)으로 희석하여 정자 밀도를 2 × 10⁷ cells/mL로 맞춥니다. 정자 5 µL를 F1 완충액으로 1:10 비율로 희석한 뒤 위상차 현미경으로 관찰하여 정자 운동성을 평가합니다.다음으로 마이크로 파이펫을 사용하여 24웰 플라스틱 조직 배양 플레이트의 각 웰에 F1 buffer 700 µL를 넣습니다. 그런 다음, 수행할 각 분석을 위해 마이크로 원심분리 튜브에서 실온 상태로 정자 현탁액 100 µL를 F1 buffer 900 µL로 희석하여 삼투압 충격을 통해 정자 운동성을 활성화합니다. 외경 12 mm, 공극 크기 12 µm인 인서트를 버퍼가 채워진 웰에 넣으며, 이때 인서트가 한쪽으로 치우치게 배치하여 측면에 공간을 남겨둡니다.그런 다음 커팅 팁이 장착된 마이크로 파이펫을 사용하여 운동성이 활성화된 정자 400 µL를 즉시 웰로 옮기고, 정자 현탁액을 인서트 벽면에 도포하여 인서트 바닥의 필터 위로 흘러내리게 합니다. 이어서, 웰과 중심에서 벗어나 배치된 인서트 사이의 공간에 화학 유인제 50 µL를 각 웰에 조심스럽게 마이크로 파이펫으로 분주합니다.웰의 측면과 바닥이 만나는 지점에 조심스럽게 액적을 떨어뜨립니다. 시스템에 영향을 주지 않도록 피펫을 제거합니다. 모든 분석 준비가 완료되면.첫 번째 분석의 배양이 50분 동안 진행될 때까지 플레이트를 실온에 둡니다. 그 후, 한 손으로 인서트를 조심스럽게 고정한 상태에서 첫 번째 분석을 마칩니다. 마이크로 피펫을 사용하여 상단 챔버의 정자 현탁액 대부분 또는 전부를 제거함으로써 분석을 중단합니다.상부 챔버에서 정자를 옮긴 후, 즉시 인서트를 꺼내 폐기하십시오. 이제 각 웰의 정자 현탁액을 혼합하여 바닥에 가라앉은 정자를 다시 부유시킵니다. 그다음 각 웰의 정자 현탁액 전체를 개별 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오.최종 농도가 0.5% v/v가 되도록 포름알데히드를 첨가합니다. 각 튜브에 고정된 정자를 원심 분리하여 침전시킵니다. 10초 푸시 버튼을 사용하여 개인용 마이크로 원심분리기로 회전시킵니다.그런 다음 각 튜브에서 상층액을 100 µL만 남기고 모두 제거한 후, 그 부피로 펠렛을 재현탁합니다. 이어서 정자 현탁액 20 µL를 증류수로 10배 희석하고, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 정자 수를 측정합니다. 정립 현미경의 40x 대물렌즈를 사용하여 두 챔버 분석을 수행하면 용량 반응 연구나 유인제 간의 비교에 적합한 정량적 결과를 얻을 수 있습니다.예를 들어, 개구리 알의 수중액은 빨간색 기호로 표시된 것과 같이 정자를 유인하는 화학 유인 물질을 포함하고 있습니다. 정자 화학 유인 물질의 농도가 증가함에 따라, 알 수중액은 다공성 막을 통과하는 정자의 수를 먼저 증가시킨 후 감소시킵니다. 이와 대조적으로, 흰색 기호로 표시된 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)은 동일한 농도 범위에서 거의 영향을 미치지 않습니다.zigman chamber 분석을 시작하기 전, 먼저 도립 현미경 워크스테이션이 비디오 녹화 준비가 되었는지 확인하십시오. 현미경을 설정하십시오. 초당 7프레임으로 영상을 획득하도록 카메라 제어 소프트웨어를 실행하십시오.카메라가 관찰 플랫폼에 초점이 맞았는지, 그리고 출력 화면이 컴퓨터 모니터로 전송되고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 현미경 시야에 관찰 플랫폼 너비의 대부분 또는 전체가 포함되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 난모세포 링거 완충액(oocyte ringer's buffer)을 사용하여 개구리 정자 현탁액을 준비하고, F1 완충액으로 적절한 농도로 희석한 화학 유인 물질(chemo attractant)을 준비하여 두 용액 모두 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오.그다음 깨끗하고 건조한 zigmund 챔버를 준비합니다. 마이크로 파이펫을 사용하여 각 트러프(trough)의 외곽 가장자리에서 약 5 mm 떨어진 지점에 평행하게 약 4 µL의 실리콘 오일을 한 줄로 도포합니다. 그런 다음 22 x 40 mm 커버 글라스를 챔버 위에 덮어 실리콘 오일이 각 트러프의 외곽 가장자리까지 고르게 퍼지도록 합니다.이제 챔버를 뒤집어 현미경 스테이지의 커다란 원형 구멍 위에 놓습니다. 커버 글라스가 스테이지에 닿지 않도록 주의하면서, xap sperm이 담긴 oocyte ringer's buffer 20 µL를 실온에서 F1 buffer와 1:10 비율로 혼합하여 활성화합니다. 팁 끝을 자른 마이크로 파이펫을 사용하여 운동성이 활성화된 정자 70 µL를 즉시 흡입합니다.그 다음 마이크로 파이펫을 낮은 각도로 잡고 팁을 측면 개구부에 배치합니다. 모세관 현상을 이용하여 trth와 bridge를 채웁니다. 그 후, xap 정자의 운동성 수명이 제한적이므로 동일한 방식으로 화학 유인제 용액을 사용하여 반대편 trth를 채웁니다.3분 이내에 비디오 녹화를 시작하여 5분 동안 지속하십시오. Zigman 챔버 추적 분석법을 통해 화학 유인 물질 농도 구배에서 정자가 헤엄치는 모습을 비디오 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 이 영상은 관찰 플랫폼 위에서 헤엄치는 정자의 기록이며, 이 도식에 표시된 것과 같이 정자의 궤적이 빨간색으로 추적됩니다.정자 궤적은 여러 세그먼트로 구성되며, 각 세그먼트는 화살표로 표시되어 연속된 동영상 프레임 사이의 정자 이동 경로를 나타냅니다. 궤적 세그먼트는 개별 정자의 유영 행동을 추적하며 원형 이동이나 회전과 같은 패턴을 부각합니다. 이러한 데이터를 통해 각 세그먼트의 속도와 방향, 또는 단일 궤적이나 궤적 그룹 내 모든 세그먼트의 특성을 결정할 수 있습니다.예를 들어, 순 선형 거리입니다. 궤적의 시작점과 끝점을 잇는 벡터는 x축 성분을 가지며, 여기에서 빨간색으로 표시된 것처럼 x축으로부터 theta 각도로 형성됩니다. 화학 유인 물질의 농도 기울기가 존재할 때, theta는 감소하고 x축 이동 거리는 증가해야 합니다. 이러한 변화는 정자가 화학 유인 물질이 있는 방향인 기울기 상단으로 헤엄치려는 선호도를 보인다는 것을 의미합니다. 이 두 가지 분석을 수행할 때, 정자와 화학 유인 물질을 각 장치에 적절하게 로딩하는 것이 정자의 화학 주성 성능에서 재현 가능한 농도 기울기를 얻는 데 매우 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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연구

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생물학

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